普通牛及其近緣種特異性序列篩選及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法

瞿展,賈犇,楊立桃

上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 上海 200240

目前，市場上肉制品往往良莠不齊，“摻假肉”事件頻頻曝光，如2011年的“牛肉膏”事件(一種名為牛肉膏的添加劑可以讓低價豬肉變?yōu)楦邇r“牛肉”)，不僅損害了消費者的利益，也帶來了食品安全風(fēng)險[1-2]。牛肉是除豬肉外在我國肉類消費中占比較大的品種。由于牛肉具有比豬肉蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低等優(yōu)點，同時受到國外以牛肉為主的肉類飲食習(xí)慣的影響，牛肉越來越被消費者所青睞，人均消費量逐漸上升，牛肉進(jìn)出口量也呈現(xiàn)增長趨勢[3]。因此，建立快速、可靠的肉制品中牛源性成分的檢測方法，對于保障肉制品成分真實性和食品安全具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，食品中動物源性成分的檢測方法不斷被建立，并被應(yīng)用于食品安全檢測。目前，食品中動物源性成分的檢測方法主要基于蛋白質(zhì)和核酸2個水平。蛋白質(zhì)水平的檢測方法包括基礎(chǔ)電泳分析法、免疫分析法、色譜分析法等；核酸水平的檢測方法包括常規(guī)PCR[4-5]、實時熒光定量PCR[6-7]、數(shù)字PCR[8-10]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)[11]和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)[12]等。然而，肉制品上市前一般都會經(jīng)過一些特殊的物理或化學(xué)處理，肉制品中的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)已發(fā)生變化，導(dǎo)致基于蛋白質(zhì)水平的檢測方法適用范圍窄、可靠性低且檢測靈敏度不高，無法滿足相應(yīng)的檢測要求。由于DNA具有高度保守性和熱穩(wěn)定性，在肉制品加工過程中不易遭到破壞，且DNA可以在體外進(jìn)行穩(wěn)定富集、擴(kuò)增和識別，故基于DNA的檢測方法具有特異性好、靈敏度高、成本低等優(yōu)勢，已成為動物源性成分鑒定中最常用的方法。如基于豬線粒體控制區(qū)(D-loop區(qū))序列，建立了豬肉成分的PCR檢測方法[13]；基于羊的環(huán)磷鳥苷磷酸二酯酶基因序列，建立了羊肉成分的熒光定量實時PCR檢測方法[14]；基于中國家鵝的單拷貝核基因序列，建立了鵝源性成分的數(shù)字PCR檢測方法[15]。

但由于常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR和數(shù)字PCR等方法的試劑和儀器成本較高，難以進(jìn)行現(xiàn)場的快速檢測。由日本學(xué)者Notomi等[16]研發(fā)的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)，針對目的基因的6個區(qū)域設(shè)計4條引物，提高了檢測特異性。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物為大小不同的莖環(huán)狀DNA片段混合物，可以通過常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，出現(xiàn)典型的梯型條帶即為陽性擴(kuò)增；也可在產(chǎn)物中加入熒光染料SYBR GreenⅠ，直接肉眼觀察顏色是否由橙色變?yōu)榫G色，以此判斷反應(yīng)結(jié)果，無需昂貴的試劑和專業(yè)設(shè)備[17]。LAMP技術(shù)具有擴(kuò)增產(chǎn)物多、時間短、反應(yīng)恒溫以及成本低等優(yōu)點。目前，在肉制品成分檢測領(lǐng)域，已經(jīng)建立了豬[18-19]、馬[20]、雞[21]、鴨[21]、狐貍[22]等成分的LAMP檢測方法?；诖?，本研究以普通牛及其近緣種為研究對象，利用普通牛及其近緣種的保守性DNA序列設(shè)計LAMP擴(kuò)增特異性引物，建立肉制品中普通牛及其近緣種成分的特異性檢測方法，以期快速、靈敏地篩查肉制品中普通牛及其近緣種成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用普通牛及其近緣種(牦牛、水牛、美洲野牛)樣品及其他動物樣品均由上海市出入境檢驗檢疫局提供。特異性鑒定中所用的植物樣品由本實驗室保存。實際檢測樣品均購自上海沃爾瑪超市。

實驗所用的MgSO4、ThermoPol Buffer和Bst酶購自美國NEB公司；dNTP購自日本Takara公司；甜菜堿購自美國Sigma公司；熒光染料SYBR Green Ⅰ購自美國Invitrogen公司；基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)購自北京天根公司；LAMP引物均由美國Invitrogen公司合成。

1.2 實驗儀器

Nanodrop 1000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；ABI Veriti 96Well PCR擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)；DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；UVP Biodoc-It 220凝膠成像一體機(jī)(上海天能科技有限公司)。

1.3 DNA提取與質(zhì)量評估

對樣品進(jìn)行預(yù)處理，將肉制品樣品攪碎成肉糜，將植物樣品研磨成粉末狀。隨后按照TIANamp Genomic DNA Kit說明書提取樣品基因組DNA，使用Nanodrop ND-1000分光光度計測定提取的DNA純度和濃度，并置于4 ℃保存。為符合進(jìn)一步的檢測要求，DNA濃度為20 ng·μL-1，A260/A280為1.8～1.9，A260/A230>2.0。

1.4 引物序列設(shè)計

從NCBI基因庫中下載不同牛種(普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛)的基因組序列，將其拆分為相鄰間隔小于100 bp的小片段。通過Bowtie 2軟件，與其他物種的基因組序列比對，提取不同牛種中共有的小片段并連接相鄰片段，輸出Blast比對相似性大于99%且大于300 bp的牛近緣種共有區(qū)域，得到單拷貝的牛近緣種的特異性基因組DNA序列(GenBank序列號：DAAA02021529.1)，其位于奶牛7號染色體上，在4個不同牛種中同源性達(dá)到100%。在此基礎(chǔ)上設(shè)計LAMP引物，外引物包括上游外部引物(forward outer primer，F(xiàn)3)和下游外部引物(backward outer primer，B3)，內(nèi)引物包括上游內(nèi)部引物(forward inner primer，F(xiàn)IP)和下游內(nèi)部引物(backward inner primer，BIP)。具體引物序列見表1。

表1 普通牛近緣種特異性序列的LAMP引物Table 1 Primers of specific sequence of bovine-related species

1.5 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化

為了建立適用于檢測普通牛及其近緣種成分的LAMP方法，對LAMP反應(yīng)體系的各個參數(shù)(鎂離子濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度、Bst酶濃度、引物比)和反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系的各參數(shù)水平設(shè)置為：鎂離子濃度分別為1、2、3、4、5 mmol·L-1；dNTP濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1；甜菜堿濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol·L-1；Bst酶加入量分別為3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 U；外、內(nèi)引物比分別為1∶2、1∶4、1∶8。采用不同水平的反應(yīng)體系，于65 ℃恒溫擴(kuò)增1 h，80 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察是否出現(xiàn)LAMP產(chǎn)物典型的梯形條帶[16]。然后采用最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，分別于60、61、62、63、64、65 ℃恒溫擴(kuò)增1 h，80 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 LAMP特異性分析

分別以肉制品中常見的動物物種和植物物種的基因組DNA為模板，對建立的LAMP方法進(jìn)行特異性分析。模板分別為：普通牛及其3種近緣種(牦牛、水牛、美洲野牛)樣品；11種其他動物(豬、綿羊、山羊、驢、馬、騾子、貓、小鼠、雞、鴨、鵝)樣品；7種植物(水稻、擬南芥、玉米、大豆、小麥、大麥、棉籽)樣品。采用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系，于65 ℃恒溫擴(kuò)增1 h，80 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL的1 000×SYBR GreenⅠ染料，觀察顏色變化，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察有無典型梯形條帶。

1.7 LAMP靈敏度分析

以普通牛及其3種近緣種(牦牛、水牛、美洲野牛)為模板對建立的LAMP方法靈敏度進(jìn)行評價。將每個物種的基因組DNA模板梯度稀釋，稀釋為6個不同濃度：20.000、10.000、2.000、0.200、0.020和0.002 ng·μL-1。以稀釋后的DNA溶液為LAMP擴(kuò)增模板，采用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系，于65 ℃恒溫擴(kuò)增1 h，80 ℃ 10 min，每個反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL的1 000×SYBR GreenⅠ染料，觀察顏色變化，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察有無典型梯形條帶。

1.8 實際樣品檢測

為了驗證建立的LAMP方法在實際應(yīng)用中的有效性，利用建立的LAMP方法對含有牛、羊、豬、雞、鴨等不同成分的市售肉制品進(jìn)行檢測。檢測的市售肉制品共16種：惠宜香辣味牛肉干、海霸王撒尿牛肉丸、億百味牛肉粒五香味、惠之園精制牛肉卷、笑喔喔沙爹味牛肉干、雨潤牛肉風(fēng)味肉排、惠之園精制羊肉卷、穆林農(nóng)場羔羊卷、清牧鮮羊肉卷、惠宜原味豬肉松、金鑼優(yōu)級王中王、休閑列車香辣味手撕肉干、定海針原味雞塊、雙匯雞肉火腿腸、來伊份鴨脖、無窮醬鹵鴨小腿。陽性對照模板為牦牛DNA。以不同的肉制品樣品為模板，采用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系，65 ℃恒溫擴(kuò)增 1 h，80 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，通過加入SYBR GreenⅠ染料觀察顏色變化和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化

為了建立最優(yōu)的LAMP反應(yīng)體系，對LAMP反應(yīng)體系的各個參數(shù)(鎂離子濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度、Bst酶濃度、引物比)和反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示。以鎂離子濃度為例(圖1A)，其中泳道4的條帶亮度最強(qiáng)，且呈典型的梯型條帶，因此體系中最優(yōu)鎂離子濃度為該泳道對應(yīng)的4 mmol·L-1鎂離子濃度。同理，最優(yōu)dNTP濃度為0.2 mmol·L-1，最優(yōu)甜菜堿濃度為0.7 mol·L-1，最優(yōu)Bst酶加入量為8 U，最優(yōu)外內(nèi)引物比為1∶8，最優(yōu)反應(yīng)溫度為65 ℃。最終優(yōu)化后LAMP體系為：10 μmol·L-1外引物F3和B3各0.25 μL，10 μmol·L-1內(nèi)引物FIP和BIP各2 μL，2 mmol·L-1dNTP 2.5 μL，25 mmol·L-1MgSO44 μL，5 mol·L-1甜菜堿3.5 μL，8.0 U·μL-1Bst DNA聚合酶1 μL，10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，DNA模板2 μL，加雙蒸水至25 μL。LAMP反應(yīng)條件為：65 ℃恒溫擴(kuò)增 1 h，80 ℃ 10 min。

2.2 LAMP特異性分析

為了驗證建立的LAMP方法的特異性，以不同的動植物樣品為模板進(jìn)行特異性分析。以普通牛及其近緣種和其他動植物樣品為模板，采用已優(yōu)化的LAMP體系進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示：在普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛樣品中擴(kuò)增獲得階梯型條帶，反應(yīng)顏色從橙色變?yōu)榫G色；在豬、綿羊、山羊、驢、馬、騾子、貓、小鼠、雞、鴨、鵝、水稻、擬南芥、玉米、大豆、小麥、大麥、棉籽樣品中無擴(kuò)增條帶，反應(yīng)顏色為橙色(圖2)。特異性測試結(jié)果表明建立的LAMP方法可以特異性地檢測普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛。

A：鎂離子濃度優(yōu)化，M—DL 2000 DNA Marker，1～5—1、2、3、4、5 mmol·L-1 Mg2+，6—空白對照；B：dNTP濃度優(yōu)化，M—DL 2000 DNA Marker，1～5—0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1 dNTP，6—空白對照；C：甜菜堿濃度優(yōu)化，M—DL 2000 DNA Marker，1～5—0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol·L-1 Betaine，6—空白對照；D：Bst酶濃度優(yōu)化，M—DL 2000 DNA Marker，1～5—3.2、4.8、6.4、8、9.6 U·μL-1 Bst酶，6—空白對照；E：外內(nèi)引物比優(yōu)化，M—DL 2000 DNA Marker，1、2—1∶2，3、4—1∶4，5、6—1∶8，7—空白對照；F：反應(yīng)溫度優(yōu)化，M—DL 2000 DNA Marker，1～6—60、61、62、63、64、65 ℃；7—空白對照。圖1 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of LAMP reaction system and reaction temperature

A：2%瓊脂糖凝膠電泳圖，B：SYBR GreenⅠ染料可視化結(jié)果；M—DL 2000 DNA Marker；1～23—普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛、豬、綿羊、山羊、驢、馬、騾子、貓、小鼠、雞、鴨、鵝、水稻、擬南芥、玉米、大豆、小麥、大麥、棉籽、空白對照。圖2 LAMP特異性分析Fig.2 Analysis of LAMP specificity

2.3 LAMP靈敏度分析

為了鑒定建立的LAMP方法的靈敏度，以梯度稀釋的普通牛及其近緣種DNA為模板，采用優(yōu)化好的LAMP體系，進(jìn)行靈敏度分析。靈敏度結(jié)果顯示(圖3)：以普通牛的梯度稀釋DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中，在20.000～0.020 ng·μL-1樣本中，具有典型的階梯型條帶擴(kuò)增和綠色的顏色反應(yīng)，在0.002 ng·μL-1樣本中無擴(kuò)增和顏色變化；以牦牛的梯度稀釋DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中，在20.000～0.200 ng·μL-1為模板的樣本中，具有典型的階梯型條帶擴(kuò)增和綠色的顏色反應(yīng)，在0.020和0.002 ng·μL-1L樣本中無擴(kuò)增和顏色變化；以水牛的梯度稀釋DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中，在20.000～0.200 ng·μL-1樣本中，具有典型的階梯型條帶擴(kuò)增和綠色的顏色反應(yīng)，在0.020和0.002 ng·μL-1樣本中無擴(kuò)增和顏色變化；以美洲野牛的梯度稀釋DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中，在20.000～0.020 ng·μL-1樣本中，具有典型的階梯型條帶擴(kuò)增和綠色的顏色反應(yīng)，在0.002 ng·μL-1樣本中無擴(kuò)增和顏色變化。綜合普通牛及其近緣種梯度稀釋DNA樣品的檢測結(jié)果，表明建立的LAMP檢測方法的靈敏為0.020 ng·μL-1。

注：左列：2%瓊脂糖凝膠電泳圖，右列：SYBR GreenⅠ染料可視化結(jié)果；M—DL2000 DNA Marker；1～6—20.000、10.000、2.000、0.200、0.020、0.002 ng·μL-1；7—空白對照。圖3 LAMP靈敏度分析Fig.3 Sensitivity of LAMP method

2.4 實際樣品檢測

為了驗證本研究建立的LAMP方法的實際應(yīng)用效果，以含有牛、羊、豬、雞、鴨等不同成分的市售肉制品為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示：在6個含有牛肉成分的樣品中擴(kuò)增獲得階梯型條帶，反應(yīng)顏色從橙色變?yōu)榫G色；在不含牛肉成分的其余10個樣品中無擴(kuò)增條帶，反應(yīng)顏色為橙色(圖4)。實際樣品檢測結(jié)果表明建立的LAMP方法可以用于市售肉及其制品中牛肉成分的檢測。

A：2%瓊脂糖凝膠電泳圖，B：SYBR GreenⅠ染料可視化結(jié)果；M—DL2000 DNA marker；1～18—惠宜香辣味牛肉干、海霸王撒尿牛肉丸、億百味牛肉粒五香味、惠之園精制牛肉卷、笑喔喔沙爹味牛肉干、雨潤牛肉風(fēng)味肉排、惠之園精制羊肉卷、穆林農(nóng)場羔羊卷、清牧鮮羊肉卷、惠宜原味豬肉松、金鑼優(yōu)級王中王、休閑列車香辣味手撕肉干、定海針原味雞塊、雙匯雞肉火腿腸、來伊份鴨脖、無窮醬鹵鴨小腿、陽性對照(牦牛)、空白對照。圖4 LAMP方法的實際樣品檢測Fig.4 Detection of practical sample by LAMP method

3 討論

牛肉作為我國第二大的肉類食品，常常涉及到肉制品摻假事件，嚴(yán)重?fù)p害了消費者權(quán)益。故本研究建立快速、可靠的牛源性成分檢測方法，以驗證在聲稱含有牛源性成分的肉制品中其成分的真實性。以食用為目的的牛肉中，普通牛、牦牛、水牛較為常見，而在NCBI基因庫中可以獲得普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛完整的全基因組序列，因此本研究以這4種牛近緣種為研究對象。由于算法是在4個牛近緣種的全基因組序列的基礎(chǔ)上建立的，因此最終得到的牛近緣種基因組靶標(biāo)基因序列具有高特異性。本研究建立的方法能夠同時檢測普通牛、牦牛、水牛、美洲野牛不同的牛源性成分，在肉制品牛源性成分檢測中具有很高的適用性。

目前，關(guān)于動物源性成分的LAMP檢測方法大多是針對單靶標(biāo)進(jìn)行檢測的，而且大部分方法是基于線粒體DNA靶序列的。如根據(jù)狐貍線粒體DNACoxⅠ基因序列建立了一種能夠快速區(qū)分出綿羊肉中摻入狐貍源性成分的LAMP檢測方法[22]；根據(jù)牛線粒體cytB基因設(shè)計特異性引物，通過動物Genie Ⅱ等溫擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)，建立了牛源性成分的LAMP檢測方法[23]，但此類方法線粒體的拷貝數(shù)高且不恒定，可能出現(xiàn)假陽性問題。因此，本研究是基于特異性單拷貝的基因組DNA靶序列來進(jìn)行檢測，有效降低了假陽性率，在實際檢測中具有更高的可操作性。而且本研究中的候選序列是通過對不同牛種的全基因組序列進(jìn)行掃描而得，所用生物信息學(xué)算法確保了靶序列的準(zhǔn)確性，所以與其他已報道的牛源性成分檢測方法相比更加可靠、準(zhǔn)確。

本研究建立的LAMP方法能在1 h內(nèi)特異地檢測出普通牛、牦牛、水牛及美洲野牛成分，檢測靈敏度達(dá)到0.020 ng·μL-1，可應(yīng)用于肉制品中對牛近緣種成分的實際檢測。檢測結(jié)果可通過凝膠電泳圖觀察得到，或者在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ熒光染料后直接用肉眼觀察。綜上，本研究所建立的LAMP方法具有高特異性、高靈敏度、反應(yīng)快速、操作簡便和無需精密儀器等特點，可應(yīng)用于肉制品中牛及其近緣種成分的實際檢測，為我國肉類食品的安全監(jiān)管和肉類的出入境檢驗檢疫提供有效的技術(shù)保障和支持。但同時，此方法也存在一些不足。LAMP擴(kuò)增結(jié)束后，可通過凝膠上的梯度條帶或產(chǎn)物反應(yīng)顯色得到檢測結(jié)果，導(dǎo)致此方法難以同時進(jìn)行多靶標(biāo)檢測。目前關(guān)于多靶標(biāo)復(fù)合檢測已有一些相關(guān)報道[24]，但由于多套引物之間可能存在相互抑制作用，LAMP多重檢測仍存在難度。未來，本方法還可以進(jìn)一步和DNA快速提取裝置、橫向流動試紙條、微流控芯片等其他裝置相結(jié)合，建立更成熟的多靶標(biāo)復(fù)合核酸檢測方法，從而實現(xiàn)高通量的LAMP現(xiàn)場快速檢測，為我國的食品安全監(jiān)管提供更加有效的技術(shù)方法。