黃連上清片微生物限度檢查法的建立

張秀花，劉艷平，曲國晶

(菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤)

0 引言

黃連上清片收載于《中華人民共和國藥典》(以下簡稱：《中國藥典》)2015年版一部[1]，清風(fēng)清熱、瀉火止痛，臨床應(yīng)用廣泛。由于黃連上清片中多種藥材如黃連、黃芩、大黃、連翹、梔子等均具有明顯的抗菌活性[2-10]，進行微生物限度檢查時，需要首先消除樣品本身的抑菌作用，才能使被檢生物能夠正常繁殖[11]。作者對6家生產(chǎn)企業(yè)6個批次的樣品進行試驗，結(jié)果微生物計數(shù)采用增加稀釋液法，控制菌檢查采用常規(guī)法，該方法操作簡單，重現(xiàn)性好，可供其他實驗室參考使用。

1 儀器與材料

1.1 樣品

安徽九方制藥有限公司(批號：190401)，福建樂爾康藥業(yè)

有限公司(批號：190128)，河南金鴻堂制藥有限公司(批號：20181105)，洛陽天生藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號：190405) 樂氏同仁三門峽制藥股份有限公司(批號：20190107)，仲景宛西制藥股份有限公司(批號：20191101)。

1.2 培養(yǎng)基與稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA(批號：190518)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基TSB(批號：190712)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 SDA(批號：190625)，腸道菌增菌液 EE(批號：180222)pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：190206)等均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

按藥典要求[12]將5種菌株依法制成不大于1000cfu/mL的菌液。

2.2 供試液制備

取“1.1”項下樣品10g，研細，加入“1.3”項下稀釋液至100mL，制成1:10 供試液；依法制成1:20、1:50、1:80[13]、1:100、1:1000 的供試液。

2.3 微生物計數(shù)試驗

2.3.1 常規(guī)法

取“2.1”項下菌液0.1mL至9.9mL“2.2”項下1:10供試液中，為試驗組；取稀釋液0.1mL至9.9mL“2.2”項下1:10供試液中，為供試品對照組；取“2.1”項下菌液0.1mL至9.9mL稀釋液中，為菌液對照組。

2.3.2 增加稀釋液法

取“2.1”項下菌液0.1mL至9.9mL“2.2”項下1:20供試液中，為試驗組；取稀釋液0.1mL至9.9mL“2.2”項下1:20供試液中，為供試品對照組；取“2.1”項下菌液0.1mL至9.9mL稀釋液中，為菌液對照組。1:50、1:80供試液依法操作。

表1 常規(guī)法預(yù)試驗結(jié)果(n=3)

2.4 微生物計數(shù)結(jié)果

2.4.1 預(yù)試驗

常規(guī)法測定5種菌株回收比，按“2.3.1”項下操作，平皿計數(shù)結(jié)果見表1。

由表1可以看出，不同企業(yè)生產(chǎn)的黃連上清片抑菌活性不同，針對本次試驗的6家生產(chǎn)企業(yè)的樣品，無法統(tǒng)一采用常規(guī)法進行試驗；不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品對5種菌株的敏感性不同，其中對銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性較強，回收比均小于0.5，可將這3種菌株作為敏感菌株進一步進行試驗。

2.4.2 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法的確定

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選用上述3種菌株作為敏感菌株，采用增加稀釋液法試驗，按“2.3.2”項下操作，平皿計數(shù)結(jié)果見表2。

由表2可以看出，稀釋倍數(shù)不同，供試液的抑菌性不同，稀釋倍數(shù)越大，抑菌性越小。1:20供試液，6批樣品中均存在回收比小于0.5的敏感菌株；1:50供試液，2批樣品存在回收比小于0.5的敏感菌株；1:80供試液，6批樣品5種菌株回收比均在0.5～2.0之間，符合藥典要求。

2.4.3 正式試驗

根據(jù)“2.4.1”及“2.4.2”項下確認的結(jié)果，采用增加稀釋液法進行試驗，按“2.3.2”項下操作，1:80供試液平皿計數(shù)結(jié)果見表3。

由表3可以看出，6批樣品5種菌株回收比均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合藥典要求，方法可行。

表2 敏感菌株回收比試驗結(jié)果(n=3)

表3 黃連上清片方法適用性試驗結(jié)果(n=3)

表4 黃連上清片控制菌檢查結(jié)果

2.5 控制菌檢查試驗

2.5.1 耐膽鹽革蘭陰性菌

供試品組：取“2.2”項下 1:10、1:100、1:1000供試液各1mL分別至10mL及20mLEE中；陽性對照：取“2.2”項下1:10、1:100、1:1000供試液各1mL分別至10mL及20mLEE中，再加入“2.1”項下相應(yīng)陽性菌0.1mL；陰性對照：以稀釋液代替供試液，以上各組依法檢查。

2.5.2 大腸埃希菌

供試品組：取“2.2”項下1:10供試液10mL至100mL及200mLTSB中；陽性對照：取“2.2”項下1:10供試液10mL至100mL及200mLTSB中，再加入“2.1”項下大腸埃希菌0.1mL；陰性對照：以稀釋液代替供試液，以上各組依法檢查。

2.5.3 沙門菌

供試品組：取“1.1”項下樣品10g至100mL及200mLTSB中；陽性對照：取“1.1”項下樣品10g至100mL及200mLTSB中，再加入“2.1”項下乙型副傷寒沙門氏菌0.1mL；陰性對照組：以稀釋液代替供試液，以上各組依法檢查。控制菌檢查結(jié)果見表4。

由表4可以看出，常規(guī)法可用于黃連上清片控制菌檢查。

3 討論

微生物限度檢查法最初收載于《中國藥典》1995年版，2005年版首次引入方法驗證試驗，2015年版修訂為方法適應(yīng)性試驗。從歷年藥典的修訂情況可以看出，藥品的安全性越來越受到重視。微生物污染指標菌檢出與否，關(guān)鍵在于使用的計數(shù)方法是否有效，檢查的重點和難點在于方法適用性試驗的建立[14-17]；當檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新進行適用性試驗[18]。

從表1可以看出，常規(guī)法6家生產(chǎn)企業(yè)的樣品對5種菌株的抑菌性均不同。針對這一問題，首先將回收比小于0.5的菌株作為敏感菌株，采用增加稀釋液的方法，逐漸增加稀釋倍數(shù)，至所有敏感菌株的回收比均在0.5～2.0之間。從表3可以看出，1:80供試液，各試驗菌回收比均在0.90以上，表明方法可行。

由于黃連上清片中抑菌成分復(fù)雜，考慮到對控制菌的抑菌作用，本試驗采用常規(guī)法和增加培養(yǎng)基體積法同時進行控制菌檢查，結(jié)果表明黃連上清片對控制菌無抑制作用，常規(guī)法可用于控制菌的檢查。