基于焦磷酸測(cè)序分析技術(shù)的金銀花摻偽鑒別方法研究

徐石勇,趙新,張富麗,劉征輝,史清洪,宋君,王永,蘭青闊*

1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 天津 300381； 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心, 成都 610066； 3.天津大學(xué), 天津 300072

金銀花為忍冬科(caprifoliaceae)植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或初開(kāi)的花，又名忍冬，是常用大宗中藥材[1]，藥用價(jià)值較高，具有清熱解毒、宣散風(fēng)熱等功效[2-3]，常用于各種熱性病，如身熱、發(fā)疹、發(fā)斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛[4]等癥。近年來(lái),由禽流感、甲型流感、非典、手足口病、新型冠狀病毒[5-6]等病毒性疾病引起的全球季節(jié)性傳染病爆發(fā)頻繁。雖然金銀花的開(kāi)發(fā)利用獲得了突破性進(jìn)展，但優(yōu)良品種相對(duì)較少，各地栽培品種各不相同，品種比較混雜，同物異名、同名異物的現(xiàn)象在不同地區(qū)時(shí)有發(fā)生[7-8]。于是一些不法商人便將價(jià)格便宜近10倍的紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand-Mazz.)、華南忍冬(LoniceraconfuseDC.)、黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)等山銀花(LoniceraeFlos)當(dāng)做正品的金銀花銷(xiāo)售并使用[9-10]。為了確保臨床療效安全和消費(fèi)者的權(quán)益，目前亟需建立科學(xué)性強(qiáng)、精準(zhǔn)度高、實(shí)用方便的金銀花摻偽鑒別方法。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)(pyrosequencing)是應(yīng)用于DNA序列分析的新一代檢測(cè)技術(shù)，是目前少數(shù)能進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量分析InDel/SNP標(biāo)記等短片段變異的新型技術(shù)[11-12]。該技術(shù)先對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序[13]。在測(cè)序體系中，通過(guò)檢測(cè)光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定InDel/SNP不同基因型含量的目的。

本文基于SNP標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合焦磷酸測(cè)序分型分析技術(shù)，期望建立精準(zhǔn)度高、通量大、便于應(yīng)用的金銀花摻偽量的檢測(cè)方法，能夠在短時(shí)間內(nèi)完成金銀花真?zhèn)渭皳絺瘟康蔫b定工作，為現(xiàn)代中藥摻偽鑒定開(kāi)辟新的檢測(cè)技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金銀花及其常見(jiàn)的偽品華南忍冬、黃褐毛忍冬、灰氈毛忍冬、紅腺忍冬等山銀花標(biāo)準(zhǔn)品，均由天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司提供，研磨后提取DNA。

從河南、河北、山東等金銀花主栽地區(qū)獲得50份樣品見(jiàn)表1，市場(chǎng)銷(xiāo)售的含有金銀花(或山銀花)成分的15份中成藥見(jiàn)表2。

表1 金銀花主栽地區(qū)的50份樣品情況Table 1 The 50 dominant variety of honeysuckle in the main planting area

續(xù)表序號(hào)品種來(lái)源加工方法外觀A43金銀花巨鹿縣市場(chǎng)——A41金銀花巨鹿縣市場(chǎng)——A44金銀花巨鹿縣市場(chǎng)——A45金銀花巨鹿縣市場(chǎng)——A46金銀花平邑縣市場(chǎng)——A47金銀花平邑縣市場(chǎng)——A48金銀花封丘縣市場(chǎng)——A49金銀花封丘縣市場(chǎng)——A50金銀花封丘縣市場(chǎng)——

表2 15份市售含有金銀花(或山銀花)成分的中成藥Table 2 15 commercial TCM containing honeysuckle or Lonicerae Flos natural ingredients

1.2 試劑與儀器

CTAB、Tris-HCl購(gòu)自Sigma公司；Na2EDTA購(gòu)自SbaseBio公司；DL 2000 DNA Marker、20 bp DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；GoTaq? Master Mix溶液購(gòu)自Promega公司；樹(shù)脂型基因組DNA提純?cè)噭┖匈?gòu)自賽百盛公司；Sepharose Bead購(gòu)自Biotage公司；氯化鈉、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、冰乙酸均為國(guó)產(chǎn)分析純；引物由上海生工生物公司合成。

焦磷酸測(cè)序儀(Biotage PyroMark ID)；PCR儀(伯樂(lè)CFX96)；凝膠成像系統(tǒng)(伯樂(lè)C150)；電熱恒溫水浴鍋(NESLAB EX-111)；高速離心機(jī)(Thermo LEGND MICRO 21R)；水平電泳儀(伯樂(lè)Powed PAC200)；微量分光光度計(jì)(Nanodrop ND-1000)；生物粉碎儀(Retsch MM400)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1基因組DNA提取 選取金銀花樣品的完整花蕾，使用生物粉碎儀進(jìn)行充分研磨，加入CTAB裂解緩沖液(20 g·L-1CTAB，1.4 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1Na2EDTA)500 μL，65℃進(jìn)行恒溫水浴裂解30 min，后續(xù)DNA提取純化用樹(shù)脂型基因組DNA提純?cè)噭┖羞M(jìn)行操作。DNA提取后濃度統(tǒng)一稀釋至(50±1)ng·μL-1。

1.3.2SNP位點(diǎn)引物設(shè)計(jì) 對(duì)金銀花及其常見(jiàn)偽品的相關(guān)序列進(jìn)行對(duì)比分析，在34、95、110、120、194、568、579、584、599、610、628、633、756、920、929處共15個(gè)候選SNP位點(diǎn)，其中633處SNP(A/C)位點(diǎn)能夠區(qū)分金銀花及其偽品(圖1)。

圖1 忍冬屬候選SNP位點(diǎn)部分分析結(jié)果Fig.1 The analysis results of honeysuckle candidate SNP site

依據(jù)前面挖掘的SNP差異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)出2條PCR擴(kuò)增特異性引物和1條焦磷酸測(cè)序引物，引物由上海生物工程公司合成(表3)。

表3 本研究用到的引物序列Table 3 Primer sequence used in this study

1.3.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 擴(kuò)增反應(yīng)體系為(50 μL)：2×GoTaq? Master Mix25 μL，10 μmol·L-1引物各1 μL，模板DNA 2 μL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)50次；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.3.4測(cè)序反應(yīng)體系及結(jié)果分析 測(cè)序反應(yīng)的總體積為100 μL，包括PCR產(chǎn)物50 μL，Sepharose Beads 3 μL，Binding Buffer(10 mmol·L-1Tris-HCl，2 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.1% Tween20，pH 7.6)47 μL，10 μmol·L-1測(cè)序引物1.2 μL，Annealing Buffer(20 mmol·L-1Tris-AC，2 mmol·L-1MgAc2，pH 7.6)38.8 μL；測(cè)序時(shí)間8～10 min。

測(cè)序完成后使用“SNP”模式對(duì)標(biāo)志性核酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，通過(guò)觀察第2個(gè)測(cè)序堿基“T”和第3個(gè)測(cè)序堿基“G”的光信號(hào)，系統(tǒng)自動(dòng)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行分型，其中 “G/G”代表樣品為金銀花正品，“T/T”代表樣品為金銀花偽品。

測(cè)序完成后使用“AQ”模式對(duì)標(biāo)志性核酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，通過(guò)觀察第2個(gè)測(cè)序堿基“T”和第3個(gè)測(cè)序堿基“G”的等位基因頻率判定測(cè)試樣品中金銀花含量中的摻偽量，其中“T”堿基頻率為樣品中金銀花偽品的含量，“G”堿基頻率為樣品中金銀花正品的含量，“T”和“G”百分含量的和為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花與山銀花標(biāo)準(zhǔn)品PCR結(jié)果

用金銀花和山銀花標(biāo)準(zhǔn)品的基因組DNA為模板，對(duì)差異性SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖2)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶大小一致，與預(yù)期大小相符，電泳條帶單一、清晰、明亮且沒(méi)有二聚體產(chǎn)生，說(shuō)明設(shè)計(jì)的PCR引物位點(diǎn)和擴(kuò)增效率較好，模板和PCR體系正常。其中，A1-A16均有擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶清晰明亮，說(shuō)明PCR引物位點(diǎn)和主產(chǎn)區(qū)金銀花SNP位點(diǎn)擴(kuò)增效率較好；B1-B15中有的沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物或是條帶模糊，說(shuō)明差異性SNP位點(diǎn)沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)。

2.2 金銀花與山銀花標(biāo)準(zhǔn)品SNP差異性位點(diǎn)焦磷酸測(cè)序分析

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)定量測(cè)定引物延伸副產(chǎn)物焦磷酸鹽(PPi)的測(cè)序技術(shù)。產(chǎn)生的光信號(hào)強(qiáng)度與聚合的測(cè)序模板量和堿基數(shù)成正比，依據(jù)加入的dNTP類(lèi)型和測(cè)得的光信號(hào)強(qiáng)度就可以實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。以金銀花及山銀花標(biāo)準(zhǔn)品的基因組DNA為模板，對(duì)差異性SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序分析，短柱形代表一個(gè)光信號(hào)，表明此處有一個(gè)對(duì)應(yīng)的堿基，長(zhǎng)柱形代表有兩個(gè)相同的光信號(hào)，表明此處有兩個(gè)相對(duì)應(yīng)的堿基，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，金銀花真品的核酸序列為5’-TGGAACCGCT-3’，分型為G/G，而山銀花的核酸序列為5’-TTGAACCGCT-3’，分型為T(mén)/T，金銀花偽品(50%)的核酸序列為5’-TT/GGAACCGCT-3’，分型為G/T。第1位堿基C和第4位堿基T為陰性質(zhì)控位點(diǎn)。

圖3 金銀花與山銀花SNP差異性位點(diǎn)焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.3 Schematic results of pyrosequencing on SNP differential loci of honeysuckle and Flos lonicerae

焦磷酸測(cè)序通過(guò)CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低和相匹配的堿基數(shù)成正比，這樣就可以實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列，金銀花、山銀花(金銀花偽品)及金銀花摻偽品(50%)擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4。

取部分產(chǎn)地及市場(chǎng)采購(gòu)金銀花和市場(chǎng)采購(gòu)含有金銀花中成藥擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，同時(shí)可準(zhǔn)備96個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物，放入焦磷酸測(cè)序儀的96孔板中進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，其測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖5。有3個(gè)T/T型金銀花偽品，2個(gè)G/T型金銀花摻偽品(50%)，其余均為G/G型金銀花真品。

圖5 部分樣品的焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.5 The pyrosequencing result of the part of sample

注：標(biāo)注A1-A16為主產(chǎn)區(qū)采集的花組織DNA提取結(jié)果, 標(biāo)注B1-B15的為市場(chǎng)采集的中成藥DNA提取結(jié)果。圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖譜Fig.2 Electrophoretic analysis of PCR

A:金銀花真品擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序結(jié)果; B:金銀花偽品擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序結(jié)果; C:金銀花摻偽品(50%)擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.4 Pyrosequencing results for PCR products

2.3 金銀花摻偽量檢測(cè)

用金銀花和山銀花的標(biāo)準(zhǔn)品按照1∶1比例進(jìn)行充分混合，然后提取基因組DNA作為模板，對(duì)差異性SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序分析,結(jié)果見(jiàn)圖6。混合樣品的核酸序列為5’-TT/GGAACCGCT-3’，分型為等位基因頻率為“T”和“G”各為50.0%。通過(guò)對(duì)15份市場(chǎng)銷(xiāo)售的含有金銀花(或山銀花)成分的中成藥進(jìn)行PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序，得到部分中成藥成分的焦磷酸測(cè)序結(jié)果(表4)。中成藥中部分中成藥焦磷酸測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖7，其中T%代表山銀花的含量，G%代表金銀花的含量。

圖6 金銀花摻偽品(50%)擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果Fig.6 Pyrosequencing results for honeysuckle falsify (50%)

圖7 部分中成藥焦磷酸測(cè)序圖Fig.7 Pyrosequencing diagram for TCM

表4 部分中成藥焦磷酸測(cè)序結(jié)果Table 4 Pyrosequencing results of TCM

3 討論

3.1 焦磷酸測(cè)序技術(shù)較其他檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)

我國(guó)藥用植物種類(lèi)繁多，基源也比較復(fù)雜，基于目前形態(tài)學(xué)標(biāo)記的性狀鑒定和顯微鑒定都難以滿(mǎn)足快速、精準(zhǔn)的需求，鑒定結(jié)果的可靠性較差并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，理化鑒定主要是以中藥中的有效成分為鑒別對(duì)象，主要有色譜鑒別和光譜鑒別等[14]方法，雖能辨明中藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，但對(duì)于摻雜現(xiàn)象鑒定效果不佳[15]。依賴(lài)于PCR 技術(shù)的檢測(cè)方法主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)[16]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)、特定序列擴(kuò)增(SCAR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-RFLP)[17-18]、等位基因特異性PCR(AS-PCR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)及DNA條形碼等[19]，但RFLP、RAPD、AFLP等第一、二代標(biāo)記技術(shù)位點(diǎn)開(kāi)發(fā)難度較大、重復(fù)性較差，不易在實(shí)踐中得到大規(guī)模應(yīng)用[20]。SSR技術(shù)開(kāi)發(fā)成本低且多態(tài)性、重復(fù)性較好，但單個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性明顯不足。本方法的金銀花成分摻偽量檢測(cè)方法是利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，結(jié)合SNP位點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)建立的檢測(cè)方法。該方法兼有PCR技術(shù)的靈敏性和測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性，而且測(cè)序平臺(tái)一次可檢測(cè)96個(gè)樣本，能夠與96孔PCR板無(wú)縫結(jié)合，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單[21]，在遺傳分析中，提供核酸序列信息的分子檢測(cè)技術(shù)也是“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，而色譜分析法多數(shù)情況下須在高溫環(huán)境下進(jìn)行，若待分析產(chǎn)物不能被氣化，則不能用色譜法進(jìn)行分析，在應(yīng)用的范圍方面受到一定的限制。

3.2 焦磷酸測(cè)序技術(shù)可準(zhǔn)確讀出金銀花摻偽量

該方法是以焦磷酸測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)差異性SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序分析，其中金銀花真品的核酸序列為5′-TGGAACCGCT-3′，分型為G/G，山銀花的核酸序列為5′-TTGAACCGCT-3′，分型為T(mén)/T，在SNP(A/C)位點(diǎn)上分析具有很高的準(zhǔn)確性。在測(cè)量短DNA鏈序列方面，是目前唯一能夠?qū)崟r(shí)得到定量序列結(jié)果的分析技術(shù)，兼有PCR技術(shù)的靈敏性和焦磷酸測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性，具有重復(fù)性好、自動(dòng)化程度較高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，在3 h之內(nèi)即可完成金銀花成分中摻偽量的檢測(cè)工作，鑒定結(jié)果可以從光信號(hào)的峰值直接讀出。