蛻皮甾酮對紫外線誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

蘇菲菲 盧木娣 曾惠紅 江文良 賴文娟 梁堂鈺 賴雪燕 龍劍文

(1賀州市人民醫(yī)院眼科，廣西 賀州 542899；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院)

老年性白內(nèi)障是后天性白內(nèi)障中最常見的一種，其中，紫外線(UV)輻射是重要因素之一。研究表明UV照射能誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，而晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是非先天性白內(nèi)障所共同的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)〔1〕。盡管手術(shù)為老年白內(nèi)障患者提供了最終治療的有效手段，但初、中期白內(nèi)障患者仍需尋求藥物治療以阻止和延緩進(jìn)程。EDS是來源于牛膝的一類甾酮物質(zhì)〔2〕，大量的研究表明其具有抗炎，抗過敏，抗氧化，抗凋亡等重要生物學(xué)作用〔3，4〕。EDS可以減少過氧化氫處理后人晶狀體上皮細(xì)胞核因子κB-p65的表達(dá)〔5〕，并可以調(diào)節(jié)Bcl-xL/Bax水平，減少白介素-1β 處理后軟骨細(xì)胞凋亡〔6〕。本研究了EDS對UV輻射后人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)下游機制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑 蛻皮甾酮(中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號111638-201403)。人永生化人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院)；Dulbecco Modified Eagle Medium培養(yǎng)基〔賽默飛世爾科技(中國)有限公司，批號12491〕、小牛血清〔賽默飛世爾科技(中國)有限公司，批號8131650〕和胰蛋白酶〔賽默飛世爾科技(中國)有限公司，批號25200〕；CCK-8試劑盒(武漢博士德生物公司，批號FP653)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物，批號KGA108)；Trizol總RNA提取試劑(美國Invitrogen，批號15596-026)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技有限公司，批號KR103)；PCR試劑盒(天根生化科技有限公司，批號FP302)；Bax抗體(美國細(xì)胞信號技術(shù)公司CST，批號2772)、Bcl-2抗體(美國細(xì)胞信號技術(shù)公司CST，批號15071)、酶切caspase-3抗體(美國細(xì)胞信號技術(shù)公司CST，批號：9661)；辣根酶標(biāo)記抗鼠IgG抗體(美國圣克魯斯生物技術(shù)公司，批號SC-358920)；辣根酶標(biāo)記抗兔IgG抗體(美國圣克魯斯生物技術(shù)公司，批號SC-2030)；辣根酶標(biāo)記的β-actin抗體(上海興悠生物科技有限公司，批號4976)；ECL試劑盒(阿莫仙生物科學(xué)公司，批號2232)。

1.2儀器 多斯卡分光光度儀(Finnpipette公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron 公司)；PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD biosciences)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞將近融合時，采用胰酶消化，傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行研究。UV照射方法：UV燈源的光譜范圍是290～400 nm。照射強度為0.8 mW/cm2。照射劑量：10 J/cm2〔7〕。將細(xì)胞傳代于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每組均設(shè)6孔。EDS高劑量組(UV+1.5 μmol/L EDS)，EDS中劑量組(UV+1.0 μmol/L EDS)，EDS低劑量組(UV+0.5 μmol/L EDS)處理方法：采用不同劑量的EDS處理HLE-B3細(xì)胞，孵育6 h后，避光UV輻射3.5 h，孵育6 h后，收集細(xì)胞，檢測；UV組：避光UV輻射3.5 h后，繼續(xù)孵育6 h，收集細(xì)胞，檢測；空白對照組：不采用UV輻射。

1.3.2細(xì)胞生存率檢測 細(xì)胞消化后，接種于96孔板中(2.5×104/孔)，孵育24 h，分組：空白對照組、EDS高劑量組、EDS中劑量組、EDS低劑量組培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8 10 μl，顯色后，檢測各孔的吸光值，以存活率代表細(xì)胞的存活狀態(tài)。細(xì)胞的存活率(%)=〔(藥物孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)〕×100%。

1.3.3凋亡水平檢測 分為空白對照組，UV組，EDS高劑量組(UV+1.5 μmol/L EDS)，EDS中劑量組(UV+1.0 μmol/L EDS)，EDS低劑量組(UV+0.5 μmol/L EDS)，UV組。各組HLE-B3細(xì)胞消化后，懸浮細(xì)胞，離心，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，收集細(xì)胞，結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞(冰浴，避光)，濃度為 5×104/L，加入 Annexin-FITC 和 PI，孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.4mRNA水平檢測 不同分組處理后(同1.3.3)收集細(xì)胞，引物如下：Bax上游5-CAAGCTGAGCCAGTGTcTCAAGC-3，下游5-ATGGTCACGGTCCAACCACC-3；Bcl-2上游5-CTGTGGTCCACCTGACCCTCC-3，下游5-GGCATCCCAGCCTCCGTI′AT-3；Caspase-3上游5-GTCTCAATGCCACAGTCC-3，下游5-TGATGCGTGATGTTTCTA-3，GAPDH：上游引物5-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3,下游引物5-TGGAGGGATCTCGCTCCTGGAAGAT-3。提取細(xì)胞總RNA；cDNA合成；PCR反應(yīng)。結(jié)果采用△Ct值法計算。

1.3.5蛋白水平檢測 不同分組處理后(同1.3.3)收集細(xì)胞，提取總蛋白并定量。上樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，磷酸緩沖鹽溶液洗膜，封閉l h；磷酸緩沖鹽溶液洗膜，加入一抗，4 ℃過夜；磷酸緩沖鹽溶液洗膜；加入二抗孵育0.5 h；洗膜；用ECL試劑盒檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1EDS對HLE-B3細(xì)胞增殖的影響 與空白對照組 (存活率為1.063±0.123)比較，EDS低劑量組(存活率為1.120±0.159)、EDS中劑量組(存活率為1.162±0.133)、EDS高劑量組(存活率為0.958±0.178)HLE-B3細(xì)胞增殖水平無顯著差異(P>0.05)，且組間比較無顯著差異(F=2.791，P>0.05)。

2.2EDS對UV輻射導(dǎo)致HLE-B3細(xì)胞凋亡的影響 與空白對照組(凋亡率為5.157%±1.222%)比較，UV組HLE-B3細(xì)胞凋亡率顯著增加(凋亡率為44.303%±1.452%)，說明UV輻射能導(dǎo)致HLE-B3細(xì)胞凋亡。與UV組比較，各EDS組HLE-B3細(xì)胞凋亡率逐漸下降EDS低、中、高劑量組(凋亡率分別為32.297%±1.281%、25.155%±1.106%、20.098%±1.360%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且三組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=143.438，P<0.01)。

2.3EDS對UV輻射導(dǎo)致HLE-B3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 見表1。與空白對照組比較，UV組HLE-B3細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.01)；與UV組比較，各EDS組HLE-B3細(xì)胞Bax mRNA水平明顯降低(P<0.01)，且三組組間比較有顯著差異(F=249.097，P<0.01)。與空白對照組比較，UV組HLE-B3細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平顯著下降(P<0.01)；與UV組比較，各EDS組HLE-B3細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平明顯上升(P<0.01)，且組間比較有顯著差異(F=33.845，P<0.01)。與空白對照組比較，UV組HLE-B3細(xì)胞Caspase-3 mRNA水平明顯上升(P<0.01)；與UV組比較，各EDS組HFLE-B3細(xì)胞Caspase-3 mRNA水平顯著下降(P<0.01)，且組間比較有顯著差異(F=20.543，P<0.01)。

2.4EDS對UV誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 EDS可以減少UV輻射后HLE-B3細(xì)胞Bax蛋白和酶切Caspase-3蛋白的水平，并增加Bcl-2蛋白水平。比較空白對照組，UV組HLE-B3細(xì)胞Bax和酶切Caspase-3表達(dá)明顯增高(P<0.01；P<0.01)；比較UV線組，各蛻皮甾酮組HLE-B3細(xì)胞Bax和酶切Caspase-3蛋白水平顯著下降(P<0.01；P<0.01)，且組間比較有顯著差異(F=86.895，P<0.01；F=33.080，P<0.01)。與空白對照組比較，UV組HLE-B3細(xì)胞Bcl-2蛋白水平顯著下降(P<0.01)；與UV組比較，各EDS組HLE-B3細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸增高(P<0.01)，且組間比較有顯著差異(F=22.591，P<0.01)。見表1。

表1 各組HLE-B3細(xì)胞Bax、Bcl-2與Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)

3 討 論

引發(fā)老年性白內(nèi)障的相關(guān)因素有多種，UV輻射是最為相關(guān)的誘發(fā)因素之一。通過光化學(xué)反應(yīng)，UV輻射晶狀體上皮細(xì)胞，會產(chǎn)生大量氧自由基，活化線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8，9〕。本研究結(jié)果提示，當(dāng)HLE-B3細(xì)胞給予UV照射后，凋亡率顯著提高，進(jìn)而證實UV輻射能促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。

中藥牛膝為莧科植物牛膝的干燥根〔10〕，味苦、酸，性平，歸肝、腎經(jīng)，是常用的抗衰老中藥之一〔11，12〕。蛻皮甾酮是來源于牛膝的生物活性分子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)〔3〕，本研究表明一定劑量的EDS對晶狀體上皮細(xì)胞存活無顯著影響。經(jīng)過EDS作用后，UV輻射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡明顯減少，說明EDS能減少UV輻射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

以往的研究表明，Bax/Bcl-2表達(dá)失調(diào)能導(dǎo)致線粒體膜電位下降，進(jìn)而引起細(xì)胞色素釋放及Caspase家族蛋白的級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡〔13，14〕。為了進(jìn)一步研究蛻皮甾酮抗凋亡的具體機制，本研究表明：在通常情況下，細(xì)胞Bcl-2/Bax的值處于高位，減少不利因素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔15〕，維持晶狀體透明狀態(tài)，防止發(fā)生白內(nèi)障。本研究表明UV輻射HLE-B3細(xì)胞上調(diào)了Bax蛋白表達(dá)，減少了Bcl-2蛋白的水平，Bcl-2/Bax值顯著降低，活化Caspase-3蛋白，引起細(xì)胞凋亡；而經(jīng)過EDS處理后，上調(diào)了HLE-B3細(xì)胞Bcl-2基因及蛋白的表達(dá)，并且抑制了Bax基因和蛋白的表達(dá)，Bcl-2/Bax的比率提高，減少Caspase-3的活化，抑制了細(xì)胞的凋亡。

總之，蛻皮甾酮對UV輻射導(dǎo)致的晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡有明顯的抑制作用，為EDS防治老年性白內(nèi)障提供了一定的依據(jù)。