豬SUMO1基因的堿基序列特征及其在豬肺炎支原體感染過程中的表達(dá)

王麗 楊曉陽 曹靜 趙為民 涂楓 付言峰 李碧俠 陳哲 任守文 方曉敏

摘要：根據(jù)NCBI 上GenBank 的豬類泛素蛋白修飾分子1（SUMO1）基因堿基序列（NM_001112676.1），設(shè)計(jì)編碼區(qū)全長上、下游引物，成功克隆了豬SUMO1基因完整的編碼區(qū)序列。經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)豬SUMO1基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS） 全長306 bp，編碼101個(gè)氨基酸，SUMO1 的蛋白質(zhì)氨基酸序列在物種間高度保守。SUMO1基因在豬心、肝、脾、肺、腎、小腸及肌肉組織中均有表達(dá)，且在肺部表達(dá)較高。豬肺炎支原體感染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞后SUMO1的mRNA表達(dá)水平顯著升高。參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的基因，如TLR2、P65和RXRα均存在潛在的SUMO化修飾位點(diǎn)，并且豬肺炎支原體感染后它們的mRNA表達(dá)水平極顯著升高。

關(guān)鍵詞：豬肺炎支原體;SUMO1;豬肺泡巨噬細(xì)胞;炎癥反應(yīng)

中圖分類號(hào)：S858.286.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）05-1229-08

Abstract：The full-length upstream and downstream primers of SUMO1 （the gene of small ubiquitin-like modifier 1） were designed according to the base sequence of SUMO1 gene （NM_001112676.1） of GenBank on National Center for Biotechnology Information（NCBI） and the whole CDS（coding sequence） of porcine SUMO1 National Center for Biotechnology Information gene was cloned successfully. The results of bioinformatics software analysis showed that porcine SUMO1 gene-related protein CDS was 306 bp in length， encoded 101 amino acids and the amino acids sequence of SUMO1 protein was highly conserved among species. SUMO1 gene was expressed in porcine heart， liver， spleen， lung， kidney， small intestine and muscle， among which the relative expression of SUMO1 was higher in lung than in other tissues. After Mycoplasma hyopneumoniae infection， the mRNA expression level of SUMO1 was significantly increased in primary porcine alveolar macrophages. The potential SUMO modification sites were found in TLR2， P65 and RXRα genes， which participated in the regulation of inflammatory response. In addition， their mRNA expression levels were significantly up-regulated after Mycoplasma hyopneumoniae infection.

Key words：Mycoplasma hyopneumoniae;small ubiquitin-like modifier（SUMO1）;porcine alveolar macrophages;inflammatory response

豬支原體肺炎，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae， Mhp）感染引起的存在于各年齡段豬中的慢性接觸性呼吸道傳染病[1]。Mhp具免疫抑制和免疫逃避的特性，使該病難根治，需要長期消耗性的治療，并且容易繼發(fā)感染其他呼吸道相關(guān)病毒而造成死亡，是養(yǎng)豬業(yè)主要疫病之一[2-3]。近年來針對(duì)Mhp的致病機(jī)理和免疫防御等的研究取得了顯著進(jìn)展，但Mhp的耐藥菌不斷地出現(xiàn)，候選基因也不明確[4]，其致病的分子機(jī)制研究相對(duì)還很缺乏，特別是對(duì)宿主炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制以及如何誘導(dǎo)免疫抑制等問題尚未得到完全解析。

SUMO化修飾是一種高度動(dòng)態(tài)可逆的類泛素化修飾方式，通過與多種底物的供價(jià)結(jié)合發(fā)揮功能。哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)4種SUMO蛋白，即SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4，其中SUMO1與SUMO2和SUMO3的同源性只有50%左右[5]。SUMO化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)主要是利用生物信息學(xué)與氨基酸位點(diǎn)定向誘變和基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，蛋白質(zhì)中存在SUMO修飾的保守序列ψKXE/D（ψ為疏水性氨基酸，X為任意氨基酸），則其中的賴氨酸是可能的SUMO修飾位點(diǎn) [6]。SUMO蛋白可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或DNA之間的相互作用，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性;SUMO蛋白可以與泛素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合賴氨酸，從而維持靶蛋白的穩(wěn)定性;介導(dǎo)蛋白質(zhì)在核孔的穿梭，調(diào)節(jié)其在細(xì)胞中的定位[7-8]，從而參與各種各樣的生命活動(dòng)如細(xì)胞的增殖分化、基因的表達(dá)、細(xì)胞器的合成、細(xì)胞的凋亡等。

SUMO化修飾參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，宿主細(xì)胞被病毒感染后容易引起炎癥反應(yīng)，且其整體SUMO化修飾水平發(fā)生了明顯的變化。SUMO蛋白可以對(duì)病毒本身的蛋白質(zhì)或者宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，影響宿主細(xì)胞對(duì)病毒的防御能力 [8]。在乳腺癌細(xì)胞中SUMO1是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，SUMO連接酶TRIM38可以調(diào)節(jié)先天性免疫和炎癥反應(yīng)。NEMO被SUMO化修飾后可以加強(qiáng)NF-κB的活性，促進(jìn)NF-κB依賴性細(xì)胞因子的合成以及胰腺炎癥反應(yīng)[8]。但SUMO化修飾在豬肺炎支原體感染過程中的研究報(bào)道甚少。本研究克隆豬SUMO1基因的編碼區(qū)序列，對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢測(cè)SUMO1在豬組織中的表達(dá)譜，并利用豬肺炎支原體J株感染原代豬肺泡細(xì)胞，分析細(xì)胞中SUMO1的表達(dá)變化規(guī)律，并檢測(cè)炎癥因子及相關(guān)因子的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究類泛素化修飾在豬肺炎支原體感染中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株及主要試劑試驗(yàn)用豬肺炎支原體為J菌株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)，使用時(shí)菌株含量調(diào)整為1 ml 1×108CCU[9]。

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA marker、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T、預(yù)混PCR試劑盒和SYBR Green Real-time PCR Master Mix 定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，RNA提取和DNA回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，青鏈霉素和胎牛血清購自Thermo Fisher公司，RPMI-1640培養(yǎng)基與PBS緩沖液購自Hyclone公司。引物合成和測(cè)序均在擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.1.2試驗(yàn)組織樣品試驗(yàn)用豬心、肝、脾、肺、腎、小腸及肌肉樣品均采自南京六合屠宰場(chǎng)。

1.2方法

1.2.1原代豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)將豬肺臟取出后，用無菌繩子將氣管結(jié)扎，再用清洗液（含雙抗的PBS緩沖液）沖洗肺部表面，并用無菌紗布擦干。向氣管中注入清洗液，每次50～100 ml，并輕輕揉捏肺臟表面，回收灌洗液，并利用70 μm細(xì)胞過濾器去除組織塊狀雜質(zhì)，重復(fù)灌洗2～3次。在1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄掉上清液，利用清洗液重復(fù)洗滌3次，最后將獲得的豬肺泡巨噬細(xì)胞用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸后鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)1.5～2.0 h后從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，棄掉舊培養(yǎng)基，并利用清洗液潤洗2～3次后加入預(yù)熱的全新培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2豬肺炎支原體感染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞將豬肺炎支原體J株原液取出后置于離心管中，10 000 r/min離心20 min后棄上清液，再利用PBS懸浮后，10 000 r/min離心20 min后棄上清液，如此清洗1～2次后加入無雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮。將懸液加入鋪有原代豬肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行豬肺炎支原體感染，24 h后收集細(xì)胞樣品進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.3SUMO1基因的克隆根據(jù)NCBI 上GenBank 的豬SUMO1堿基序列（NM_001112676.1），設(shè)計(jì)編碼區(qū)全長上、下游引物（表1）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50 μl，包括：預(yù)混PCR反應(yīng)液25 μl，ddH2O 16 μl，上、下游引物各2 μl，cDNA模板 5 μl。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min后，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)（98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s），最后72 ℃ 10 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物參照DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行回收后，與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中。37 ℃搖菌1 h后，將渾濁的菌液涂在含有氨芐抗性的固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)，正置30 min后倒置12 h左右，隨機(jī)挑取3～5個(gè)克隆置于液體培養(yǎng)基中搖菌6～8 h，菌液渾濁后測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、質(zhì)粒提取和保存。

1.2.4半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)收集豬不同組織的樣品，提取RNA，濃度和質(zhì)量測(cè)定達(dá)標(biāo)后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用半定量PCR 檢測(cè)SUMO1在豬7種不同組織中的表達(dá)情況。利用表1中SUMO1定量引物和HPRT1內(nèi)參引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 反應(yīng)體系總體積為20.0 μl，包括：預(yù)混PCR反應(yīng)液10.0 μl，ddH2O 6.6 μl，上、下游引物各0.5 μl，cDNA 模板2.0 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），最后72 ℃ 10 min。利用Image J軟件分析瓊脂糖凝膠電泳得到的目的條帶的灰度值。

收集經(jīng)過豬肺炎支原體處理和未處理的豬肺泡巨噬細(xì)胞，提取RNA，濃度和質(zhì)量測(cè)定達(dá)標(biāo)后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用表1中目的基因的定量引物和HPRT1內(nèi)參引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)體系為20 μl，退火溫度為60 ℃，其他條件參照定量PCR 試劑盒說明書，將得到的Ct值采用2-△△Ct方法進(jìn)行分析。定量PCR中每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.2.5試驗(yàn)結(jié)果分析及預(yù)測(cè)軟件試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)的差異分析均利用SPSS17.0軟件進(jìn)行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用SUMOsp2.0進(jìn)行SUMO化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。豬SUMO1蛋白生物信息學(xué)分析軟件和網(wǎng)站參照趙為民等使用的分析軟件和網(wǎng)站[10]。

2結(jié)果與分析

2.1豬SUMO1基因編碼區(qū)的擴(kuò)增及克隆

提取豬肺臟組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SUMO1基因的編碼區(qū)全長序列。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖1所示，在大約500 bp附近有單一目的條帶，與預(yù)計(jì)片段大小516 bp基本相符。經(jīng)回收、雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、鋪板、挑菌、搖菌后進(jìn)行菌液測(cè)序驗(yàn)證，成功克隆了豬SUMO1基因的編碼區(qū)，全長為306 bp，起始和終止密碼子分別為ATG和TAG，其中G+C含量為24.6%。

2.2豬SUMO1的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

2.2.1SUMO1的氨基酸序列分析結(jié)果（表2）顯示：豬SUMO1由101個(gè)氨基酸組成，包含19種氨基酸。

2.2.2SUMO1的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)如圖2所示，豬SUMO1的氨基酸序列中存在磷酸化修飾的潛在位點(diǎn)。

2.2.3SUMO1的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析分別用NPS@SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)SUMO1的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3、表3）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）。結(jié)果顯示，無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈為SUMO1的二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)，占比達(dá)到91.08%，β-轉(zhuǎn)角占比較小，為8.91%。

SignalP 4.1和TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示， SUMO1沒有信號(hào)肽，也不存在跨膜結(jié)構(gòu)，這符合SUMO1作為修飾性非分泌小分子蛋白質(zhì)的特性。

2.2.4SUMO1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析在NCBI中查找了8 種代表性動(dòng)物的SUMO1氨基酸序列，比對(duì)分析結(jié)果（圖5）顯示，預(yù)測(cè)的豬SUMO1氨基酸序列（NP_001106146.1）與人（NP_001005781）、小鼠（NP_033486.1）、大鼠（NP_001009672.1） 、豬（NP_001106146.1）、牛（NP_001030535.1）、獼猴（NP_001182571.1）和狗（NP_001239192.1）的SUMO1氨基酸序列相似性均為100%，而與雞（NP_989466.1）的SUMO1氨基酸序列相似性也達(dá)到98%。系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）顯示，豬SUMO1蛋白在進(jìn)化中與其他6種哺乳動(dòng)物的SUMO1蛋白聚為一大類，而雞的SUMO1蛋白單獨(dú)為一類。

2.3SUMO1在豬不同組織中的表達(dá)譜

利用豬不同組織的cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果如圖7A所示，在 182 bp 處得到預(yù)期的單一SUMO1基因目的條帶，以及單一的內(nèi)參基因HPRT1條帶。對(duì)組織表達(dá)譜的各個(gè)條帶進(jìn)行灰度值分析后得到圖7B中的相對(duì)表達(dá)量，其中SUMO1在心、肝、脾、肺、腎、小腸及肌肉組織中均有表達(dá)，且在肺組織中表達(dá)量相對(duì)較高，推測(cè)其參與調(diào)控肺組織的生理功能。

2.4豬支原體肺炎感染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞后SUMO1的mRNA表達(dá)水平

利用豬支原體肺炎J株對(duì)原代豬肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行感染處理24 h后，檢測(cè)SUMO1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示豬肺炎支原體感染后SUMO1在原代豬肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高（圖8），表明SUMO1的修飾作用可能參與豬肺炎支原體的感染。

2.5調(diào)控炎癥反應(yīng)因子表達(dá)的上游調(diào)控基因SUMO化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)

在NCBI上查找到TLR2、NF-κB和RXRα的氨基酸序列，并利用SUMOsp 2.0軟件分析預(yù)測(cè)它們可能的SUMO化修飾位點(diǎn)。結(jié)果如表4所示，TLR2、NF-κB和RXRα均存在潛在的SUMO化修飾位點(diǎn)，并均含有經(jīng)典的SUMO修飾序列。

2.6豬支原體肺炎感染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞后相關(guān)調(diào)控基因的mRNA表達(dá)水平

豬肺炎支原體感染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞24 h后檢測(cè)相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示TLR2、P65和RXRα的mRNA表達(dá)水平均極顯著性上調(diào)（圖9）。

3討論

豬肺炎支原體感染機(jī)體會(huì)造成細(xì)支氣管和血管周圍的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞發(fā)生單核細(xì)胞浸潤，引起炎癥因子的表達(dá)和炎癥反應(yīng)[11-13]。將豬的免疫器官胸腺切除后，再接種豬肺炎支原體，其肺炎癥狀較未切除胸腺的豬輕，表明在豬支原體肺炎致病過程中免疫系統(tǒng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。本研究分離培養(yǎng)了原代豬肺泡巨噬細(xì)胞，利用豬肺炎支原體J株進(jìn)行感染，發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-6及IL-8的mRNA表達(dá)水平極顯著上調(diào)，說明豬肺炎支原體感染也會(huì)引起細(xì)胞水平的炎癥反應(yīng)。利用半定量PCR檢測(cè)了SUMO1在豬不同組織中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)SUMO1在豬心、肝、脾、肺、腎、小腸及肌肉中均有表達(dá)，且在肺部SUMO1的表達(dá)量較其他組織高，說明SUMO1可能參與調(diào)控肺組織的生理功能。

為了研究豬SUMO1在肺組織中的功能，本研究首先克隆了豬SUMO1基因的堿基序列，其次利用生物信息學(xué)分析軟件及網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析了其基本屬性。發(fā)現(xiàn)豬SUMO1基因的編碼區(qū)長為306 bp，可以編碼101個(gè)氨基酸。分析了8種不同物種，發(fā)現(xiàn)SUMO1蛋白氨基酸序列在它們中的相似度高達(dá)98%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示豬SUMO1蛋白與其他6種哺乳動(dòng)物的SUMO1蛋白聚為一類，而卵生動(dòng)物雞單獨(dú)為一類。這表明作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)分子，SUMO1氨基酸序列在物種間高度保守以保證其功能的保守。

機(jī)體的炎癥反應(yīng)受多種因子的調(diào)節(jié)，Toll樣受體家族成員在先天性和適應(yīng)性免疫引起的炎癥反應(yīng)中作為固有模式識(shí)別受體發(fā)揮著重要作用，其中TLR2的報(bào)道甚多，它可以激活先天性免疫反應(yīng)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[15-16]。在敲除TLR2后機(jī)體過敏性炎癥反應(yīng)會(huì)減輕[17]。TLR2可以調(diào)控NF-κB參與抗菌肽抵抗細(xì)菌對(duì)機(jī)體的侵襲，而NF-κB可以調(diào)控RXRα等核轉(zhuǎn)錄因子參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]。雖然TLR2、NF-κB和RXRα均參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)調(diào)控，但它們?cè)谪i肺炎支原體感染過程中的作用還不明確。本研究發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體感染后原代豬肺泡巨噬細(xì)胞中這些調(diào)控基因（TLR2、NF-κB和RXRα）的表達(dá)水平均顯著性上調(diào)。利用SUMOsp 2.0軟件預(yù)測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)這些調(diào)控因子均存在潛在的SUMO修飾位點(diǎn)。進(jìn)一步分離培養(yǎng)原代豬肺泡巨噬細(xì)胞后利用豬肺炎支原體感染，發(fā)現(xiàn)SUMO1的表達(dá)水平顯著升高，推測(cè)SUMO1在豬肺炎支原體感染過程中參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

SUMO化修飾能通過直接或間接的方式影響NF-κB和RXRα的功能。在肺癌細(xì)胞中SUMO1與NF-κB的表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，過表達(dá)SUMO1后NF-κB的表達(dá)水平顯著上調(diào)，干擾SUMO1后NF-κB的表達(dá)水平顯著下調(diào)[18]。這與乳腺癌細(xì)胞中去SUMO化蛋白SENP2可以抑制NF-κB的活化相符合[19]。利用LPS、IL-1β、TNFα誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí)，RXRα的K108殘基可以被SUMO化修飾，并影響其下游基因的表達(dá)，其中LPS和IL-1β處理細(xì)胞后能誘導(dǎo)RXRα被SUMO1蛋白修飾，而TNFα處理后可以誘導(dǎo)RXRα被SUMO1和SUMO2蛋白修飾[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)SUMO1與TLR2、NF-κB和RXRα的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，有待進(jìn)一步驗(yàn)證豬肺炎支原體感染過程中SUMO1通過調(diào)控TLR2、NF-κB和RXRα的功能參與調(diào)控豬肺炎支原體感染引起的炎癥反應(yīng)的推測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1]SIMIONATTO S， MARCHIORO S B， MAES D， et al. Mycoplasma hyopneumoniae： from disease to vaccine development [J]. Vet Microbiol， 2013， 165（3/4）： 234-42.

[2]邵國青，華利忠.混合感染背景下豬呼吸道病的免疫與控制[J].中國獸藥雜志，2012（46）：97-99.

[3]MAES D， SIBILA M， KUHNERT P， et al. Update on Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs： Knowledge gags for improved disease control [J]. Transbound Emerg Dis， 2018， 65（Sup 1）：110-124.

[4]OKAMURA T， ONODERA W， TAYAMA T， et al. A genome-wide scan for quantitative trait loci affecting respiratory disease and immune capacity in landrace pigs [J]. Animal Genetics， 2012， 43： 721-729.

[5]ENSERINK J M. Sumo and the cellular stress response [J]. Cell Div， 2015， 10：4.

[6]KLAUS S， PUCK K， EVERTVAN D， et al. SUMO Assay with peptide arrays on solid support： Insights into SUMO target sites [J]. The Journal of Biochemistry， 2008， 144（1）：39-49.

[7]WANG C， ZENG N， LIU S， et al. Interaction of porcine reproductive and respiratory syndrome virus proteins with SUMO-conjugating enzyme reveals the SUMOylation of nucleocapsid protein [J]. PLoS One， 2017， 12（12）：e0189191.

[8]YANG Y， HE Y， WANG X， et al. Protein SUMO ylation modification and its associations with disease [J]. Open Biol， 2017， 7（10）：170167.

[9]ZHOU X， LI X， WANG X， et al. Cecropin B represses CYP3A29 expression through activation of the TLR2/4-NF-κB/PXR signaling pathway [J]. Science Reports， 2016，14（6）：27876.

[10]趙為民，涂楓，方曉敏，等.豬PKM2基因的序列分析與組織表達(dá)及亞細(xì)胞定位[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，45（1）：8-77.

[11]方曉敏，趙為民，付言峰，等.豬支原體肺炎發(fā)生的品種敏感差異及分子基礎(chǔ)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（14）：2839-2847.

[12]郭蕓蕓，張雪寒，劉茂軍，等.豬肺炎支原體纖毛黏附因子P97和F7-CTB對(duì)O型口蹄疫滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（11）：204-210.

[13]趙為民，涂楓，王麗，等. 豬PKM2基因在肺炎支原體感染3D4/21細(xì)胞后的互作蛋白質(zhì)鑒定與分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019，35（6）：1381-1389.

[14]李彥偉，劉茂軍，武昱孜，等.豬肺炎支原體致病機(jī)理研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（8）：84-88.

[15]GOULOPOULOU S， MCCARTHY C G， WEBB R C. Toll-like receptors in the vascular system： sensing the dangers within [J]. Pharmacological Reviews， 2016， 68： 142-167.

[16]PAGE K， LIERL K M， HUGHES V S， et al. TLR2-mediated activation of neutrophils in response to German cockroach frass [J]. Journal of Immunology， 2008， 180： 6317-6324.

[17]LI X， CHEN Q， CHU C， et al. Ovalbumin-induced experimental allergic asthma is Toll-like receptor 2 dependent [J]. Allergy and Asthma Proceedings， 2014， 35： 15-20.

[18]KE C， ZHU K， SUN Y， et al. SUMO1 promotes the proliferation and invasion of non-small cell lung cancer cells by regulating NF-κB[J]. Thorac Cancer， 2019， 10（1）：33-40.

[19]GAO X， WU Y， QIAO L， et al. SENP2 suppresses NF-κB activation and sensitizes breast cancer cells to doxorubicin[J]. Eur J Pharmacol， 2019， 854（5）：179-186.

[20]REBECCA S， SAUL J. Inflammatory mediators increase SUMOylation of retinoid X receptor α in a c-Jun N- terminal kinase -dependent manner in human hepatocellular carcinoma cells [J]. Molecular Pharmacology， 2013， 84： 218-226.

（責(zé)任編輯：張震林）