單糖定性定量的色譜分析方法的研究進(jìn)展

尹大芳,孫曉杰,郭瑩瑩,彭吉星,王婧媛,李 娜,王聯(lián)珠,*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島 266071;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

多糖的生理活性越來(lái)越受到關(guān)注,已被發(fā)現(xiàn)在降血脂[1]、抗氧化[2]、抗凝血[3]、抗病毒[4]、抗貧血[5]和神經(jīng)保護(hù)作用[6]等方面具有顯著功效[7]。多糖可分為同多糖和雜多糖,自然界存在的多糖通常為雜多糖,由多種單糖聚合而成。單糖組成對(duì)多糖生物活性具有重要影響,單糖組成是評(píng)價(jià)多糖理化性質(zhì)的第一步,是糖類研究必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)。單糖極性大、無(wú)紫外和熒光特性,種類多樣,結(jié)構(gòu)相似,具有同分異構(gòu)體;因此,多糖中單糖分離及定量分析極具挑戰(zhàn),成為制約糖類生物活性及應(yīng)用研究的瓶頸[8]。

表1 無(wú)需衍生化的檢測(cè)器的優(yōu)缺點(diǎn)

早期,單糖的定量測(cè)定方法有容量法、旋光法和比色法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和地衣酚法)等,該類方法缺乏專屬性,僅能用于總糖量的測(cè)定[9]。隨后,紙層析法和薄層色譜法應(yīng)用到單糖的定性定量檢測(cè),該類色譜法只能實(shí)現(xiàn)單糖的半定量分析,靈敏度和分離度差,只適用于單糖組成相對(duì)簡(jiǎn)單的多糖的定性分析[10]。近年來(lái),上述方法已逐步被高效液相色譜法、氣相色譜法、高效陰離子色譜法和毛細(xì)管電泳法等方法所取代,極大提高了單糖定性定量分析方法的準(zhǔn)確性。高效液相色譜儀在實(shí)驗(yàn)室較為普及,因此,高效液相色譜法應(yīng)用最為廣泛。氣相色譜法的局限之處在于單糖的檢測(cè)需要衍生化處理,使其具有足夠的揮發(fā)性,衍生化過(guò)程操作繁瑣[11]。毛細(xì)管電泳和高效陰離子色譜法為單糖的高效分離提供了強(qiáng)有力的工具,在單糖的定性定量分析中極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本文針對(duì)單糖的分離和定性定量的常用分析方法(液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法和高效陰離子交換色譜法)進(jìn)行文獻(xiàn)綜述以及分析評(píng)述,以期為多糖中單糖組成的檢測(cè)技術(shù)的建立提供理論參考。

1 高效液相色譜

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)是利用混合物內(nèi)各組分特定的理化性質(zhì)(極性、相對(duì)分子質(zhì)量等)在兩相(流動(dòng)相和固定相)之間分配系數(shù)的差別,從而使各組份得到分離,傳送到檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。HPLC耦合的檢測(cè)器根據(jù)是否需要對(duì)單糖進(jìn)行衍生化可分為兩種,即需衍生化的檢測(cè)器和無(wú)需衍生化的檢測(cè)器。

1.1 無(wú)需衍生化的檢測(cè)器

無(wú)需對(duì)單糖衍生化便可直接檢測(cè)的檢測(cè)器有示差折光檢測(cè)器(refractive index detector,RID)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light scattering detector,ELSD)、荷電氣溶膠檢測(cè)器(charged aerosol detection,CAD)以及質(zhì)譜檢測(cè)器(mass spectrometer,MS);此種檢測(cè)器不需要柱前柱后衍生便可完成單糖的檢測(cè),具有操作簡(jiǎn)便,節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。表1為HPLC常用無(wú)需衍生化檢測(cè)器的優(yōu)缺點(diǎn)。

1.1.1 色譜柱類型及特點(diǎn) 由于糖類具有親水性,未衍生的糖類不可通過(guò)普通反相色譜柱實(shí)現(xiàn)對(duì)單糖的分離[15]。目前,應(yīng)用于未衍生-HPLC的分離常用色譜柱有:糖基柱、氨基柱、酰胺柱。該類色譜柱柱穩(wěn)定性、壽命以及分離重現(xiàn)性等方面不佳[12]。其中,酰胺柱比氨基柱的穩(wěn)定性更高,壽命更長(zhǎng);酰胺柱的梯度兼容性更高,能夠排除鹽分的干擾,減少溶劑消耗而被廣泛應(yīng)用[16]。

1.1.2 示差折光檢測(cè)器 HPLC-RID操作簡(jiǎn)便、快速,應(yīng)用較為廣泛,《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》[17]和《中國(guó)藥典》[18]均采用HPLC-RID測(cè)定蜂蜜中的單糖和二糖,《中國(guó)藥典》中許多單糖的測(cè)定也采用該法。Filip等[19]利用HPLC-RID經(jīng)Carbosep Coregel 87H3 column色譜柱對(duì)蘋(píng)果的葉片和蘋(píng)果皮中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨糖等4種糖類化合物進(jìn)行分離檢測(cè),其線性關(guān)系良好(R2>0.99),檢出限為2.67～4.83 mg/L,定量限為8.9～16.1 mg/L,RSD<5.05%,回收率為93.94%～103.06%。RID的檢出限高,靈敏度低;受溫度影響大,需保持恒溫,微小的溫度波動(dòng)也會(huì)引起響應(yīng)值的巨大波動(dòng)[15]。RID與流動(dòng)相濃度的波動(dòng)緊密相關(guān),使用梯度洗脫時(shí)會(huì)發(fā)生基線漂移,影響單糖定量的準(zhǔn)確度[20]。RID作為檢測(cè)器時(shí),不可使用梯度洗脫,而單糖分離過(guò)程中,等度洗脫很難將復(fù)雜的單糖混合物進(jìn)行分離,使單糖分離效果受到限制。

1.1.3 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 HPLC-ELSD對(duì)溫度波動(dòng)不敏感[21],逆梯度洗脫可使ELSD響應(yīng)值不受洗脫劑梯度影響,ELSD可使用梯度洗脫[8]。HPLC-ELSD通過(guò)對(duì)洗脫劑蒸發(fā),從而達(dá)到對(duì)不易揮發(fā)的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的方法,需要洗脫劑具有較低的沸點(diǎn),以使洗脫劑容易蒸發(fā),防止糖類的熱降解[21-22]。Ma等[23]對(duì)桃子、蘋(píng)果、西瓜和櫻桃等4種水果研磨取汁過(guò)濾膜后,直接進(jìn)樣,利用HPLC-ELSD經(jīng)氨基柱分離對(duì)果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖4種糖類進(jìn)行檢測(cè),在1～3000 mg/L線性范圍內(nèi)，決定系數(shù)R2為0.9934～0.9978,檢出限和定量限分別為0.07～0.27 mg/L和0.22～0.91 mg/L,方法回收率為96.05%～103.32%。吳曉鵬等[24]利用HPLC-ELSD經(jīng)Xbridge-NH2色譜柱分離測(cè)定木薯中的果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖,檢出限為4.00～7.00 mg/L,靈敏度相對(duì)較低。ELSD的局限之處在于檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低,對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)線性關(guān)系較差。

1.1.4 荷電氣溶膠檢測(cè)器 CAD又稱為電霧式檢測(cè)器,是以粒子的質(zhì)量為基準(zhǔn),具有普遍適用性。相對(duì)于RID和ELSD,具有更高的檢測(cè)靈敏度及更低的檢出限。Yan等[25]利用HPLC-CAD經(jīng)BEH amide column分離檢測(cè)植物中的鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等8種單糖,該方法線性關(guān)系良好(R2≥0.9981),回收率為94.02%～103.37%,檢出限為15～40 ng。相比于RI和ELSD,CAD在靈敏度、線性關(guān)系、重復(fù)性和方法回收率等方面表現(xiàn)更佳。

表2 需衍生化檢測(cè)器的優(yōu)缺點(diǎn)

1.1.5 質(zhì)譜檢測(cè)器 MS具有快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn),在單糖結(jié)構(gòu)解析方面具有獨(dú)一無(wú)二的優(yōu)勢(shì),是未來(lái)糖類結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的發(fā)展方向。趙丹等[26]采用HPLC-MS經(jīng)Waters Acquity BEH Amide色譜柱測(cè)定螺旋藻多糖的單糖組成,鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等12種單糖的定量限在0.005～0.15 mg/L之間,回收率在80.21%～121.6%之間。王倩文等[27]利用HPLC-MS測(cè)定啤酒中果糖、葡萄糖的含量,果糖檢出限為0.05 mg/L,葡萄糖檢出限為0.49 mg/L,決定系數(shù)R2=0.9999。Wu等[28]采用PMP-HPLC/ESI-MS對(duì)食用馬尾藻多糖中單糖進(jìn)行了分析,實(shí)現(xiàn)了對(duì)甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖五種單糖的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的分離檢測(cè),線性范圍在0.1～10 mg/L之間,檢出限在0.02 mg/L及以下。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度高,檢測(cè)靈敏度高,復(fù)現(xiàn)性高。但一些利用HPLC-MS檢測(cè)糖類的文獻(xiàn)中缺乏關(guān)于回收率的方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù),這可能是由于HPLC-MS的回收率較低。MS的局限之處在于單糖自身低電離度造成檢測(cè)的靈敏度低,復(fù)現(xiàn)性差,回收率差;另外,MS設(shè)備價(jià)格昂貴,操作技術(shù)要求高,需要熟練的分析人員,現(xiàn)階段應(yīng)用推廣還較為困難。

1.2 需衍生化的檢測(cè)器

常用的需衍生化的檢測(cè)器有:紫外檢測(cè)器(ultra-violet detector,UV)和熒光檢測(cè)器(fluorescence detectors,FLD)。該檢測(cè)器通常具有準(zhǔn)確可靠、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),但也伴隨著操作繁瑣,浪費(fèi)時(shí)間的不足。表2為HPLC常用需衍生化檢測(cè)器的優(yōu)缺點(diǎn)。

1.2.1 衍生化 糖類化合物缺乏發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)(無(wú)紫外和熒光特性),單糖只吸附在190～210 nm區(qū)域,而HPLC常用的乙腈等有機(jī)流動(dòng)相在此區(qū)域的吸附也較強(qiáng),不能直接利用UV和FLD等對(duì)單糖進(jìn)行檢測(cè),需要對(duì)單糖進(jìn)行衍生化使其具有更高的檢測(cè)靈敏度和更好地淋洗液梯度兼容性[8]。大部分糖類物質(zhì)呈現(xiàn)電中性、親水性,衍生化可使其變?yōu)閹щ姾傻摹⒁纂婋x的、疏水性強(qiáng)的衍生物,增加檢測(cè)器對(duì)其的檢測(cè)靈敏度[30]。例如:中性糖通過(guò)乙?；赊D(zhuǎn)化為電離態(tài)糖[21]。

單糖的衍生化反應(yīng)根據(jù)衍生化的順序可分為柱前衍生化和柱后衍生化兩種[31]。柱后衍生需要額外的設(shè)備作為衍生池,成本高,應(yīng)用較少。柱前衍生化常用試劑有對(duì)氨基苯甲酸(paminobenzoic acid,p-AMBA)、鄰氨基苯甲酸(o-aminobenzoic acid,OABA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)等。柱前衍生化后的單糖可使用普通烷基鍵合的硅膠柱C8和C18色譜柱便可實(shí)現(xiàn)對(duì)單糖的分離。

目前,最常用的單糖衍生劑為PMP。PMP是目前應(yīng)用最廣、適用性最高的單糖衍生劑[32],1989年[33]提出PMP衍生,PMP可使羰基上多兩個(gè)吡喃啉酮單元,使單糖帶有發(fā)色基團(tuán),它可以盡可能的減少色譜中雜峰的出現(xiàn),PMP衍生化過(guò)程與單糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有密切的關(guān)系,不同單糖由于其結(jié)構(gòu)不同會(huì)產(chǎn)生不同的衍生產(chǎn)物[32];PMP衍生化后單糖在245 nm具有強(qiáng)烈的吸收峰,檢出限低至μg/L,不需要對(duì)特定的單糖進(jìn)行脫硫處理[34],該衍生物在4 ℃儲(chǔ)存期長(zhǎng)達(dá)60 d[35]。PMP衍生化的不足在于其單糖種類的分析結(jié)果可能會(huì)不完整[36],果糖和其他非還原糖分子上的空間位阻或缺乏醛基所致,不能與PMP等典型的衍生化試劑發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)色基團(tuán),致使無(wú)法對(duì)果糖進(jìn)行檢測(cè),從而導(dǎo)致分析結(jié)果的不完整性[37]。

1.2.2 紫外檢測(cè)器 相比未衍生化的單糖檢測(cè)技術(shù),衍生化后的HPLC-UV檢測(cè)單糖的檢測(cè)靈敏度更高,檢出限更低,復(fù)現(xiàn)性更好。Bai等[38]利用HPLC-UV通過(guò)Agilent Eclipse XDB-C18column色譜柱分離檢測(cè)客家米酒中的寡糖和單糖組成,其回收率為93.13%～102.08%,RSD為0.96%～2.48%,檢出限為0.09～0.26 mg/L。UV檢測(cè)器的響應(yīng)值取決于單糖的摩爾吸收能力,即使在相似的結(jié)構(gòu)單糖,其響應(yīng)值大小也可能相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)[14]。戴軍等[39]利用PMP-HPLC-UV經(jīng)ZORBAX Eclipse XDB-C18柱對(duì)杜氏鹽藻多糖的單糖組成進(jìn)行分析,對(duì)8種中性糖、2種糖醛酸以及2種糖胺進(jìn)行分離檢測(cè),其分離單糖數(shù)量較多,取樣量少;但其單糖間的檢出限以及定量限的差距較大;衍生化操作耗時(shí)(需100 min)。此外,低波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器對(duì)淋洗液和樣品基體非常敏感,這也限制了梯度洗脫方法的使用[40]。

1.2.3 熒光檢測(cè)器 p-AMBA是FLD常用的衍生試劑,梁軍等[41]建立了p-AMBA-HPLC-FLD單糖檢測(cè)方法,其中8種單糖半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖的檢出限小于0.2 mg/L,線性關(guān)系良好。

衍生化后的單糖檢測(cè)技術(shù)往往提高了檢測(cè)的靈敏度、降低了檢出限和定量限,回收率較好,但是衍生化步驟繁瑣、耗時(shí),衍生過(guò)程不可避免會(huì)引入雜質(zhì),以及后續(xù)衍生劑的清除均可造成檢測(cè)的誤差。

2 氣相色譜

氣相色譜(gas chromatography,GC)利用試樣中各組份在氣相和固定相間的吸附或溶解能力不同,進(jìn)行反復(fù)多次分配,從而達(dá)到不同單糖間的分離。氣相色譜法具有靈敏度高、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn),適用于樣品含量較低(10-8～10-9)的多糖的單糖組分分析[42]。GC常耦合的檢測(cè)器有火焰電離檢測(cè)器(flame ionization detector,FID)和MS。

2.1 衍生化

由于單糖具有非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性,因此氣相色譜法檢測(cè)前需要衍生化,常通過(guò)衍生化以提高糖類物質(zhì)的揮發(fā)性以及揮發(fā)后的穩(wěn)定性,最常用的衍生化方法是硅烷化和乙?；痆30]。硅烷化衍生法具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間的優(yōu)點(diǎn),但容易產(chǎn)生副衍生物而造成多峰、重疊峰等現(xiàn)象,這給后續(xù)的定性工作帶來(lái)較大困難,造成定量不準(zhǔn)確。Haas等[30]針對(duì)從甲醛、乙醇醛、醛酮類三糖到己糖、多元醇和糖醛酸等單糖的GC衍生化反應(yīng)進(jìn)行了比較,得出乙?；菃翁茄苌膬?yōu)選。乙?；苌苡行p少由于糖的異構(gòu)化而造成的多峰現(xiàn)象,每種單糖都能獲得單一的色譜峰,有利于對(duì)單糖進(jìn)行準(zhǔn)確地定性和定量分析[43]。

2.2 火焰電離檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器

司雄元等[44]利用乙?；?GC-FID對(duì)經(jīng)DB-5色譜柱分離的三氟乙酸水解的微生物多糖和植物多糖中的半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖6種單糖進(jìn)行檢測(cè),其線性關(guān)系為2.00～100.00 mg/L,檢出限均在0.11 mg/L以下。He等[45]利用乙?；?GC-FID對(duì)四種海藻多糖進(jìn)行單糖檢測(cè),分析出9種單糖,靈敏度、分離度較好,但果糖出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰。楊彬君等[46]對(duì)糖腈乙酸酯衍生化后的牛樟芝多糖中單糖經(jīng)Agilent DB-WAX毛細(xì)管柱進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)出鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的峰面積的精確度RSD<1.76%,重現(xiàn)性的RSD<3.08%,該方法精確度和重現(xiàn)性良好。楊永晶等[43]利用乙?；?GC-MS,建立了鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7種單糖的檢測(cè)方法,并對(duì)樹(shù)莓多糖進(jìn)行檢測(cè),其線性范圍為25～400 mg/L,各種單糖的平均回收率分別在96.4%～101.4%,該檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便靈敏,精密度高,衍生物穩(wěn)定,衍生雜質(zhì)少,回收率穩(wěn)定,重復(fù)性佳的優(yōu)點(diǎn),具有較強(qiáng)的適用性。

2.3 氣相色譜法與高效液相色譜法的對(duì)比

有研究對(duì)比了GC和HPLC在單糖檢測(cè)中各自的優(yōu)缺點(diǎn)。例如:王瀟瑞等[47]對(duì)比了乙?；?GC-FID和PMP-HPLC分析石榴皮多糖的單糖組成方法,結(jié)果顯示,GC法操作繁瑣,試劑種類多、耗時(shí)長(zhǎng),不利于快速分析;PMP-HPLC相對(duì)操作簡(jiǎn)單,衍生化的試劑種類少,耗時(shí)短,工作效率高;畢欣寧等[48]對(duì)比了PMP-HPLC-DAD和GC-FLD測(cè)定黃芪多糖的單糖組成,結(jié)果表明,兩種方法的專屬性、精密度和穩(wěn)定性都較好,重復(fù)性和加標(biāo)回收率都較差,相對(duì)來(lái)說(shuō),PMP-HPLC的操作計(jì)算更為簡(jiǎn)便,在單糖組成分析上更具優(yōu)勢(shì),但是由于復(fù)雜的衍生過(guò)程會(huì)降低中性單糖的加標(biāo)回收率。

3 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis,CE)主要通過(guò)電場(chǎng)作用下的電泳遷移和緩沖溶液作用力下的電滲遷移來(lái)實(shí)現(xiàn)單糖的分離。利用緩沖溶液的電滲流使單糖通過(guò)對(duì)其具有不同保留程度的第二相,達(dá)到分離的目的。

3.1 毛細(xì)管電泳的種類

毛細(xì)管電泳的分離模式可分為毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)、毛細(xì)管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)、毛細(xì)管等速電泳(capillary isotacho phoresis,CITP)、毛細(xì)管等電聚焦電泳(isoelectric focusing,IEF)和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)等;耦合的檢測(cè)器有UV、PAD、MS和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(laser Induced Fluorescence Detectors,LIFD)等。CE檢測(cè)單糖常用兩種模式:非衍生化的CE-UV檢測(cè)和衍生化-CZE-UV。

3.2 質(zhì)譜檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器

Daniel等[49]利用CE-MS在12 min內(nèi)完成了對(duì)咖啡中巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖9種單糖的檢測(cè),檢出限低至0.18 mg/L。張歡歡等[50]利用CZE-UV以磷酸鹽為分離緩沖體系,在10 min內(nèi)完成了對(duì)巧克力、蘋(píng)果醋、飲料沖劑等食品中4種糖類化合物(乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖)的快速檢測(cè),其靈敏度低,檢出限分別為50、75、25和25 mg/L,定量限分別為150、225、75和75 mg/L,回收率在87.0%～107.0%之間。馬海寧等[51]以對(duì)甲氧基苯胺為衍生試劑,采用CZE-UV分析了藏紅花植物細(xì)胞多糖中的單糖組成,基線分離了11種結(jié)構(gòu)相近的醛糖(來(lái)蘇糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、纖維二糖、麥芽糖、乳糖)、酮糖(果糖)的衍生產(chǎn)物,該方法分離度好,適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖中單糖組成的測(cè)定,各單糖的回收率在為94.3%～105.4%,檢出限低至0.1 μmol/L。Rovio等[52]采用CZE-UV同時(shí)分離了檸檬、菠蘿,橙子等水果中的木糖醇、甘露醇、蔗糖、巖藻糖、纖維二糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖12種糖類化合物,其檢出限為5 mg/L。

相對(duì)于HPLC,HPCE利用極細(xì)的色譜柱作為分離柱,分離度高、效率高,是一種具有潛力的單糖檢測(cè)技術(shù),它僅需要微量的緩沖液、有機(jī)溶劑,具有經(jīng)濟(jì)性、高效性,以較HPLC快2～3個(gè)數(shù)量級(jí)的分離效率而應(yīng)用于復(fù)雜多糖的分析,大大縮短了分析時(shí)間[8]。但是CE色譜柱的極低內(nèi)徑以及極低的樣品注射量[53],導(dǎo)致CE具有較低的檢測(cè)靈敏性,較低的重復(fù)性。

表3 常用糖類分析柱的類型及其特點(diǎn)

4 高效陰離子交換色譜

高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography,HPAEC)是一種強(qiáng)大的分析單糖組成工具,嚴(yán)格來(lái)講,高效陰離子交換色譜法屬于高效液相色譜法的一種。相對(duì)于HPLC,HPAEC更適合于極性強(qiáng)、無(wú)吸光基團(tuán)的糖類化合物的檢測(cè)。HPAEC利用單糖具有潛在的可電離羥基,在強(qiáng)堿性條件下呈現(xiàn)陰離子狀態(tài),根據(jù)電離的單糖所帶電荷、疏水吸附性作用,分子量大小的不同實(shí)現(xiàn)單糖的分離。HPAEC常耦合脈沖安培檢測(cè)器(pulsed ampere detection,PAD)為檢測(cè)器,利用糖在電極表面的氧化還原反應(yīng)來(lái)對(duì)單糖進(jìn)行檢測(cè),結(jié)合固定相色譜柱的多選擇性,無(wú)需衍生且具有極高的靈敏度;利用不同相對(duì)分子質(zhì)量的低聚寡糖之間羥基解離度的稀薄差異實(shí)現(xiàn)他們的精細(xì)分離,使得幾乎所有類別的醛糖醇、氨基糖、寡糖的混合物可以達(dá)到良好的分離效果。此外,其靈敏度低至μg/L,適合于單糖含量低的物質(zhì)的檢測(cè),適用于糖類含量較少的樣品的檢測(cè),為在常規(guī)檢測(cè)器中響應(yīng)很低的單糖分析提供了方法[54]。

4.1 常用色譜柱類型

HPAEC-PAD對(duì)糖類分離效果與色譜柱選擇密切相關(guān),不同類型糖的分離需選擇相應(yīng)色譜柱。例如:木糖與甘露糖以及阿拉伯糖和鼠李糖屬于兩對(duì)差向異構(gòu)體,需要特定的糖柱結(jié)合適當(dāng)流動(dòng)相條件將其分離,CarborPac PA1為其分離提供了良好的條件。表3為HPAEC常用的分析柱的類型及其特點(diǎn)。

4.2 色譜條件對(duì)分離度的影響

HPAEC的分離條件對(duì)單糖的分離具有決定性的作用。HPAEC-PAD常以強(qiáng)堿性溶液(如:NaOH,KOH等)作為流動(dòng)相,在同樣的色譜柱的前提下,洗脫劑的濃度是影響糖類分離的首要原因,10～20 mmol/L NaOH對(duì)單糖進(jìn)行洗脫分離常能達(dá)到很好的效果。Xie等[63]利用CarboPac PA10柱結(jié)合12.5 mmol/L NaOH作為流動(dòng)相對(duì)青錢柳多糖中單糖進(jìn)行檢測(cè),一次進(jìn)樣在20 min內(nèi)快速分離了8種單糖(巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖),其檢出限在2.57～7.86 mg/L之間、重現(xiàn)性在98.53%～102.13%之間,加標(biāo)回收率在94.34%～105.69%之間。

流動(dòng)相的流速是決定HPAEC分離度的另一重要因素,較低的流速會(huì)提高分子擴(kuò)散,色譜峰展寬,峰型變矮,保留時(shí)間和分析時(shí)間增長(zhǎng),但是高流速會(huì)使系統(tǒng)壓力升高,分離度降低[69]。溫度很小的變化(±5 ℃)可能引起單糖的保留時(shí)間的遷移以及單糖保留時(shí)間復(fù)現(xiàn)性的降低[70-71]。溫度對(duì)分離度的影響因單糖種類不同而各異,例如:高溫(40～50 ℃)是分解木糖和甘露糖的優(yōu)選條件,而低溫(20～25 ℃)條件下,阿拉伯糖和鼠李糖的分離效果更好[64]。溫度的升高可以提高分離速度,但同時(shí)也會(huì)增大色譜峰寬[64]。HPAEC常用溫度為20～30 ℃。

4.3 HPAEC-PAD的相關(guān)應(yīng)用

潘丙珍等[59]利用HPAEC-PAD建立了烘焙咖啡豆及其摻假物中糖類標(biāo)記物甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖的檢測(cè)方法,7種糖在50 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離,分離度達(dá)到1.5以上,甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖在0.5～30 mg/L濃度范圍內(nèi),木糖、甘露糖、果糖在1.0～30 mg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性,相關(guān)系數(shù)在0.9990～0.9999之間;方法準(zhǔn)確度和精密度良好,加標(biāo)回收率在86.0%～101.0%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5.0%。

劉芬等[72]利用HPAEC-PAD檢測(cè)海參多糖中單糖組成,檢測(cè)出9種單糖(巖藻糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖和葡萄糖等),線性范圍在0.25～50 mg/L,決定系數(shù)R2≥0.998,檢出限為2.5～50 μg/L,加標(biāo)回收率為83.65%～113.1%。楊潔等[73]采用CE對(duì)海參多糖中單糖組成進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)出9種單糖(氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖等),線性范圍在0.5～10.0 mg/mL之間,決定系數(shù)R2≥0.982。同樣針對(duì)海參多糖的單糖組成進(jìn)行檢測(cè),相比之下,HPAEC可檢測(cè)的濃度范圍更大,且相關(guān)系數(shù)更高,檢出限更低,靈敏度更高;CE檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道中未顯示回收率的相關(guān)指標(biāo),可能是由于其回收率低。

Zhang等[54]對(duì)比了HPLC-ELSD、HPLC-RID和HPAEC-PAD三種方法對(duì)黃芪多糖中單糖含量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)ELSD和RID檢測(cè)都不太理想,而HPAEC-PAD的回收率在97.83～102.05%之間,檢出限達(dá)到μg/L,在阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和纖維二糖的檢測(cè)定量中具有高精度、高準(zhǔn)確度、高靈敏度。畢欣寧等[48]同樣對(duì)黃芪多糖中的單糖組成進(jìn)行檢測(cè),其中GC-FLD的精密度良好(RSD<0.06%),重復(fù)性好(RSD<7.21%),加樣回收率為106.3%～131.0%;HPLC的精密度良好(RSD<3.27%),重復(fù)性好(RSD<10.85%),加樣回收率為69.3%～204.1%。GC和HPLC需對(duì)單糖進(jìn)行衍生化,操作繁瑣;而HPAEC無(wú)需衍生前處理簡(jiǎn)便,在精密度,重復(fù)性、檢出限和回收率等方法學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)下更具優(yōu)勢(shì)。

4.4 不足和改進(jìn)

HPAEC在單糖檢測(cè)方面也有其局限之處,主要表現(xiàn)以下四個(gè)方面:a. HPAEC檢測(cè)常用NaOH溶液作為洗脫液,而NaOH容易與環(huán)境中CO2反應(yīng)生成NaCO3,碳酸根屬于強(qiáng)堿性二價(jià)陰離子,易與色譜柱中陰離子交換體結(jié)合,干擾碳水化合物的保留,導(dǎo)致保留時(shí)間縮短,柱選擇性降低,分辨率降低。解決這一問(wèn)題可從兩個(gè)方向出發(fā):一是盡可能的減少NaOH溶液受空氣中CO2的影響,即充氮?dú)獗Ｗo(hù);二是改變洗脫劑的耐受程度,即將易受碳酸鹽影響的洗脫劑換為不易受碳酸鹽干擾影響的KOH或向其中加入NaN3、鋇和鍶等可以沉淀碳酸鹽的物質(zhì)。Cataldi等[74]提出了鋇離子和鍶離子加入堿性洗脫液以降低二氧化碳的吸收。b. 早期使用三電位波形,單糖在金電極表面會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng),造成單糖在電極表面的堆積產(chǎn)生不可逆污染,致使電極表面容易腐蝕[55],1998年提出使用四電位波形成功解決了這一問(wèn)題,提高了檢測(cè)器的重現(xiàn)性[75]。c. HPAEC需要樣品不含有污染色譜柱的脂肪、陰離子洗滌劑以及強(qiáng)疏水性的有機(jī)化合物;不含會(huì)發(fā)生電化學(xué)干擾的強(qiáng)氧化還原性化合物[55]。d. HPAEC檢測(cè)單糖時(shí),一針樣品運(yùn)行完成后,色譜柱需要重新活化平衡后再對(duì)下一針樣品進(jìn)行檢測(cè),否則會(huì)出現(xiàn)下一針樣品的出峰時(shí)間前飄的現(xiàn)象[76]。需要利用強(qiáng)洗脫陰離子(eg:NO3-、SO4-、AC-)進(jìn)行柱后活化,由于NO3-、SO4-與固定相陰離子交換色譜柱具有強(qiáng)交換能力,會(huì)導(dǎo)致陰離子柱的容量下降,因此常使用NaAc作為柱活化劑,柱后使用NaAc作為活化劑可以提高單糖檢測(cè)的靈敏性和復(fù)現(xiàn)性[77]。

5 結(jié)語(yǔ)

單糖分離技術(shù)快速發(fā)展,現(xiàn)階段應(yīng)用最廣的單糖定量色譜技術(shù)為HPLC,高效液相色譜儀屬實(shí)驗(yàn)室的基本儀器,適合于大范圍推廣,但其耦合的不同檢測(cè)器都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。HPLC-RID無(wú)需衍生,操作簡(jiǎn)便,不可使用梯度洗脫,且受溫度影響大,單糖的分離度達(dá)不到保障;HPLC-ELSD允許梯度洗脫,但存在檢測(cè)靈敏度低的問(wèn)題,相對(duì)分子質(zhì)量小的糖類的線性關(guān)系不好;衍生化的HPLC-UV提升了檢測(cè)方法的靈敏度,在靈敏度、復(fù)現(xiàn)性、線性關(guān)系中更具優(yōu)勢(shì)。但是衍生操作繁瑣、浪費(fèi)時(shí)間,且衍生可能會(huì)帶入雜質(zhì),衍生試劑的清除以及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性為衍生化后續(xù)一系列問(wèn)題。GC適合于復(fù)雜糖類化合物的檢測(cè),分離速度快,效率高,但是GC檢測(cè)單糖需采用多種衍生試劑來(lái)完成單糖的衍生化過(guò)程,操作相當(dāng)繁瑣,且回收率低;其次,衍生產(chǎn)物常伴隨著重現(xiàn)性低的特點(diǎn),由于單糖具有差向異構(gòu)體,在堿性條件下,會(huì)發(fā)生酮式和烯醇式的互換,從而造成多峰的出現(xiàn),干擾單糖檢測(cè)定量。MS在糖類結(jié)構(gòu)解析方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),但是靈敏度和回收率均不佳。CE分辨率高,速度快,是一種具有潛力的單糖檢測(cè)技術(shù),僅需要微升級(jí)的緩沖液、有機(jī)溶劑以及添加劑,無(wú)需衍生分離效率高,適合于復(fù)雜樣品的分離,但是由于CE使用極低內(nèi)徑的色譜柱檢測(cè)糖類,進(jìn)樣量小,靈敏度低,不適用于含量少的樣品檢測(cè)。HPAEC-PAD屬于HPLC的一種,適用于普通食品工業(yè)中的糖類檢測(cè)的應(yīng)用中,具有分析時(shí)間短、效率高、靈敏度高、檢出限低、回收率高、樣品前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),在未來(lái)單糖檢測(cè)具有良好的應(yīng)用前景,有望發(fā)展成為標(biāo)準(zhǔn)化的糖類檢測(cè)技術(shù)。隨著科學(xué)理論的不斷發(fā)展,研究工作的不斷深入,將會(huì)有更多、更有效的單糖組成檢測(cè)方法逐步走向標(biāo)準(zhǔn)化。