半夏厚樸湯對順鉑所致水貂嘔吐模型的作用及機(jī)制研究

黃仕文，范方田，嵇晶，譚峰，程建明，喻斌，牛迪

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

化療藥物誘發(fā)的嘔吐是臨床常見的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，也是導(dǎo)致化療中斷的重要原因[1]。當(dāng)前盡管采用一系列神經(jīng)遞質(zhì)受體阻斷劑類止吐劑進(jìn)行干預(yù)和治療，但是其價(jià)格昂貴，也伴隨著出現(xiàn)如頭痛、消化不良等其他不良反應(yīng)，增加了患者的痛苦，因而急切需要尋求新的有效止吐藥物。半夏厚樸湯(BXHPT)源自張仲景的《金匱要略》[2]，由半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉組成，具有行氣散結(jié)，降逆化痰的作用。已有研究表明，半夏厚樸湯在臨床上能夠?qū)Χ喾N嘔吐具有良好的延緩和治療作用，并能夠保護(hù)胃黏膜，推測其可能與大腦最后區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)信號有關(guān)[3]。因而，采用順鉑構(gòu)建的水貂嘔吐模型[4]研究半夏厚樸湯對嘔吐的治療作用，并對模型水貂大腦最后區(qū)P物質(zhì)(SP)相關(guān)信號通路進(jìn)行研究，為中醫(yī)藥治療化療嘔吐提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

半夏厚樸湯方中所有藥材均購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，組方如下：半夏12 g，茯苓12 g，厚樸9 g，生姜15 g，蘇葉6 g，采用水煎，紗布濾過，濃縮藥液使其終濃度為每1.0 mL含生藥量1.0 g。

1.2 動物

健康成熟雄性水貂36只，體質(zhì)量1.6～2.1 kg，購自上海甲干生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2017-0005。動物每只單獨(dú)飼養(yǎng)于鐵籠中，自然光照，自由飲食飲水，實(shí)驗(yàn)過程中盡可能減少動物痛苦。所有動物實(shí)驗(yàn)均符合南京中醫(yī)藥大學(xué)動物管理與使用委員會批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動物管理和使用指南，倫理批號：201908A003。

1.3 試劑與儀器

注射用順鉑(凍干型)，齊魯制藥有限公司，批號：1WA5C18070906A。鹽酸昂丹司瓊注射液購自齊魯制藥集團(tuán)，批號：190306；SP檢測ELISA試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司，批號：L06034029；RIPA裂解液購自北京鼎國生物公司，批號：1908163；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，批號：QL227057；兔抗NRK1R、p-ERK1/2、ERK1/2和β-actin抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0064R、bs-1522R、bsm-52259R和bs-0061R。

BSA224S-CW型電子天平(德國Sartorius科學(xué)儀器公司)；G3型精密移液器(德國Eppendorf公司)；GM3500型多功能酶標(biāo)儀(美國Promega公司)；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-RAD公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

水貂適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將36只水貂隨機(jī)分為6組，分別為正常對照組，模型組，昂丹司瓊組，半夏厚樸湯低、中、高劑量組，每組6只動物。給藥時(shí)正常對照組和模型組分別給予等體積的生理鹽水，昂丹司瓊組腹腔注射鹽酸昂丹司瓊注射液2 mg/kg，半夏厚樸湯低、中、高劑量分別灌胃半夏厚樸湯濃縮液折合生藥量為200、400、800 mg/kg(參照藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)進(jìn)行換算，設(shè)定人的有效劑量為低劑量)，連續(xù)給藥7 d，第7天給藥2 h后，除正常對照組之外，均腹腔注射順鉑進(jìn)行造模，給藥劑量為7.5 mg/kg。

2.2 水貂嘔吐的觀察

順鉑注射后，連續(xù)觀察水貂0～24、24～48 h和48～72 h內(nèi)動物的干嘔和嘔吐次數(shù)。

2.3 大腦最后區(qū)SP表達(dá)的檢測

順鉑造模72 h后處死水貂，小心分離動物大腦最后區(qū)組織，采用生理鹽水清洗后，剪取適當(dāng)質(zhì)量的腦組織加入適量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，12 000 r/min高速離心，吸取勻漿上清，參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.4 大腦最后區(qū)NK1R、p-ERK和ERK蛋白表達(dá)的檢測

取上述適量的水貂大腦最后區(qū)組織，采用蛋白裂解液進(jìn)行充分裂解組織并提取組織中的總蛋白，應(yīng)用BCA定量法計(jì)算蛋白的濃度。取約50 μg總蛋白進(jìn)行上樣(恒壓100 V)，電轉(zhuǎn)膜時(shí)間為80 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用含5%脫脂奶粉的TBST將膜封閉1 h。封閉結(jié)束后，用TBST溶液清洗膜5次，每次10 min，然后一抗孵育，置4 ℃冰箱過夜。第2天TBST溶液清洗膜5次，二抗室溫孵育1.5 h，蛋白顯影。采用Image J對蛋白條帶進(jìn)行定量，計(jì)算各組NK1R、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 半夏厚樸湯對順鉑致水貂干嘔次數(shù)的影響

與正常對照組相比，在0～24 h急性期階段內(nèi)，模型組水貂干嘔次數(shù)顯著增加，BXHPT中、高劑量組較模型組顯著減少(P<0.05)；在24～48 h延遲期階段內(nèi)，模型組水貂干嘔次數(shù)顯著增加，BXHPT中、高劑量組較模型組顯著減少(P<0.05)；在48～72 h延遲期階段內(nèi)，模型組水貂干嘔次數(shù)顯著增加，BXHPT中、高劑量組較模型組顯著減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組水貂干嘔次數(shù)

3.2 半夏厚樸湯對順鉑致水貂嘔吐次數(shù)的影響

與正常對照組相比，在0～24 h急性期階段內(nèi)，模型組水貂嘔吐次數(shù)顯著增加，BXHPT中、高劑量組較模型組顯著減少(P<0.05)；在24～48 h延遲期階段內(nèi)，模型組水貂嘔吐次數(shù)顯著增加，BXHPT中、高劑量組較模型組顯著減少(P<0.05)；在48～72 h延遲期階段內(nèi)，模型組水貂嘔吐次數(shù)顯著增加，BXHPT中、高劑量組較模型組顯著減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組水貂嘔吐次數(shù)

3.3 半夏厚樸湯對順鉑致水貂SP水平的影響

與正常對照組相比，模型組水貂大腦最后區(qū)SP表達(dá)水平顯著增加，BXHPT中、高劑量組較模型組顯著減少(P<0.05)，見圖1。

3.4 半夏厚樸湯對順鉑致水貂NK1R通路的影響

與正常對照組比較，模型組水貂大腦最后區(qū)組織中NK1R和p-ERK1/2表達(dá)水平顯著升高。與模型組比較，BXHPT中、高劑量組水貂大腦最后區(qū)組織中NK1R和p-ERK1/2表達(dá)水平顯著降低，見圖2。

4 討論

順鉑為金屬鉑類絡(luò)合物，具有抗癌譜廣、作用強(qiáng)、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用、無交叉耐藥等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體腫瘤的治療，已成為當(dāng)前化療聯(lián)合療法中最常用的藥物之一[5]。然而嘔吐作為順鉑使用過程中嚴(yán)重的不良反應(yīng)往往導(dǎo)致患者化療的中斷[6]，影響了化療效果，亟需開發(fā)切實(shí)有效的止嘔藥物進(jìn)行緩解。半夏厚樸湯由半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉組成，作為止嘔要方，在臨床嘔吐的治療中療效確切[7]。本研究采用順鉑誘發(fā)的水貂嘔吐模型研究半夏厚樸湯的止嘔效果并對其潛在的機(jī)制進(jìn)行探究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，順鉑能夠誘發(fā)水貂出現(xiàn)較為嚴(yán)重的干嘔和嘔吐癥狀，采用半夏厚樸湯治療后，動物干嘔和嘔吐的次數(shù)明顯減少，表明半夏厚樸湯具有治療順鉑誘發(fā)的嘔吐作用。

研究表明，順鉑誘發(fā)的惡心、嘔吐，與其能夠直接影響嘔吐中樞神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)SP表達(dá)有關(guān)[8]，大腦最后區(qū)異常表達(dá)產(chǎn)生的SP能夠激活NK1R受體[9]，促進(jìn)下游ERK1/2的磷酸化誘發(fā)嘔吐的發(fā)生。因此，本研究分離水貂大腦最后區(qū)并對其中的SP表達(dá)水平以及NK1R相關(guān)通路的蛋白水平進(jìn)行檢測。

研究結(jié)果表明，模型組順鉑能夠促進(jìn)水貂大腦最后區(qū)SP和NK1R的表達(dá)，并促進(jìn)下游的ERK1/2的磷酸化，這與文獻(xiàn)中的報(bào)道相一致[10]；而半夏厚樸湯能夠明顯減少SP和NK1R的表達(dá)，并抑制ERK1/2的磷酸化，減少該信號通路的活化，從而發(fā)揮治療順鉑誘發(fā)的嘔吐作用。

綜上所述，半夏厚樸湯具有治療順鉑所致的水貂的干嘔和嘔吐作用，其作用機(jī)制可能與半夏厚樸湯抑制大腦最后區(qū)SP/NK1R信號通路活化有關(guān)。半夏厚樸湯為經(jīng)典方劑，組方簡單、毒副作用較小，在治療嘔吐方面具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究對半夏厚樸湯用于癌癥減毒增效的新藥研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其更為確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。