云南邊貿(mào)進(jìn)口即食食品中蠟樣芽胞桿菌污染狀況及其嘔吐毒素基因型檢測(cè)

何俊蓉,陳 蕓,李云飛,關(guān)鼎儒,范 青,呂廷保,晏明興,鄔瑋航,朱仁俊,*,胡永金,*,楊玲春,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.昆明海關(guān)技術(shù)中心,云南昆明 650228;3.昆明海關(guān),云南昆明 650051)

蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus,B.cereus)是芽胞桿菌屬的一員,為革蘭氏陽性菌,兼性需氧,可形成芽胞,無莢膜。引起食物中毒的菌株,多為周生鞭毛,有動(dòng)力[1]。

表1 各口岸采集樣品種類和數(shù)量

B.cereus是一種重要的食源性致病菌,該菌廣泛存在于各類食品中,極易污染富含淀粉的食物,特別是大米、面食以及糕點(diǎn)餅干類食品,除此之外,其還能污染蔬菜、乳制品以及肉制品等[2-6]。其引起的食物中毒分為2種類型:腹瀉型和嘔吐型,分別由腹瀉毒素和嘔吐毒素引起[7]。腹瀉型毒素至少由5類毒力因子構(gòu)成:溶血性腸毒素HBL(hbl)、非溶血性腸毒素Nhe(nhe)、細(xì)胞毒素K(cytK)、腸毒素T(bceT)以及腸毒素FM(entFM)[8-12]。嘔吐型毒素(Cereulide)是一種環(huán)形的小分子肽,由ces基因編碼,熱穩(wěn)定性強(qiáng),可以耐受極端酸堿性,具有極強(qiáng)的抗胃蛋白酶及胰島素的蛋白水解作用,會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、肝功能衰竭,進(jìn)而導(dǎo)致死亡[13-14]。在Cereulide生物合成基因簇中,嘔吐毒素合成酶基因cesB在其中扮演了重要角色。有研究表明,攝入被嘔吐型毒素污染的食物后,在0.5～6 h內(nèi)會(huì)發(fā)生惡心和嘔吐,并有腹瀉、頭暈、四肢無力等癥狀,嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致死亡,危害最大[15-17]。曾有1例瑞士男孩因食用含有大量嘔吐毒素的食物引發(fā)急性肝衰和橫紋肌溶解的死亡病例[5]。在我國由B.cereus引起的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生,主要是由嘔吐毒素污染引起的[18]。

在我國B.cereus的檢測(cè)主要參照GB 4789.14-2014《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》[19]進(jìn)行,同時(shí)也常采用其他快速檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的《2010-2014年中國進(jìn)口食品質(zhì)量安全狀況》[20]中指出,微生物污染導(dǎo)致的食品安全問題最為突出,但是目前為止,國內(nèi)關(guān)于進(jìn)出口食品致病菌污染情況的研究報(bào)道較少,進(jìn)出口食品中食源性B.cereus的研究報(bào)道幾乎為零。

本研究從云南省邊貿(mào)口岸的邊民互市點(diǎn)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及進(jìn)出口產(chǎn)品店等地共采集224份食品樣品,對(duì)其中的B.cereus進(jìn)行了分離鑒定,并同時(shí)檢測(cè)其嘔吐毒素基因cesB,以期了解邊貿(mào)進(jìn)口市售食品中B.cereus的污染分布情況及嘔吐毒素基因攜帶情況,為邊貿(mào)進(jìn)口食品食源性疾病的監(jiān)測(cè)及預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

即食食品樣品 2018年9月～2019年7月,分別從云南4個(gè)邊境口岸:天保、金水河、瑞麗和畹町口岸的邊民互市點(diǎn)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及進(jìn)出口產(chǎn)品店等地采集不同種類的進(jìn)口市售包裝224份即食食品樣品,采樣數(shù)量見表1、表2;甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基(MYP)、蠟樣芽胞桿菌顯色培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂、胰酪胨大豆羊血(TSSB)瓊脂 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;BCL鑒定卡 梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒、致病性蠟樣芽胞桿菌核酸雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒 北京卓誠惠生公司。

表2 進(jìn)口國家(地區(qū))和樣品數(shù)量

AC2-5S1生物安全柜 ESCO Airstream公司;LTI-700W恒溫培養(yǎng)箱 BOXUN公司;DK-8AD恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;Bagmixer 400cc均質(zhì)器 法國INTERSCIENCE公司;VITEK 2 compact system全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、PREVI Color Gram全自動(dòng)革蘭氏染片儀 生物梅里埃公司;ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀 ABI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蠟樣芽胞桿菌分純培養(yǎng)和生化鑒定 所有采集樣品的前處理均在潔凈條件下進(jìn)行,參照 GB 4789.14-2014《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》[19]。生化反應(yīng)呈陽性的菌株進(jìn)一步使用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK 2 compact進(jìn)行種屬鑒定。

1.2.2 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定蠟樣芽胞桿菌及其嘔吐毒素型基因

1.2.2.1 細(xì)菌基因組DNA的制備 使用接種環(huán)挑取瓊脂上培養(yǎng)18～24 h的單菌落,用 DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌基因組 DNA作為實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的模板,具體操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。待基因組DNA提取完畢后,滅菌水作為參比,取適量提取的DNA置于核酸蛋白測(cè)定儀上,進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.2.2.2 引物及探針 本文蠟樣芽胞桿菌特異性引物及探針均由北京卓誠惠生公司合成,具體引物探針信息見表3。

表3 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針序列

1.2.2.3 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 根據(jù)北京卓誠惠生公司的致病性蠟樣芽胞桿菌核酸雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒(A2292-50T)推薦的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù),建立20 μL雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系,其中包括6 μL無核酸酶水,10 μL 2×PCR mix,2 μL樣品DNA模板,2 μL 10×引物探針反應(yīng)液,反應(yīng)條件如表4所示。

表4 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 分離、鑒定結(jié)果

通過分離純化、雙重實(shí)時(shí)熒光PCR以及全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)蠟樣芽胞桿菌分離鑒定,在224份邊貿(mào)進(jìn)口市售即食食品樣品中共檢出45份蠟樣芽胞桿菌陽性樣品,檢出率為20.09%(45/224);從45份生化檢測(cè)陽性樣品中共篩選出生化實(shí)驗(yàn)陽性菌113株,對(duì)分離得到的生化實(shí)驗(yàn)陽性菌進(jìn)行持家基因gyrB的檢測(cè),結(jié)果表明生化實(shí)驗(yàn)陽性菌的gyrB基因檢出率為100%(113/113),進(jìn)一步確證了生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。各口岸蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出情況為:天保10份,檢出率為10.53%(10/95);金水河4份,檢出率為40%(4/10);瑞麗26份,檢出率為23.64%(26/110)及畹町5份,檢出率為55.56%(5/9);其中蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出率最高的為畹町口岸,金水河和瑞麗次之,最低的為天?？诎丁?/p>

各進(jìn)口國樣品中蠟樣芽胞桿菌檢出情況為:緬甸最高,陽性樣品份數(shù)為29份,檢出率為36.25%(29/80);越南和秦國檢出率次之，最低為其他進(jìn)口國(地區(qū)),未檢出陽性樣品,詳細(xì)信息如表5。雖然越南、緬甸和泰國同屬于發(fā)展中國家,但是緬甸目前經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生發(fā)展水平遠(yuǎn)不如越南和泰國[21],而且本次市場(chǎng)中購買的緬甸食品多為手工加工產(chǎn)品,食品包裝簡陋,無形中增加了食物被蠟樣芽胞桿菌污染的概率。

表5 不同進(jìn)口國樣品中蠟樣芽胞桿菌檢出情況

在各種類樣品中,除醬腌菜、水產(chǎn)及其制品以及調(diào)味品的高檢出率外,分別為:60%(3/5)、46.67%(7/15)以及50%(15/30),其他類別依次為:巧克力及糖果(制品)檢出率為26.67%(8/30)、糧食制品檢出率為20%(4/20)和堅(jiān)果和籽類檢出率為12.5%(2/16)等,詳細(xì)信息見表6。由表6可以看出,除報(bào)道中極易受蠟樣芽胞桿菌污染的糧食制品、蔬菜、乳制品、肉制品等,本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌在調(diào)味品、醬腌菜、水產(chǎn)品及其制品中檢出率也較高。

表6 各種類樣品中蠟樣芽胞桿菌檢出情況

2.2 嘔吐型蠟樣芽胞桿菌檢出情況

從陽性樣品中篩選出的113株蠟樣芽胞桿菌,嘔吐毒素cesB基因檢測(cè)結(jié)果顯示,攜帶cesB基因陽性菌株1株,檢出率為0.88%(1/113)。且該株蠟樣芽胞桿菌cesB基因陽性菌株分離自越南即食糕點(diǎn)&面包中,在即食糕點(diǎn)&面包中的檢出率為20.00%(1/5),在越南進(jìn)口陽性食品樣品中檢出率為3.03%(1/33),結(jié)果見表7、表8。蠟樣芽胞桿菌雙重實(shí)時(shí)熒光PCRcesB基因檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 蠟樣芽胞桿菌雙重實(shí)時(shí)熒光PCR cesB基因檢測(cè)結(jié)果

表7 各種類樣品中蠟樣芽胞桿菌cesB基因檢出情況

表8 不同進(jìn)口國樣品中蠟樣芽胞桿菌cesB基因檢出情況

3 結(jié)論與討論

隨著我國進(jìn)出口食品貿(mào)易額穩(wěn)步上升,邊貿(mào)食品的安全性問題逐漸進(jìn)入人們的視線之中。目前我國對(duì)邊貿(mào)食品微生物污染狀況的研究較少,但是現(xiàn)有研究表明,邊貿(mào)食品存在被微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。王夢(mèng)琦等[22]曾對(duì)吉林省出入境食品中細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、致病菌、霉菌和酵母菌染狀況進(jìn)行分析,最終得出吉林省出入境8類食品中存在著微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。何成偉等[23]對(duì)越南預(yù)包裝小食品中的沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、菌落總數(shù)、大腸菌群等微生物指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示越南預(yù)包裝小食品中存在菌落總數(shù)超標(biāo)的問題。

蠟樣芽胞桿菌作為一種常見的食源性致病菌,在各類食品中檢出率都較高,如Lan等[24]對(duì)中國內(nèi)蒙古原料奶中蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行了污染狀況分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)原料乳中蠟樣芽胞桿菌檢出率高達(dá)34.4%。Yim等[25]對(duì)從首爾零售店購買的88份韓國發(fā)酵大豆產(chǎn)品中的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行了流行情況分析,檢出率為53.40%。王君[18]在所采7大類食品樣品(合計(jì)1150 份)中均檢出了蠟樣芽胞桿菌,檢出率由高到低依次為:蔬菜(40.4%)、熟食(26.1%)、速凍食品(23.4%)、肉和肉制品(22.6%)、食用菌(21.7%)、奶制品(17.1%)和水產(chǎn)品(17.0%)。當(dāng)食品保存溫度不當(dāng)或存放時(shí)間過長時(shí),蠟樣芽胞桿菌或殘存芽胞的生長繁殖,均可引發(fā)人胃腸疾病,導(dǎo)致食物中毒[26]。

本研究從云南各口岸共計(jì)采樣224份進(jìn)口市售即食食品,其中蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出率為20.09%(45/224),比李毅[27]、倪剛[28]以及田萬帆等[29]的研究結(jié)果低,從中可以看出不同地區(qū)、不同食品中的蠟樣芽胞桿菌檢出率存在差異。其中畹町口岸蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出率(55.56%)高于其余三個(gè)口岸;在四個(gè)口岸中,天保和金水河口岸對(duì)口越南,瑞麗和畹町口岸對(duì)口緬甸,各口岸均有大量的東南亞進(jìn)口食品流入,如:越南食品、緬甸食品、泰國食品以及其他東南亞國家的進(jìn)口食品。各進(jìn)口國家食品中蠟樣芽胞桿菌檢出率依次為:越南15.58%(12/77)、緬甸36.25%(29/80)、泰國6.35%(4/63)以及其他進(jìn)口國中未檢出。從檢出情況來看,蠟樣芽胞桿菌陽性樣品檢出率偏高,這可能與特殊的生產(chǎn)加工工藝和該國食品工業(yè)基礎(chǔ)相對(duì)薄弱,食品安全法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)尚不夠健全,對(duì)食源性疾病的防范和有毒有害物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)控制能力有限相關(guān),與云南接壤的東南亞國家除部分大型食品廠外,絕大多數(shù)食品加工場(chǎng)所為小作坊式生產(chǎn)。因而食品在加工過程中,極易受到污染或二次污染。從本文檢測(cè)結(jié)果來看,醬腌菜、水產(chǎn)品及其制品以及調(diào)味品中蠟樣芽胞桿菌的檢出率較為突出,說明這三種樣品在其加工工藝或銷售過程中易受蠟樣芽胞桿菌的污染。

云南口岸進(jìn)口市售即食食品中蠟樣芽胞桿菌cesB基因攜帶率(0.88%)比劉成誠[2]、游興勇等[15]的研究相對(duì)較低。224份樣品中檢出嘔吐型蠟樣芽胞桿菌的樣品為糕點(diǎn)&餅干類,由越南進(jìn)口。有研究表明,“嘔吐綜合癥”幾乎僅與含淀粉的食物有關(guān),特別是煮熟的米飯[30]。本文結(jié)果與之前的研究結(jié)果相一致。以上研究表明邊貿(mào)即食糕點(diǎn)&餅干類食品中存在著嘔吐型蠟樣芽胞桿菌污染的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。因此,相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)邊貿(mào)即食食品中該致病菌的監(jiān)管。

綜上,云南口岸邊貿(mào)進(jìn)口即食食品中存在蠟樣芽胞桿菌污染的風(fēng)險(xiǎn),其中以調(diào)味品、醬腌菜、水產(chǎn)及其制品以及糧食制品中污染風(fēng)險(xiǎn)較大,且在糕點(diǎn)&面包食品中發(fā)現(xiàn)了嘔吐毒素基因攜帶情況,通過本研究獲得的數(shù)據(jù)將對(duì)以后邊境食品的監(jiān)控以及食源性疾病的防控、預(yù)警提供理論依據(jù)。