強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜抽薹相關(guān)基因SVP和SOC1的克隆與表達(dá)分析

王祺 蒲媛媛 趙玉紅 孫柏林 金姣姣 王萬鵬 牛早霞 劉麗君 馬驪 武軍艷 方彥 李學(xué)才 孫萬倉

摘要：甘藍(lán)型冬油菜（Brassica napus L.）的冬前抽薹對(duì)北方冬油菜生產(chǎn)是極為不利的。SVP（Short vegetative phase）和SOC1（Suppressor of overexpression of constans 1）是與甘藍(lán)型冬油菜抽薹及生長相關(guān)的同源基因，為揭示甘藍(lán)型冬油菜抽薹機(jī)制，以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10為試驗(yàn)材料，對(duì)SVP和SOC1克隆和表達(dá)情況進(jìn)行分析。核酸序列分析結(jié)果表明，強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜SVP和SOC1基因的開放閱讀框（ORF）長度分別為726 bp和642 bp，分別編碼241個(gè)和213個(gè)氨基酸;2個(gè)基因在進(jìn)化過程中高度保守，屬于MADS-box家族成員，編碼的蛋白質(zhì)均為α-螺旋和卷曲環(huán)組成的親水蛋白質(zhì)，通過對(duì)不同抗寒性材料SVP和SOC1氨基酸序列比較，分別發(fā)現(xiàn)了4個(gè)和9個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變。熒光定量（qPCR）分析結(jié)果表明，SVP基因在未抽薹植株葉中高表達(dá)，在抽薹未現(xiàn)蕾及抽薹現(xiàn)蕾植株葉中低表達(dá);SOC1基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與SVP基因相反，抽薹現(xiàn)蕾及成熟植株中的SOC1基因相對(duì)表達(dá)量較未抽薹植株高。由此推測(cè)SVP和SOC1基因可能參與甘藍(lán)型冬油菜抽薹及成花的調(diào)控，研究結(jié)果可為今后選育強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜晚抽薹抗寒品種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型冬油菜;抽薹;SVP基因;SOC1基因;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S332;Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）05-1088-10

Abstract：The pre-winter bolting of Brassica napus L. is extremely disadvantageous to the production of winter rape in North China.SVP （Short vegetative phase） and SOC1 （Suppressor of overexpression of constans 1） are the homologous genes related to bolting and growth in Brassica napus L.. In order to reveal the bolting mechanism of winter rape （Brassica napus L.）， strong winterness Brassica napus L. strains 16VHNTS158， 16VHNPZ269-1 and 16VHTS309-10 bred by Gansu Agricultural University were used as experimental materials to analyse the cloning and expression of SVP and SOC1. The results of nucleotide sequence analysis showed that the open reading frames （ORF） of SVP and SOC1 genes in winter type Brassica napus L. were 726 bp and 642 bp in length， encoding 241 and 213 amino acids respectively. The two genes belonging to MADS-box family are highly conserved in evolution， which encode hydrophilic proteins composed of α-helix and loop. By comparing the amino acid sequences of SVP and SOC1 in different cold-resistant materials， four and nine amino acid site mutations were found respectively. The results of quantitative real-time PCR （qRT-PCR） showed that SVP gene was highly expressed in the leaves of unbolting plants， but lowly expressed in the leaves of bolting plants and budding plants. The relative expression changes of SOC1 gene were opposite to SVP gene. The relative expression of SOC1 gene in budding plants and mature plants were higher than in unbolting plants. It is suggested that SVP and SOC1 gene may be involved in the regulation of bolting and flower formation in Brassica napus L.， the results of this study can provide theoretical basis for the breeding of cold-resistant and late bolting varieties of strong winterness Brassica napus L. in the future.

Key words：Brassica napus L.;bolting;SVP gene;SOC1 gene;gene expression

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）是中國重要的油料作物，其播種面積占油菜播種面積的90%左右[1]，但抗寒性差，在35°N左右地區(qū)難以越冬[2]。甘藍(lán)型油菜的生長發(fā)育特性不同于白菜型油菜，先抽薹、后現(xiàn)蕾，這種生長特性對(duì)抵御北方地區(qū)的嚴(yán)酷自然環(huán)境極為不利，極易遭受凍害的影響[3]。甘藍(lán)型冬油菜抽薹早晚與其抗寒性密切相關(guān)，蒲媛媛等[4]的研究結(jié)果表明，抗寒性強(qiáng)的甘藍(lán)型冬油菜在春播條件下不抽薹，春化率低，絕大部分植株只進(jìn)行營養(yǎng)生長;而抗寒性弱的材料，春化率較高，會(huì)出現(xiàn)抽薹、抽薹現(xiàn)蕾以及開花等處于不同生長發(fā)育階段的植株。因此，研究甘藍(lán)型冬油菜晚抽薹的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)甘藍(lán)型冬油菜的抗寒育種具有重要意義。SVP和SOC1都是MADS-box家族成員，SVP是重要的開花抑制基因，參與花分生組織的形成，并調(diào)節(jié)開花途徑中關(guān)鍵基因SOC1的表達(dá)，從而調(diào)控開花[5]。Hartmann等[6]研究發(fā)現(xiàn)，SVP 基因在擬南芥早花突變體的營養(yǎng)組織和花原基中表達(dá)，對(duì)抽薹開花具有抑制作用。Tang等[7]發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達(dá)LoSVP基因的轉(zhuǎn)基因植株較對(duì)照延遲6 d開花，說明LoSVP基因?qū)σ种茢M南芥開花具有重要作用。王世祥等[8]發(fā)現(xiàn)，隨著蘋果花芽的不斷分化，SVP表達(dá)量逐漸下調(diào)，表明 SVP基因可能抑制蘋果成花誘導(dǎo)。大麥SVP基因異位表達(dá)引起成花阻遏[9];水稻中SVP基因在營養(yǎng)生長階段穩(wěn)定表達(dá)，而在生殖生長階段表達(dá)量有不同程度的減少[10]。SOC1基因不僅調(diào)控開花時(shí)間和參與花器官形態(tài)建成[11-12]，也是光周期、春化途徑、自主途徑、赤霉素途徑等開花路徑的主要調(diào)控信號(hào)整合因子[13]。Heuer等[14]在玉米中克隆到SOC1的同源基因ZmMADS1，并證明該基因與開花相關(guān)。Shitsukawa等[15]在小麥中克隆到WSOC1，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達(dá)WSOC1基因提前了轉(zhuǎn)基因植株的開花時(shí)間。Zhong等[16]在大豆中克隆到擬南芥SOC1同源基因GmGAL1，發(fā)現(xiàn)其主要作用是作為開花途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與擬南芥中SOC1同源基因功能相似。SVP和SOC1對(duì)強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜生長發(fā)育的影響尚未見報(bào)道。本研究以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10為試驗(yàn)材料，研究SVP和SOC1對(duì)甘藍(lán)型冬油菜生長發(fā)育的影響，探究SVP和SOC1基因在甘藍(lán)型冬油菜抽薹、現(xiàn)蕾以及成花過程中的作用，為強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜晚抽薹抗寒品種選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10等3個(gè)不同抗寒性的強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜品系為參試材料（表1）。試驗(yàn)于2018年在甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)甘肅省油菜工程中心試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)點(diǎn)位于36°03′N、103°40′E，海拔2 150 m，最大凍土深度113 cm，最冷月平均氣溫-8.1 ℃，最冷月平均最低氣溫-14.6 ℃，極端最低氣溫-28.0 ℃[17]。2018年3月21日播種，行距20 cm，株距8～10 cm，小區(qū)面積4 m2，3次重復(fù)，于8月24日對(duì)3個(gè)冬油菜品系的植株生長發(fā)育狀態(tài)進(jìn)行調(diào)查取樣分析。

取樣：3個(gè)冬油菜品系小區(qū)內(nèi)的植株處于未抽薹、抽薹未現(xiàn)蕾、抽薹現(xiàn)蕾及結(jié)角成熟4種生長發(fā)育狀態(tài)。（1）對(duì)處于不同發(fā)育階段的植株葉片進(jìn)行取樣，包含未抽薹植株葉片、抽薹未現(xiàn)蕾植株葉片、抽薹現(xiàn)蕾植株葉片以及結(jié)角成熟植株葉片。（2）對(duì)植株的不同組織器官進(jìn)行取樣，對(duì)同一植株的葉、蕾、花3個(gè)組織部位分別進(jìn)行取樣。取樣后用液氮速凍，用于RNA提取和基因克隆等試驗(yàn)。

1.2甘藍(lán)型冬油菜葉、蕾及花的總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒DP419[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]提取步驟分別提取甘藍(lán)型冬油菜葉、花蕾及花的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性并用NanoPhotometer Pearl測(cè)定濃度。用PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，置于- 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SVP和SOC1基因的克隆

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中得到與甘藍(lán)型油菜相似性為100%，位于A09染色體上的SVP和位于C04染色體上的SOC1的CDS（編碼序列），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)SVP和SOC1基因的克隆引物（表2）。以16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10未抽薹植株葉片的cDNA為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行體外擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s;SVP基因退火溫度為55 ℃，退火15 s;SOC1基因退火溫度為58 ℃，退火15 s;72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用DNA凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit）對(duì)目的片段進(jìn)行切膠回收，與pMDTM19-T克隆載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)12 h，篩選藍(lán)白斑并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，最終挑選3個(gè)陽性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4基因的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DANMAN軟件對(duì)克隆基因進(jìn)行多重序列對(duì)比和氨基酸同源性分析，用NCBI的ORF finder分析氨基酸序列，利用Protparam在線軟件分析氨基酸理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)目、理論等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量[18]，利用ProtScale在線軟件分析蛋白質(zhì)的親水性和疏水性[19]，利用NCBI（Conserved Domain Search）分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，利用TMpred在線軟件分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)特性，利用SignalP 4.0 Server預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽，利用SOPMA在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[20]。

1.5基因的表達(dá)分析

試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量法（qPCR），分析SVP和SOC1在不同發(fā)育階段下甘藍(lán)型冬油菜植株葉片、花蕾及花中的相對(duì)表達(dá)量，基因相對(duì)表達(dá)量參照Pfaffl法[21]進(jìn)行計(jì)算。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物（表2）。根據(jù)TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（TaKaRa，大連）進(jìn)行qPCR試驗(yàn)，以 Actin為內(nèi)參基因[22]，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解程序：95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s。擴(kuò)增效率計(jì)算：將cDNA稀釋為50.000 ng/μl、25.000 ng/μl、12.500 ng/μl、6.250 ng/μl和3.125 ng/μl的質(zhì)量濃度后作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，利用Excel 2016繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，進(jìn)一步計(jì)算得到擴(kuò)增效率。

1.6數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、Origin 2018和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖。

2結(jié)果與分析

2.1甘藍(lán)型冬油菜SVP基因和SOC1基因的克隆

以16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10葉片的cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物并通過PCR分別獲得大小約為720 bp的SVP和640 bp的SOC1（圖1）。切膠回收后連接至pMDTM19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，菌液經(jīng)PCR鑒定后挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2甘藍(lán)型冬油菜SVP蛋白和SOC1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1SVP蛋白和SOC1蛋白的理化特性

2.2.1.1SVP蛋白的理化特性通過NCBI查詢SVP的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)該基因序列中含有大小為726 bp的完整開放閱讀框，編碼241個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。分別對(duì)從16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10克隆到的SVP基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化性質(zhì)分析，如表3所示，SVP蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。對(duì)克隆到的3個(gè)SVP基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親水性、信號(hào)肽、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)蛋白質(zhì)的分析結(jié)果一致，因此，接下來主要以16VHNTS158中克隆到的SVP基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。SVP蛋白具有13個(gè)親水區(qū)和7個(gè)疏水區(qū)，具有保守的MADS結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域，該蛋白質(zhì)氨基酸序列中不存在信號(hào)肽切割位點(diǎn)，但含有2個(gè)跨膜區(qū)域，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示， SVP蛋白主要由α-螺旋和卷曲環(huán)組成。

2.2.1.2SOC1蛋白的理化特性通過NCBI查詢SOC1的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)該基因序列中含有大小為642 bp的完整開放閱讀框，編碼213個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。分別對(duì)從16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10克隆到的SOC1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，如表4所示，SOC1蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。對(duì)克隆到的3個(gè)SOC1基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親水性、保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)蛋白質(zhì)的分析結(jié)果一致，因此，接下來主要以16VHNTS158中克隆到的SOC1基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。SOC1蛋白有13個(gè)親水區(qū)和7個(gè)疏水區(qū)，具有保守的MADS結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域，該蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽切割位點(diǎn)，無跨膜區(qū)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，SOC1蛋白主要由α-螺旋和卷曲環(huán)組成。

2.2.2SVP蛋白和SOC1蛋白氨基酸序列比對(duì)

2.2.2.1SVP蛋白氨基酸序列比對(duì)通過DNAMAN軟件對(duì)克隆到的SVP基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，16VHNTS158和16VHNPZ269-1的蛋白質(zhì)氨基酸序列相似性為100.00%，與16VHTS309-10的相似性為98.34%，比較16VHNTS158和16VHNPZ269-1與16VHTS309-10的SVP蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，存在4個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變。將克隆到的SVP基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中甘藍(lán)型油菜和擬南芥的SVP蛋白氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10與甘藍(lán)型油菜的相似性分別為99.59%、99.59%、97.93%，與擬南芥的相似性分別為92.12%、92.12%、91.29%（圖2）。

2.2.2.2SOC1蛋白氨基酸序列比對(duì)采用DNAMAN軟件對(duì)克隆到的SOC1基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，16VHNPZ269-1和16VHTS309-10的相似性為100.00%，與16VHNTS158的相似性為95.77%，比較16VHNPZ269-1和16VHTS309-10與16VHNTS158的SOC1蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，存在9個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變。將克隆到的SOC1基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中甘藍(lán)型油菜和擬南芥的SOC1蛋白氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10與甘藍(lán)型油菜的相似性分別為96.24%、99.53%、99.53%，與擬南芥的相似性分別為91.12%、94.39%、94.39%（圖3）。

2.2.3SVP蛋白和SOC1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2.3.1SVP蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹將SVP基因在16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10中所編碼的SVP蛋白氨基酸序列與甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)等8個(gè)物種的SVP蛋白同源氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），DNAMAN軟件分析結(jié)果顯示，16VHNTS158、16VHNPZ269-1與甘藍(lán)型油菜SVP基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列的相似性均為99.59%，與甘藍(lán)、蘿卜的相似性達(dá)到98.76%、97.93%，與煙草屬的相似性為54.36%。16VHTS309-10與甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、蘿卜的SVP蛋白氨基酸序列的相似性分別達(dá)到97.93%、98.76%、96.27%，與煙草屬的相似性為54.36%。由此推測(cè)SVP基因在16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10、甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)等十字花科植物中的功能相似，與煙草屬植物的功能差異較大。

4結(jié)論

本研究從甘藍(lán)型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10中克隆到SVP和SOC1基因，基因相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果表明，在強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜中，SVP基因在未抽薹植株中的表達(dá)量高于抽薹未現(xiàn)蕾及抽薹現(xiàn)蕾植株，SOC1基因在抽薹未現(xiàn)蕾及抽薹現(xiàn)蕾植株中的表達(dá)量高于未抽薹植株。由此推測(cè)SVP可能對(duì)未抽薹特性具有調(diào)控作用，SOC1在調(diào)控甘藍(lán)型冬油菜抽薹中的作用與SVP相反，具有負(fù)向調(diào)控作用。比較不同抗寒性材料SVP和SOC1核苷酸序列，分別發(fā)現(xiàn)了4個(gè)和9個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，而這些位點(diǎn)的突變是否改變了甘藍(lán)型冬油菜的抗寒性還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）