3種瓣型茉莉基因組大小測(cè)定與比較

齊香玉　陳雙雙　馮景　王華娣　鄧衍明

摘要：茉莉具有較高的觀賞、茶用和藥用價(jià)值，但關(guān)于其基因組學(xué)的研究還相對(duì)匱乏。以單瓣、雙瓣和多瓣茉莉的嫩葉為材料，選用6種常用的細(xì)胞解離液，利用基因組大小已知的水稻（Oryza sativa）日本晴、玉米（Zea mays）B73和番茄（Lycopersicon. Esculentum L. Stupicke polni tyckove rane）為內(nèi)參，以建立適合于茉莉的流式細(xì)胞術(shù)基因組大小測(cè)定方法。結(jié)果表明，WPB細(xì)胞解離液對(duì)茉莉和內(nèi)標(biāo)解離效果最好，粒子清晰集中，無重疊峰且區(qū)分度良好;單瓣、雙瓣和多瓣茉莉的基因組1C DNA含量分別為0.809 5、0.804 5、0.592 6 pg;單瓣和雙瓣茉莉間的基因組大小無顯著性差異，但它們與多瓣茉莉的基因組大小有顯著性差異。本研究建立了流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定茉莉基因組大小的方法，同時(shí)測(cè)定了3種瓣型茉莉的基因組大小，為茉莉的基因組學(xué)及物種進(jìn)化研究提供參考。

關(guān)鍵詞：茉莉;基因組大小;流式細(xì)胞術(shù);細(xì)胞解離液

中圖分類號(hào)： S685.160.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0040-05

收稿日期：2019-11-25

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31772338）。

作者簡介：齊香玉（1986—），女，安徽桐城人，博士，助理研究員，主要從事觀賞植物遺傳育種與分子生物學(xué)研究。E-mail：409241891@qq.com。

通信作者：鄧衍明，博士，研究員，主要從事花卉遺傳育種與分子生物學(xué)研究。E-mail：nksdym@163.com。

基因組大?。ɑ蚍QC值）是指一個(gè)物種單倍體核的DNA含量，通常用質(zhì)量（pg）或核苷酸堿基對(duì)數(shù)目（Mb）表示，1 pg相當(dāng)于978 Mb[1]。迄今為止，植物DNA C值數(shù)據(jù)庫（plant DNA C-values database）已有12 273個(gè)物種的C值數(shù)據(jù)，其中包括10 770種被子植物、421種裸子植物、303種蕨類植物、334種苔蘚植物和445種藻類[2]?；蚪M反映了物種全部和特定的遺傳信息[3]。測(cè)定基因組大小可以預(yù)估物種的DNA含量，為植物的基因組學(xué)及其親緣進(jìn)化研究提供理論依據(jù)。目前，測(cè)定基因組大小的方法主要有Feulgen微光密度法[4]、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）[5]和基因組測(cè)序法[6]。FCM具有操作簡單、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于不同物種基因組大小的測(cè)定，如五節(jié)芒[7]、草莓[8]、槭屬植物[9]等，也常被用于物種倍性鑒定，如柴胡[10]、棗[11]、旱柳[12]、荔枝[13]等。

茉莉（Jasminum sambac）別稱茉莉花、茶葉花，屬木犀科（Oleaceae）素馨屬（Jasminum Linn.）常綠直立或攀援狀灌木。茉莉原產(chǎn)于印度及巴基斯坦等地，在1 700多年前的漢代傳入我國，最早在東南沿海地區(qū)栽培，然后逐漸北上直到長江流域，是“一路一帶”經(jīng)濟(jì)植物開發(fā)與應(yīng)用的重要成員之一[14]。茉莉具有較高的觀賞、茶用和藥用價(jià)值，歷來受到我國人民的喜愛，被譽(yù)為“花樹中的珍品” “天下第一香”[15]。茉莉品種較多，但根據(jù)花形結(jié)構(gòu)的不同，主要?jiǎng)澐譃閱伟?、雙瓣和多瓣茉莉3種類型[16]。不同瓣型茉莉在花朵大小和形態(tài)、香氣類型和產(chǎn)花量等觀賞和經(jīng)濟(jì)性狀上都存在差異。王湘平等對(duì)雙瓣茉莉的染色體數(shù)目和核型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，染色體數(shù)目為2n=2X=26，染色體核型公式為2n=2X=8 m+16 sm+2 sm（SAT），核型為3B類型[17]。然而，關(guān)于茉莉基因組大小的研究尚未見報(bào)道，有關(guān)茉莉分子生物學(xué)的研究還相對(duì)滯后。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的降低，開展茉莉的全基因組測(cè)序成為可能。對(duì)物種的基因組大小進(jìn)行預(yù)估，能為測(cè)序成本預(yù)算及組裝策略研究提供重要的理論依據(jù)。因此，本試驗(yàn)擬用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)單瓣、雙瓣和多瓣茉莉的基因組大小進(jìn)行測(cè)定分析，旨在為后期開展茉莉的基因組學(xué)及種群進(jìn)化研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的3種瓣型（單瓣、雙瓣和多瓣）茉莉的嫩葉均采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茉莉種質(zhì)資源圃。試驗(yàn)作為內(nèi)標(biāo)的水稻日本晴（Oryza sativa L. subsp. japonica Nippobare）由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所張亞東研究員提供，玉米（Zea mays）B73由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院李盛本教授提供，番茄（Lycopersicon? esculentum L. Stupicke polni tyckove rane）由捷克共和國實(shí)驗(yàn)植物學(xué)研究所（奧洛摩茨）Jaroslav Dolezel教授提供。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

試驗(yàn)使用的儀器是美國Becton-Dickinson（BD）公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀。熒光染料碘化丙啶（PI）、孔徑37 μm的尼龍濾膜、鞘液、培養(yǎng)皿、EP管、刀片等購自南京博巧生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞解離液的選擇

為獲得適合茉莉的最佳細(xì)胞解離液，分別對(duì)Otto、Gal、WPB、GPB、LBO1、Tris-MgCl2等多種解離液進(jìn)行逐一嘗試。

1.3.2 細(xì)胞核懸液的制備

取3種瓣型茉莉的新鮮嫩葉，用去離子水洗去表面的灰塵，濾紙吸干后，各稱取3份，每份約0.5 g，分別放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，加入1 mL預(yù)冷的細(xì)胞解離液，用鋒利的刀片上下快速切碎，過程中保證樣品浸沒在解離液中。吸取培養(yǎng)皿中的解離液，用37 μm濾膜過濾到 1.5 mL 離心管中，然后置于冰上孵育5 min，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，并將離心管倒置在濾紙上使殘余的液體自然流干，收集沉淀的細(xì)胞，再加入 500 μL 預(yù)冷解離液。采用同樣的方法獲得水稻、玉米和番茄幼嫩葉片的細(xì)胞核懸液。

1.3.3 DNA特異性染色

將單瓣茉莉和雙瓣茉莉細(xì)胞核懸液分別與水稻和玉米細(xì)胞核懸液混勻，多瓣茉莉分別與水稻和番茄細(xì)胞核懸液混勻，獲得混合細(xì)胞核懸液。向制備好的混合細(xì)胞核懸液中同時(shí)加入RNAase A至終濃度為50 μg/mL和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液至終濃度為 100 μg/mL，置于冰上，避光染色20 min。

1.3.4 基因組大小的測(cè)定和計(jì)算

樣品檢測(cè)前，對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行預(yù)熱30 min。采用488 nm的藍(lán)光激發(fā)，收集670/30通道的熒光，檢測(cè)PI的發(fā)射熒光強(qiáng)度。每個(gè)樣品在檢測(cè)時(shí)低速收集10000個(gè)細(xì)胞，變異系數(shù)（CV）控制在5%以內(nèi)，且每個(gè)樣品3次重復(fù)。使用流式細(xì)胞儀自帶的FACSTM軟件100650分析數(shù)據(jù)，待測(cè)樣本核DNA含量計(jì)算公式如下：

待測(cè)樣本核DNA含量=對(duì)照樣本核DNA含量×待測(cè)樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度對(duì)照樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞解離液的選擇

不同裂解液對(duì)不同植物的解離效果不同[7，9，11]。為探索茉莉細(xì)胞最適合的裂解液，此次研究利用流式細(xì)胞儀逐一對(duì)6種常用的解離液（Otto、Gal、WPB、GPB、LBO1、Tris-MgCl2）進(jìn)行比較。最終篩選出WPB解離液，其對(duì)茉莉和內(nèi)標(biāo)的解離效果最好，變異系數(shù)（CV）值控制在5%以內(nèi)。由圖1可知，茉莉與內(nèi)標(biāo)的粒子清晰集中，混合樣品的粒子團(tuán)能同時(shí)被檢測(cè)到。由圖2可知，獲得的峰圖清晰，雜峰較少、無重疊峰且區(qū)分度良好。因而保證了用基因組大小已知的水稻、玉米和番茄作為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定茉莉基因組大小的合理性及準(zhǔn)確性。

2.2 基因組大小的測(cè)定結(jié)果

PI是一種熒光染料，能夠均勻嵌入到雙鏈DNA的堿基對(duì)中，其嵌入量與DNA含量成正比，因此可以用相對(duì)熒光強(qiáng)度表示DNA相對(duì)含量。比較單瓣、雙瓣、多瓣茉莉及內(nèi)標(biāo)的嫩葉單獨(dú)制樣上機(jī)檢測(cè)結(jié)果，基于基因組相差倍數(shù)盡量小于2倍的原則，確定以水稻日本晴、玉米B73作為內(nèi)標(biāo)，分別測(cè)定單瓣茉莉（圖2-A1和圖2-A2）和雙瓣茉莉（圖2-B1和圖2-B2）的基因組大小;以水稻日本晴、番茄Stupicke polni tyckove rane作為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定多瓣茉莉（圖2-C1和圖2-C2）的基因組大小。已有研究中，水稻日本晴的2C DNA含量為0.88 pg，玉米B73的2C DNA含量為4.91 pg，番茄Stupicke polni tyckove rane的2C DNA含量為1.96 pg。根據(jù)混合樣品的PI發(fā)射熒光強(qiáng)度，比較茉莉與內(nèi)標(biāo)樣本峰值的倍數(shù)關(guān)系，3次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算出單瓣茉莉的基因組1C DNA含量為0.809 5 pg，雙瓣茉莉的基因組1C DNA含量為0.804 5 pg，多瓣茉莉的基因組1C DNA含量為0.592 6 pg（表1）。從表1可以看出，同一瓣型茉莉用2個(gè)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)，測(cè)得的基因組大小無顯著性差異;單瓣茉莉和雙瓣茉莉基因組大小無顯著性差異，但多瓣茉莉與單瓣、雙瓣茉莉基因組大小均有顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

目前評(píng)估基因組大小的方法較多，其中流式細(xì)胞術(shù)因操作簡單、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已成為物種基因組大小測(cè)定[7-10]和物種倍性鑒定[11-13]的重要技術(shù)方法。茉莉不僅具有較高的觀賞價(jià)值，還具有較高的茶用和藥用價(jià)值，市場前景廣闊。此前，并沒有茉莉基因組大小的研究。木犀科其他物種基因組大小已有報(bào)道，如樊慧杰等利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了連翹屬植物連翹的基因組大小為0.74 Gb[18]。Suda等利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了濃香茉莉（Jasminum odoratissimum）的基因組大小為1.44 pg[19]。然而，不同物種的基因組大小存在很大差異[3]，不同物種的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定條件不同[11-13]，所以對(duì)于茉莉基因組大小的測(cè)定，要對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行探索。

不同植物的葉片結(jié)構(gòu)和次生代謝物組成均不相同，可見材料的選擇、細(xì)胞核的提取及染色時(shí)間是流式細(xì)胞術(shù)的關(guān)鍵步驟[3]。本研究選取新鮮幼嫩葉片，取樣后立即制樣。通過對(duì)6種不同解離液的篩選，最終篩選出WPB解離液，其對(duì)茉莉和內(nèi)標(biāo)的解離效果最好，CV值控制在5%以內(nèi)，粒子清晰集中，獲得的峰圖清晰，雜峰較少，無重疊峰且區(qū)分度良好，保證了結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。木本植物細(xì)胞核中含有單寧酸，單寧酸會(huì)干擾熒光染色的酚類化合物，對(duì)Gal和LBO1裂解液產(chǎn)生負(fù)面影響，故Gal和LBO1裂解液不適合用于木本植物細(xì)胞核懸液的提取[20]，與本研究的試驗(yàn)結(jié)果一致。

內(nèi)標(biāo)樣品的選擇是流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果可靠準(zhǔn)確的關(guān)鍵因素。本研究采用已知基因組的水稻日本晴和玉米B73或水稻日本晴和番茄作為雙內(nèi)標(biāo)對(duì)單瓣、雙瓣和多瓣茉莉進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果顯示，茉莉與內(nèi)標(biāo)間的峰區(qū)分度良好、無重疊，且DNA含量的CV值均控制在5.0%以內(nèi)[3]，可確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，本試驗(yàn)結(jié)果可靠穩(wěn)定。

Bennett等對(duì)24種被子植物種內(nèi)DNA含量變化的研究發(fā)現(xiàn)，種內(nèi)DNA含量變化是很普遍的現(xiàn)象，種內(nèi)DNA含量變化在4%～28%之間[21]。鄧果特等采用流式細(xì)胞儀測(cè)定來自不同地區(qū)五節(jié)芒的基因組大小發(fā)現(xiàn)，湖南省郴州市、湖北省紅安縣和江西省修水縣采集的五節(jié)芒基因組大小間無顯著性差異，廣東省連山壯族瑤族自治縣、江蘇省連云港市和福建省永安市采集的五節(jié)芒基因組大小間無顯著性差異，但它們兩者之間有顯著性差異，說明五節(jié)芒存在種內(nèi)DNA含量變異[7]。本研究同時(shí)測(cè)定的3個(gè)瓣型茉莉基因組大小中，單瓣茉莉基因組大?。?.809 5 pg）和雙瓣茉莉基因組大小（0.804 5 pg）無顯著性差異，但它們與多瓣茉莉基因組大?。?592 6 pg）之間存在顯著性差異，這與上述研究結(jié)果吻合。造成多瓣茉莉與單瓣和雙瓣茉莉間基因組大小存在顯著性差異的原因可能很多，如染色體的多倍化、B染色體、非整倍體、染色質(zhì)變異及基因重復(fù)與丟失等，這些都可能會(huì)對(duì)DNA含量的種內(nèi)變異有一定的作用[22]。此外，植物基因組DNA含量會(huì)被某種特定的選擇力影響，如緯度、氣候、海拔及地區(qū)差異都有可能造成DNA含量的變異[23-24]。具體是何原因?qū)е萝岳蚍N內(nèi)DNA含量變異，還需進(jìn)一步研究。

總之，本研究首次建立了流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定茉莉基因組大小的方法，并測(cè)定了3種不同瓣型茉莉的基因組大小，豐富了茉莉的生物學(xué)信息，為茉莉的基因組學(xué)及系統(tǒng)進(jìn)化等研究奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

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