核酸層析法轉(zhuǎn)基因快速檢測體系的建立及應(yīng)用

任雯,楊海俠,陳立柱,李雨峰,劉亞*

1.北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心, 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室, 北京 100097; 2.寶瑞源生物技術(shù)(北京)有限公司, 北京 102433

自1996年商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物面世以來，全球農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積逐年快速擴大，批準(zhǔn)國家迅速增加[1]。2018年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.917億hm2[2]，是1996年的113倍，占全球15億hm2耕地面積的13%左右，全球商業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)基因的國家或地區(qū)已增加到70個[3]。其中，我國憑借290萬hm2的轉(zhuǎn)基因作物種植面積位列全球第7位。我國對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展也持續(xù)高度重視與支持，發(fā)展農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是我國的國家戰(zhàn)略要求，而轉(zhuǎn)基因檢測作為轉(zhuǎn)基因研究體系中重要一環(huán)，重要性日益凸顯，因此，開展轉(zhuǎn)基因快速、高效分子檢測方法的研發(fā)具有重要的生產(chǎn)實踐及科研意義。

一般轉(zhuǎn)基因作物的檢測分為核酸水平檢測和蛋白質(zhì)水平檢測，常用檢測方法有PCR、Southern雜交、Northern雜交、Western雜交等，其中，PCR技術(shù)是核酸水平檢測外源基因的主要手段[4-5]。核酸檢測的分子生物學(xué)方法一般包括3個步驟：核酸提取、核酸擴增和核酸檢測。目前，普通PCR檢測方法是我國轉(zhuǎn)基因植物檢測的核心技術(shù)，但該方法對實驗條件要求較高，需要配備劃分不同功能區(qū)域的大面積實驗空間、大量專業(yè)實驗儀器，且需完成核酸提取、PCR擴增以及電泳等實驗流程才可進行檢測結(jié)果判讀[6]。為提高基于PCR檢測方法的效率，研究人員從加速或省略核酸提取步驟、提高PCR反應(yīng)效率及提高結(jié)果檢測效率等環(huán)節(jié)優(yōu)化檢測流程，如趙冰兵等[7]使用一種直接PCR的方法進行轉(zhuǎn)基因檢測，通過省略核酸提取步驟從而對檢測步驟進行簡化；而武海斌等[8]建立的一種基于基因芯片的多重PCR檢測方法以及金蕪軍等[9]用復(fù)合PCR方法對6種轉(zhuǎn)基因玉米中的外源DNA片段和玉米內(nèi)參照基因(Zein)進行特異性檢測，均基于多重PCR方法提升了檢測效率；此外，劉亞等[10]對3種不同核酸分析系統(tǒng)的效率進行了比較并對其不同適用范圍和優(yōu)缺點進行了總結(jié)分析，提出了對PCR結(jié)果判讀流程的優(yōu)化方案。

蛋白質(zhì)水平檢測方面，目前常用的是基于膠體金技術(shù)的蛋白試紙條方法。膠體金免疫層析技術(shù)(colloidal gold immunochromatography assay，GICA)是將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析技術(shù)相結(jié)合，是19世紀(jì)80年代繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)[11]。最初該方法僅用于免疫電鏡技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到應(yīng)用于光鏡染色、免疫印跡以及免疫層析技術(shù)等領(lǐng)域[12]。這類試紙條檢測的特點是更加便捷，但存在適用范圍窄的缺陷，目前主要適用于轉(zhuǎn)基因植物的大田和原材料的快速初篩。

核酸層析技術(shù)是基于膠體金技術(shù)發(fā)展而來的一種新的檢測方法，通過結(jié)合常規(guī)PCR與核酸膠體金層析技術(shù)，針對標(biāo)記基因的核苷酸序列設(shè)計特異性引物，并對引物序列進行地高辛和生物素標(biāo)記，然后對試樣DNA進行PCR擴增，再對擴增產(chǎn)物進行膠體金檢測，最后根據(jù)膠體金檢測是否顯色，判斷樣品中是否含有待測成分[13]。本研究采用一步法獲取玉米、大豆、水稻等樣本的核酸作為檢測模板，分別使用內(nèi)參基因、轉(zhuǎn)基因元件、轉(zhuǎn)入外源基因及事件特異性檢測引物進行PCR擴增，再使用核酸層析法試紙鑒定檢測結(jié)果，旨在研發(fā)一種新的基于核酸檢測又可利用試紙條一步查驗結(jié)果的轉(zhuǎn)基因檢測新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用實驗樣本均由本實驗室保存，具體材料及品種名稱為：非轉(zhuǎn)基因玉米樣品：京科968(用于進行內(nèi)參基因ZSSⅡB、Zein的檢測，并作為各類轉(zhuǎn)基因元件、外源基因及事件特異性檢測及大豆、水稻內(nèi)參基因檢測的陰性對照)；轉(zhuǎn)基因玉米樣品：Bt11(作為內(nèi)參基因ZSSⅡB、Zein、啟動子CaMV35S、終止子NOS、抗蟲基因Cry1Ab/1Ac、抗除草劑基因Pat及轉(zhuǎn)基因事件Bt11檢測的陽性對照)；Mir604(作為選擇標(biāo)記基因Pmi及轉(zhuǎn)基因事件Mir604檢測的陽性對照)；Bt176(作為抗除草劑基因Bar檢測的陽性對照)；NK603(作為抗除草劑基因CP4-EPSPS檢測的陽性對照)；Mon863(用以作為選擇標(biāo)記基因NPTⅡ檢測的陽性對照)；大豆樣品：選用黑河12，用于進行大豆內(nèi)參基因SPS的檢測；水稻樣品：選用日本晴，用于進行內(nèi)參基因Lectin的檢測。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

DNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP混合液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠體金檢測試紙條由寶瑞源生物技術(shù)(北京)有限公司生產(chǎn)；引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

PCR儀選用C1000 Touch PCR系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；分光光度計選用Nanodrop 1000分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 標(biāo)記基因及選用引物

本研究選擇了內(nèi)參基因、轉(zhuǎn)基因元件、轉(zhuǎn)入外源基因及事件特異性檢測這4類檢測項目進行實驗分析。內(nèi)參基因用以區(qū)分作物種類并判別檢出結(jié)果的有效性；對常用的抗蟲、抗除草劑及選擇標(biāo)記基因等進行檢測，以證實本方法同時具備與蛋白水平檢測相同的檢出效果。此外，還選擇了轉(zhuǎn)基因元件及事件特異性檢測這2類僅用PCR等核酸檢測才可檢出的檢驗項目，用以判定本方法在核酸檢測中的特異性和有效性。對引物進行整理、篩選和優(yōu)化，最終確定其中一套引物用于檢測(表1),引物序列均出自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因檢測的相關(guān)文件[14-18]。

表1 轉(zhuǎn)基因檢測引物Table 1 Primers for genetically modified maize

1.4 樣本處理

將轉(zhuǎn)基因種子、植物葉片、莖稈過根系等材料，液氮冷凍研磨成粉狀，每種樣品取30 mg加500 μL ddH2O，使用移液槍多次吹吸混勻，靜置5 min備用。

1.5 一管法DNA提取

取5 μL核酸釋放劑(100 mmol·L-1氯化鉀；0.5 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl；1%曲拉通100；1% SDS；5 mg·mL-1蛋白酶K)，加入PCR反應(yīng)管中；取1.4制得的待測樣本5 μL加入對應(yīng)的PCR反應(yīng)管中，并用移液器在管底吹打混勻10次；每管加30 μL無菌石蠟油備用。將制備好的包含待測樣品及石蠟油的PCR反應(yīng)管放置在PCR儀中進行裂解反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min。

1.6 PCR方法

向1.5所獲得的裂解樣品的PCR反應(yīng)管中依次加入：10×PCR Buffer 5 μL，du dNTP混合液1 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.3 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，ddH2O 27.4 μL，并混勻。其中，10×PCR buffer含有0.1% DMSO、3%～5% BSA、100 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1MgCl2、50 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl。將PCR管放到離心機上，于500～1 000 g離心10 s，然后取出PCR管，放入PCR儀中，PCR反應(yīng)程序為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸45 s，共40個循環(huán)。

1.7 PCR產(chǎn)物膠體金檢測

取35 μL 1.6中的PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入膠體金檢測卡(膠體金核酸層析試紙條包含樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、膠體金檢測線、質(zhì)控線和吸水墊，具體見圖1A)，等5～10 min觀察顯色狀況(期間根據(jù)膠體金卡層析情況，可以加入少量超純水加快層析)，根據(jù)顯色卡讀取各樣品顯色級別。一般設(shè)置0～10檔， 0為全陰性，10為強陽性，中間梯度遞增；10+表示T線顏色深于標(biāo)準(zhǔn)色卡最強的10檔。當(dāng)膠體金檢測T線和C線出現(xiàn)肉眼可見顯色，表明樣品含有轉(zhuǎn)基因成分，結(jié)果表述為“樣品檢檢出轉(zhuǎn)基因成分(或目的基因成分)，檢測結(jié)果為陽性”(圖1B)；而膠體金檢測T線未出現(xiàn)肉眼可見顯色，C線出現(xiàn)肉眼可見顯色，表明樣品不含有轉(zhuǎn)基因成分，結(jié)果表述為“樣品檢未檢出轉(zhuǎn)基因成分(或目的基因成分)，檢測結(jié)果為陰性”(圖1C)。

A：膠體金核酸層析試紙條層析設(shè)計原理圖；B、C：檢測結(jié)果判定示意圖。圖1 膠體金核酸層析試紙條層析設(shè)計原理及檢測結(jié)果判定示意圖Fig.1 The schematic diagram of colloidal gold nucleic acid chromatography strip and the detection result

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因檢測

將玉米內(nèi)參基因ZSSⅡB及Zein、大豆內(nèi)參基因SPS、水稻內(nèi)參基因Lectin的擴增產(chǎn)物滴加到膠體金檢測卡。將ZSSⅡB基因的PCR擴增產(chǎn)物滴于試紙上，顯色L8、L10+，Zein基因檢測顯色L9、L10+，表示這2個樣品為玉米樣品，而空白樣本(不含待測樣品DNA的反應(yīng)體系)無顯色，表示空白樣本中不含玉米成分(圖2)。同樣，檢測水稻樣本中的SPS基因顯色可以達(dá)到L10以上，表示該樣品為水稻樣品，而陰性對照非轉(zhuǎn)基因玉米樣品無顯色則表示該樣品不含水稻成分(圖2)；大豆樣本內(nèi)參基因同樣顯色度可達(dá)L10以上，表示該樣品為大豆樣品，陰性對照非轉(zhuǎn)基因玉米樣品無顯色表示不含大豆成分(圖2)。各內(nèi)參基因檢測結(jié)果良好，空白樣本及陰性對照均無顯色。其中ZSSⅡB基因檢測玉米樣本顯色L8、L10+；Zein基因檢測玉米樣本顯色L9、L10+；水稻SPS基因檢測水稻樣本，顯色可以達(dá)到L10以上；而大豆內(nèi)參基因檢測大豆樣本，顯色亦可達(dá)L10以上；且在玉米樣品中未檢出水稻和大豆的內(nèi)參基因?？梢娫摲椒捎糜诟黝愖魑锏膬?nèi)參基因檢測，且特異性較好，不僅可用于實驗對照結(jié)果及樣品狀態(tài)是否達(dá)標(biāo)、核酸提取是否有效等檢測結(jié)果有效性的判定，并可用于判定檢測作物物種。

注：空—空白對照；NC—陰性對照。圖2 玉米、水稻、大豆內(nèi)參基因檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of maize, rice and soybean internal genes

2.2 轉(zhuǎn)基因元件檢測

將轉(zhuǎn)基因元件啟動子CaMV35S及終止子NOS的擴增產(chǎn)物滴加到膠體金檢測卡，以不含待測樣品DNA的反應(yīng)體系為空白對照、非轉(zhuǎn)基因玉米樣品(京科968)為陰性對照。由圖3可知，CaMV35S及NOS檢測陽性樣本T線及C線均存在明顯條帶顯色，且顯色度均達(dá)到L10以上，表明結(jié)果檢測結(jié)果為陽性，即該樣品檢出轉(zhuǎn)基因成分；而空白對照和陰性對照中T線均未出現(xiàn)肉眼可見顯色，而C線出現(xiàn)明顯顯色，表明檢測結(jié)果為陰性，即該樣品不含有轉(zhuǎn)基因成分。由此可見，轉(zhuǎn)基因元件檢測結(jié)果良好，證明該方法可成功檢出各類轉(zhuǎn)基因元件。

2.3 外源基因及特異性轉(zhuǎn)基因事件檢測結(jié)果

將抗蟲基因Cry1Ab/1Ac、抗除草劑Bar、Pat、CP4-EPSPS及選擇標(biāo)記基因NPTⅡ、Pmi等外源基因的擴增產(chǎn)物滴加到膠體金檢測卡，以不含待測樣品DNA的反應(yīng)體系為空白對照、非轉(zhuǎn)基因玉米樣品(京科968)為陰性對照。Cry1Ab/1Ac基因、NPTⅡ基因、Pmi基因、Pat基因檢測結(jié)果中，陽性樣本的T線和C線均出現(xiàn)肉眼可見顯色，顯色均在L10以上，表示成功檢出上述基因；而陰性對照及空白樣本T線未出現(xiàn)肉眼可見顯色，C線出現(xiàn)肉眼可見顯色，表示未檢出轉(zhuǎn)基因成分(圖4)。這幾類基因的檢測顯色對比度較強，顯色強度較高，實驗效果突出。而Bar基因、CP4-EPSPS基因檢測結(jié)果中，陽性樣本顯色在L9以上，陰性對照及空白樣本無顯色(圖4)，也達(dá)到了可清晰辨識的檢測結(jié)果要求。以上結(jié)果表明本方法可成功檢出各類外源基因，結(jié)果特異性強、辨識度高。

將特異性轉(zhuǎn)基因事件Mir604、Bt11的擴增產(chǎn)物滴加到膠體金檢測卡，以不含待測樣品DNA的反應(yīng)體系為空白對照、非轉(zhuǎn)基因玉米樣品(京科968)為陰性對照。Bt11及Mir604這2個轉(zhuǎn)基因事件經(jīng)由特異性引物檢測的結(jié)果判讀均有L10+的顯色度，同時不含對應(yīng)轉(zhuǎn)基因事件成分的陰性對照及空白對照T線均無顯色(圖4)，可見該方法對事件特異性檢測的結(jié)果判讀清晰準(zhǔn)確無誤。

注：NC—陰性對照；空—空白對照。圖3 CaMV35S啟動子及NOS終止子檢測結(jié)果Fig.3 Results of CaMV35S promoter and NOS terminator detection

3 討論

隨著全球越來越多的轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，各國對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理與標(biāo)識制度也隨之日益完善，因而對轉(zhuǎn)基因檢測工作提出了更高的要求。為適應(yīng)不斷變化的市場和監(jiān)管需求，發(fā)展轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)的關(guān)鍵就在于如何建立更高效、更高通量、更快速、更準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法[19]。常用的蛋白質(zhì)水平檢測基于膠體金蛋白試紙技術(shù)，但是由于有些轉(zhuǎn)基因樣品蛋白質(zhì)可能發(fā)生表達(dá)不完整、蛋白質(zhì)降解、折疊變構(gòu)等情況，均有可能造成假陰性結(jié)果。且該方法適用范圍較窄，如啟動子及終止子等轉(zhuǎn)基因元件均無法檢測，也無法進行特異性轉(zhuǎn)基因事件判定，目前主要用于轉(zhuǎn)基因植物的大田和原材料的快速初篩[20]。PCR方法是基于核酸水平的檢測，但該方法對實驗設(shè)施和條件要求較高，且比較費時，提取DNA這一步驟所用時間也是制約PCR檢測效率和速度的一個主要環(huán)節(jié)[21]。

本研究提出了一種基于核酸層析法的轉(zhuǎn)基因檢測新方法，可特異性的檢測出陽性轉(zhuǎn)基因樣品中抗蟲基因Cry1Ab/1Ac、抗除草劑基因Bar、Pat、CP4-EPSPS及選擇標(biāo)記基因NPTⅡ、Pmi等外源基因，還可檢出不同種類作物的內(nèi)參基因，包括玉米內(nèi)參基因ZSSⅡB及Zein，水稻內(nèi)參基因SPS及大豆內(nèi)參基因Lectin[22-23]，且不同種類作物間內(nèi)參基因檢測特異性良好，無交叉反應(yīng)。此外，一般試紙條檢測法無法判讀的轉(zhuǎn)基因元件(例如CaMV35S啟動子及NOS終止子)，及轉(zhuǎn)基因事件檢測(Bt11及Mir604)也均獲得了L9以上的清晰明顯的顯色，可明確判定出陽性樣品?？梢娫摍z測方法無論是在內(nèi)參基因、轉(zhuǎn)基因元件、外源插入基因乃至轉(zhuǎn)基因事件的檢測中，均可準(zhǔn)確、特異性的進行結(jié)果判讀。表明本方法可取代常規(guī)PCR檢測方法，覆蓋常用作物轉(zhuǎn)基因檢測項目并進行有效檢測結(jié)果判定。

注：NC—陰性對照；空—空白對照。圖4 外源轉(zhuǎn)入基因及事件特異性檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of exogenous gene transfer and event specificity

本研究將PCR檢測與試紙條檢測方法的優(yōu)勢進行聚合，通過省略了DNA提取步驟和簡化檢測讀取步驟，大大縮減了PCR檢測流程及所耗時間，且檢測靈敏度高，能在模板DNA純度很低的情況下進行PCR擴增，減少培養(yǎng)介質(zhì)和生物學(xué)物質(zhì)的影響。該方法檢測時間僅需8～10 min；結(jié)果肉眼可見且判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，僅需一臺便攜PCR儀和相關(guān)試劑即可完成田間檢測或流動檢測，也極大簡化了核酸水平檢測的實驗環(huán)境與實驗環(huán)節(jié)的需求。但同時又可檢出此前蛋白試紙等快速檢測法無法覆蓋的轉(zhuǎn)基因元件檢測及事件特異性檢測，可檢出非表達(dá)的轉(zhuǎn)入基因、啟動子及終止子元件等。此外由于該技術(shù)實現(xiàn)了快速可視化的PCR結(jié)果讀取，避開凝膠電泳中EB等污染物，對操作者和試驗環(huán)境都是安全無害的。因而該方法具有操作簡便、靈敏度高、檢測時間短、安全性高等顯著優(yōu)勢，在轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆等作物中均具有較大應(yīng)用前景，在轉(zhuǎn)基因新品種的培育中存在更大的應(yīng)用前景和空間。

此外，該方法也可同時檢測雙基因樣品。若在同一反應(yīng)體系中進行多重PCR，則可在引物設(shè)計時使用不同的探針(如TAMRA等)，并在試紙增加上包被相應(yīng)檢測T線，從而實現(xiàn)雙基因檢測，以延展使用范圍。但在實驗過程中，也發(fā)現(xiàn)該方法還存在一些局限性。在一些使用常規(guī)PCR也無法檢驗的材料盲區(qū)，如對儲存條件不佳的種子或老葉片進行實驗時，由于實驗材料中的核酸已被破壞，因而即便是使用該方法也無法獲得更好的檢測結(jié)果。且該方法對于一些未存在檢測標(biāo)準(zhǔn)的新基因和新轉(zhuǎn)基因事件的檢測[24]，需重新設(shè)計引物并在專業(yè)實驗室中進行多次常規(guī)PCR實驗以調(diào)整并確認(rèn)引物的有效性后方可使用層析法查驗結(jié)果，因而在直接用于批量化檢測前仍需一些預(yù)實驗以調(diào)整實驗條件達(dá)到滿意的實驗效果。此外，在本研究中，由于大豆及水稻轉(zhuǎn)基因材料收集不足，未進行更多物種的更多轉(zhuǎn)基因材料的實驗以驗證該方法的廣適性。由于該方法在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域尚屬首次使用，為使其在轉(zhuǎn)基因作物檢測中獲得更廣泛的應(yīng)用，后續(xù)仍需對該方法進行不斷的補充、改進和完善。