耐除草劑玉米G1105E-823C定性檢測(cè)方法

溫洪濤,楊洋,丁一佳,苑冉,張秀杰,張瑞英*

1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所， 哈爾濱 150086； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心， 北京 100122

玉米作為單位面積產(chǎn)量最高的糧食作物[1]，盡管近年來(lái)播種面積不再大幅增加，但仍是我國(guó)播種面積最大的作物。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)統(tǒng)計(jì)，2018年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.917億hm2，其中轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積約占30%[2]。我國(guó)許多企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)也正在研發(fā)新型轉(zhuǎn)基因玉米，隨著轉(zhuǎn)基因玉米新品系的不斷增多[3-4]，為保障對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的有效監(jiān)管，亟需研發(fā)針對(duì)轉(zhuǎn)化體的檢測(cè)方法[5]。

轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米G1105E-823C是由北京奧瑞金種業(yè)股份有限公司研發(fā)的新型耐除草劑玉米，2012年該公司申請(qǐng)了發(fā)明專(zhuān)利[6]。研發(fā)單位采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，在保證氨基酸序列不變的前提下對(duì)G2-aroA基因進(jìn)行人工優(yōu)化改造，將改造過(guò)的耐草甘膦mG2-aroA基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)受體，經(jīng)過(guò)多代篩選獲得對(duì)草甘膦除草劑具有抗性的轉(zhuǎn)基因玉米G1105E-823C轉(zhuǎn)化體，與轉(zhuǎn)入原始G2-aroA基因的品種相比，G1105E-823C玉米中G2-aroA蛋白的表達(dá)量明顯提高，并且對(duì)草甘膦的耐受性也顯著提高[6]。目前G1105E-823C玉米已完成生產(chǎn)性試驗(yàn)，正在申請(qǐng)安全證書(shū)，在我國(guó)具有重要的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景，但我國(guó)當(dāng)前尚未發(fā)布專(zhuān)門(mén)針對(duì)耐除草劑玉米G1105E-823C及其衍生品種的轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法?；诖耍狙芯恳阅统輨┯衩譍1105E-823C的植物基因組與外源插入片段的連接區(qū)序列為靶標(biāo)，對(duì)其分別進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR，并優(yōu)化相應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，以期建立起精準(zhǔn)高效的耐除草劑玉米G1105E-823C的轉(zhuǎn)化體特異性定性檢測(cè)方法，為我國(guó)的轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管提供相關(guān)技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米G1105E-823C及其受體材料由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供；G1105E-823C的表達(dá)載體為pCAMBIA3300經(jīng)過(guò)改造后獲得的pS3300載體，連接目標(biāo)片段后形成pS3300-UMG2，表達(dá)框包含了UBI啟動(dòng)子，polyA-T-NOS終止子和mG2-aroA基因，均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因安全管理辦公室提供。

5種作物轉(zhuǎn)基因混合樣品：①其他轉(zhuǎn)基因玉米混合樣品(3272、Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、59122、MIR604、MON87460、MON88017)；②轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品(305423、356043、CV127、A5547-127、A2704-12、GTS40-3-2、MON89788)；③轉(zhuǎn)基因水稻混合樣品(科豐6號(hào)、科豐8號(hào)、克螟稻、M12、TT51)；④轉(zhuǎn)基因棉花混合樣品(MON1445、MON15985、MON531、MON88913、LLCOTTON25)；⑤轉(zhuǎn)基因油菜混合樣品(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2)。每種轉(zhuǎn)化體含量均為1%，均由本實(shí)驗(yàn)室收集保存。

DNeasy Plant Mini Kit植物DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；Easy Dilution購(gòu)自日本TAKARA公司；GoTaq?Green Master Mix普通PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；iTaqUniversal Probes Supermix實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H2O3-PRO金屬浴購(gòu)自北京卡尤迪公司；VX-200旋渦混勻儀購(gòu)自美國(guó)Labnet公司；5424R臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Nanodrop ND-2000核酸定量?jī)x、MiniAmp普通PCR儀、QuantStudio 7實(shí)時(shí)熒光PCR儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 樣品DNA的提取參照DNeasy Plant Mini Kit植物DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.2引物及探針 本研究選用了前期根據(jù)奧瑞金公司提供的G1105E-823C玉米外源載體插入片段的側(cè)翼序列信息設(shè)計(jì)并篩選出的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR引物，探針5′端用6-羧基熒光素(FAM)標(biāo)記，3′端用黑洞猝滅基團(tuán)(BHQ1)標(biāo)記，引物序列和所使用的熒光標(biāo)記見(jiàn)表1。引物和探針均由Thermo Fisher Scientific公司合成，用雙蒸水將引物稀釋至10 μmol·L-1作為工作液備用。

表1 研究所用引物和探針信息Table 1 Primers and probes used in this study

1.3.3反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化方法 普通PCR檢測(cè)方法中，對(duì)引物終濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)總體系為25 μL，其中GoTaq?Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物終濃度分別為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1，DNA模板50 ng，用雙蒸水將總體積補(bǔ)齊至25 μL。選取的優(yōu)化反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min ；94 ℃變性30 s，分別于56、58、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸7 min；10 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并比較結(jié)果。

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中，對(duì)引物和探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化?？傮w系為20 μL，其中iTaqUniversal Probes Supermix 10 μL，上下游引物終濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1，探針終濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1(將4種引物終濃度和4種探針終濃度進(jìn)行正交形成16個(gè)濃度組合,具體見(jiàn)表2)，DNA模板50 ng，用雙蒸水將總體積補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)；在第二階段的退火延伸(60 ℃)時(shí)段收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后分析并比較實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效果。

表2 引物和探針濃度組合Table 2 The combination of different concentrations of primers and probes

1.3.4特異性測(cè)試方法 制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米G1105E-823C粉末作為測(cè)試樣品，以其他轉(zhuǎn)基因玉米混合樣品、轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品、轉(zhuǎn)基因水稻混合樣品、轉(zhuǎn)基因棉花混合樣品及轉(zhuǎn)基因油菜混合樣品作為比對(duì)樣品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%)，并設(shè)置空白對(duì)照(水)，對(duì)1.3.3建立的轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR方法進(jìn)行特異性測(cè)試。提取測(cè)試樣品和比對(duì)樣品的DNA，并按照1.3.3中優(yōu)化后的方法進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR，反應(yīng)結(jié)束后分析上述2種定性檢測(cè)方法是否具有良好的特異性。

1.3.5靈敏度測(cè)試方法 普通PCR檢測(cè)方法中，對(duì)G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的5個(gè)樣品進(jìn)行靈敏度測(cè)試；實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中，對(duì)G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.05%和0.025%的7個(gè)樣品進(jìn)行靈敏度測(cè)試。按照1.3.3中優(yōu)化后的方法分別進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，設(shè)置空白對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后，分析靈敏度測(cè)試結(jié)果。

1.3.6檢出限測(cè)試方法 制備G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%和0.05%的樣品，并提取其DNA。隨機(jī)抽取60份G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的樣品進(jìn)行普通PCR檢測(cè)方法的檢出限測(cè)試；隨機(jī)抽取60份G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢出限測(cè)試。按照1.3.3中優(yōu)化后的方法分別進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，分析檢出限測(cè)試結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

為獲得最優(yōu)擴(kuò)增效果，對(duì)2種定性檢測(cè)方法進(jìn)行了反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化。普通PCR檢測(cè)方法中，共設(shè)置了3種退火溫度(56、58、60 ℃)和5種引物終濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1)以進(jìn)行最優(yōu)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件測(cè)試。結(jié)果(圖1)表明，在3種溫度下該引物的擴(kuò)增效率基本相同，沒(méi)有出現(xiàn)典型的非特異性條帶；在引物終濃度為0.4和0.5 μmol·L-1時(shí)擴(kuò)增效率較高，且條帶亮度基本一致。根據(jù)其擴(kuò)增效率并為與內(nèi)標(biāo)基因zSSⅡb引物的反應(yīng)條件相適應(yīng)，確定退火溫度為58 ℃，反應(yīng)體系中的引物終濃度為0.4 μmol·L-1。

注: M—DNA marker。圖1 普通PCR方法反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization for reaction system and conditions of general PCR

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中，共設(shè)置了4種引物終濃度和4種探針終濃度，引物和探針共形成16個(gè)濃度組合(表2)。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖2)顯示，引物濃度在0.4 μmol·L-1以上、探針濃度在0.4 μmol·L-1以上時(shí)，Ct值差異并不明顯。最后綜合考量了平臺(tái)期信號(hào)強(qiáng)度和體系配置等因素，確定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)體系中的引物終濃度為0.4 μmol·L-1，探針終濃度為0.4 μmol·L-1。

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)引物濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization for primer concentration of real-time PCR

2.2 特異性測(cè)試

為測(cè)試本研究建立的耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR檢測(cè)方法的特異性，以5種轉(zhuǎn)基因作物(玉米、大豆、水稻、棉花、油菜)混合樣品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%)作為比對(duì)樣品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的耐除草劑玉米G1105E-823C作為測(cè)試樣品，按照優(yōu)化后的方法對(duì)其分別進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。檢測(cè)結(jié)果(圖3、4)表明，僅從G1105E-823C轉(zhuǎn)基因玉米樣品獲得了預(yù)期的目的片段(203 bp)和擴(kuò)增曲線，而在其他樣品中均未獲得預(yù)期大小的條帶和擴(kuò)增曲線。表明建立的耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR檢測(cè)方法具有高度特異性。

注：M—DL2000 marker；1—空白對(duì)照；2—1% G1105E-823C；3—其他轉(zhuǎn)基因玉米混合樣；4—轉(zhuǎn)基因水稻混合樣；5—轉(zhuǎn)基因大豆混合樣；6—轉(zhuǎn)基因棉花混合樣；7—轉(zhuǎn)基因油菜混合樣。圖3 轉(zhuǎn)基因玉米G1105E-823C普通PCR方法的特異性測(cè)試Fig.3 Specificity test for general PCR of GM maize G1105E-823C

圖4 轉(zhuǎn)基因玉米G1105E-823C實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性測(cè)試Fig.4 Specificity test for real-time PCR of GM maize G1105E-823C

2.3 靈敏度測(cè)試

為測(cè)試本研究建立的耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR檢測(cè)方法的靈敏度，普通PCR檢測(cè)方法中共設(shè)置5個(gè)G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%)依次遞減的樣品進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果(圖5)顯示，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%及高于0.1%的樣品中均能擴(kuò)增到預(yù)期DNA片段，重復(fù)性良好。說(shuō)明普通PCR檢測(cè)方法的靈敏度可穩(wěn)定達(dá)到0.1%。

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中，共設(shè)置7個(gè)G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)(100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.05%和0.025%)依次遞減的樣品進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果(圖6)顯示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%及以上的樣品中均能獲得預(yù)期擴(kuò)增曲線，重復(fù)性良好。說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度可穩(wěn)定達(dá)到0.05%。

圖6 轉(zhuǎn)基因玉米G1105E-823C實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度測(cè)試Fig.6 Sensitivity test for real-time PCR of GM maize G1105E-823C

2.4 檢出限測(cè)試

為測(cè)試本研究建立的耐除草劑玉米G1105E-823C定性PCR檢測(cè)方法的檢出限，普通PCR方法中，隨機(jī)抽取60份G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的樣品進(jìn)行檢出限測(cè)試。結(jié)果(圖7)顯示，60次反應(yīng)全部擴(kuò)出目的條帶，可以確定普通PCR方法的檢出限為0.1%。

注：M—DL2000 marker；1—空白對(duì)照；2—非轉(zhuǎn)基因玉米；3～7—1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01% G1105E-823C。圖5 轉(zhuǎn)基因玉米G1105E-823C普通PCR方法的靈敏度測(cè)試Fig.5 Sensitivity test for general PCR of GM maize G1105E-823C

實(shí)時(shí)熒光PCR方法中，隨機(jī)抽取60份G1105E-823C轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的樣品進(jìn)行檢出限測(cè)試。結(jié)果(圖8)顯示，60次反應(yīng)全部出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，平均Ct值為35.63，可以確定實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢出限為0.05%。

圖8 轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米G1105E-823C實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢出限測(cè)試Fig.8 Detection limit test for real-time PCR of GM maize G1105E-823C

3 討論

未發(fā)放生物安全證書(shū)的轉(zhuǎn)基因作物如果通過(guò)非法渠道被釋放進(jìn)環(huán)境，可能會(huì)給周?chē)飵?lái)很大的威脅，有鑒于此，我國(guó)也一直在加強(qiáng)針對(duì)新型轉(zhuǎn)基因作物的安全管理[7]，因而研發(fā)精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因作物身份鑒定技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)前，針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品雖然有大量文獻(xiàn)報(bào)道了各種類(lèi)型的檢測(cè)方法，如傳感器、微流控芯片、等溫?cái)U(kuò)增等[8-10]，但其中最可靠并且適用性最廣的仍然是基于PCR的方法[11-13]，并且在PCR檢測(cè)中以轉(zhuǎn)化體特異性序列為目標(biāo)的方法特異性最高、效果最好[14-15]。

轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測(cè)方法是以轉(zhuǎn)基因作物中外源插入序列與受體作物基因組連接區(qū)作為檢測(cè)對(duì)象，其具有高度的特異性，目前已逐步成為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的首選方法[16-17]。本研究以耐除草劑玉米G1105E-823C的植物基因組與外源插入片段連接區(qū)序列為靶標(biāo)，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，測(cè)試特異性、靈敏度和檢出限，分別建立了基于普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR的G1105E-823C轉(zhuǎn)化體特異性的2種定性檢測(cè)方法，2種方法均能特異地檢測(cè)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米G1105E-823C成分，其中普通PCR檢測(cè)方法檢出限為0.1%，實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢出限為0.05%。轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米G1105E-823C定性檢測(cè)方法的建立，將對(duì)該轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供重要的技術(shù)支撐。

注：M—DL2000 marker；1—空白對(duì)照；2—非轉(zhuǎn)基因玉米；3～62—0.1% G1105E-823C。圖7 轉(zhuǎn)基因玉米G1105E-823C普通PCR方法的檢出限測(cè)試Fig.7 Detection limit test for general PCR of GM maize G1105E-823C

普通PCR方法具有成本較低、應(yīng)用便利和普及性高等優(yōu)點(diǎn)，而實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度更高且對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染少[18]，在應(yīng)用中不同使用者可根據(jù)實(shí)際情況在2種方法中靈活選擇，這將使檢測(cè)工作更加便利和高效。與定性檢測(cè)方法相比，定量檢測(cè)方法在檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因成分的同時(shí)可以檢測(cè)出所含轉(zhuǎn)基因成分的含量[19]，并且實(shí)時(shí)熒光PCR引物探針也可以用在數(shù)字PCR的檢測(cè)體系中[20]，因此，本團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)研發(fā)基于實(shí)時(shí)熒光和數(shù)字PCR的轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米G1105E-823C定量檢測(cè)方法，以期為我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的科學(xué)監(jiān)管提供更有力的技術(shù)支撐。