山西省酸棗遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析

胡曉艷，杜淑輝，王兆山，韓有志＊

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北方功能油料樹種培育與研發(fā)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030800；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

野生種質(zhì)資源具有豐富的遺傳變異，能抵御各類生物或非生物脅迫的影響，其蘊(yùn)含的有益基因?qū)τ谠耘嘀参镞z傳改良至關(guān)重要。然而，由于生境破壞以及全球氣候變化等對(duì)野生居群存續(xù)和自然進(jìn)化的影響，其保護(hù)甚為迫切[1]。開展野生種質(zhì)資源遺傳多樣性研究有助于制定其保護(hù)策略。酸棗（Ziziphus jujuba var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chow）是栽培棗的近緣野生種質(zhì)，在我國(guó)分布范圍廣泛，華北、西北、東北和華東等地區(qū)均有分布，集中分布在山西、陜西、河北、山東等地[2]。酸棗適應(yīng)能力強(qiáng)，抗旱耐寒、耐貧瘠，樹勢(shì)強(qiáng)健，根系深廣發(fā)達(dá)，具有很強(qiáng)的水土保持作用。由于人為活動(dòng)的影響和資源的不合理開發(fā)利用，酸棗的分布正日益縮減[3]。開展酸棗種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，將為其有效保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)推動(dòng)棗相關(guān)育種研究進(jìn)程[4]。山西省是我國(guó)紅棗主要產(chǎn)區(qū)之一，也是酸棗主要分布區(qū)之一，但是目前酸棗資源面積逐年減少，開發(fā)利用嚴(yán)重不足[3]。

單拷貝核基因標(biāo)記（single-copy nuclear gene markers）具有易于擴(kuò)增測(cè)序、含有大量SNPs、不存在譜系分選等優(yōu)點(diǎn)，目前在植物遺傳多樣性及譜系地理研究中得到廣泛應(yīng)用[5-6]。栽培棗基因組序列的公布[7-8]，使得利用生物信息學(xué)方法挖掘棗屬物種中通用的單拷貝核基因標(biāo)記成為可能。本研究篩選酸棗中的單拷貝核基因標(biāo)記并分析山西省酸棗居群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為后續(xù)酸棗資源的保護(hù)及可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

圖1 采樣點(diǎn)分布圖Fig. 1 Distribution of sample sites in Shanxi

1.1 樣品采集

本研究采集了山西省14 個(gè)野生酸棗居群213 個(gè)單株的葉樣。采樣地點(diǎn)、居群編號(hào)、樣品個(gè)數(shù)等具體信息見圖1、表1。選取居群內(nèi)生長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害的單株，且相鄰單株間距至少100 m，采集新鮮葉片置于變色硅膠中帶回實(shí)驗(yàn)室用于總DNA 的提取。

1.2 標(biāo)記篩選與擴(kuò)增測(cè)序

使用改良的CTAB 法提取總DNA。所提DNA經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后于－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用以下方法篩選酸棗中的單拷貝核基因標(biāo)記：（1）利用Duarte 等[9]提供的單拷貝核基因標(biāo)簽在GENE（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）中檢索，獲得相應(yīng)的核苷酸序列；（2）將核苷酸序列在棗基因組中進(jìn)行BLAST 檢索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PR OG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=megaBlast&BLAST_SPEC=OGP__326968__182558)，以確定棗基因組中與其同源的序列，將此同源序列確定為參考序列；（3）利用參考序列進(jìn)行核苷酸BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 以確定所選基因在棗基因組中為單拷貝；（4）根據(jù)選定的參考序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。通過(guò)檢索分析初步篩選了50 個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記并設(shè)計(jì)了相應(yīng)引物。選取3 個(gè)居群總共15 個(gè)樣品（DTYG、JZTG、YCRC 各5 個(gè)樣品）對(duì)篩選出的單拷貝核基因標(biāo)記的變異情況進(jìn)行檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增采用25 μL 體系：50 ng DNA，dNTP 0.24 mmol·L－1，Mg2+2.0 mmol·L－1， Taq 酶1.5 U， 引 物0.24 μmol·L－1（所有試劑均為北京擎科生物科技有限公司生產(chǎn)）。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火90 s（退火溫度隨引物而定），72℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后采用DNA 純化試劑盒（ Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway, USA） 純化后， 利用ABI3730 DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Califonia,USA) 直接測(cè)序。擴(kuò)增和測(cè)序采用相同引物。在標(biāo)記篩選時(shí)未選用含有poly-結(jié)構(gòu)的參考序列，因此，不存在需要使用克隆測(cè)序的情況。當(dāng)所選標(biāo)記在15 個(gè)樣品中擴(kuò)增或測(cè)序結(jié)果差，或不包含變異信息時(shí)，棄用該標(biāo)記。最終確定6 個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記對(duì)所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序（表2），PCR 擴(kuò)增和測(cè)序步驟與標(biāo)記篩選時(shí)一致。經(jīng)過(guò)擴(kuò)增測(cè)序得到了所有酸棗樣品在6 個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記的序列數(shù)據(jù)。

表1 酸棗居群采樣信息 Table 1 Sampled populations of Z. jujuba var. spinosa in this study

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

測(cè)序結(jié)果處理時(shí)遵循簡(jiǎn)并堿基的原則。所有序列數(shù)據(jù)采用軟件ClustalX[10]比對(duì)，并在BioEdit[11]中進(jìn)行校正后輸出用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)文件。利用DnaSp5.10[12]對(duì)每個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記計(jì)算如下參數(shù)：多態(tài)核苷酸位點(diǎn)數(shù)目(S)、單倍型多樣性(Hd)[13]、π(一對(duì)序列間每堿基平均差異值)[14]、基于多態(tài)核苷酸位點(diǎn)數(shù)目S的Watterson’s 參數(shù)θw[15]、Tajima’D中性檢驗(yàn)(顯著性檢驗(yàn)由999 次聯(lián)合模擬計(jì)算得到)[16]、重組事件(Rm) 和居群間基因流Nm。利用DnaSp5.10 計(jì)算居群水平的遺傳多樣性參數(shù)S、Hd、π和θw。同時(shí)利用DnaSp5.10中的失配分布分析(Mismatch distribution analysis)[17]檢驗(yàn)居群歷史動(dòng)態(tài)，當(dāng)居群大小保持相對(duì)穩(wěn)定時(shí)，失配分布曲線會(huì)呈多峰分布；當(dāng)居群經(jīng)歷擴(kuò)張或持續(xù)增長(zhǎng)時(shí)，失配分布曲線一般會(huì)呈現(xiàn)單峰。利用Arlequin 3.5.1.3[18]中的分子方差分析(AMOVA) 計(jì)算在每個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記物種內(nèi)居群間以及居群內(nèi)差異對(duì)總變異的貢獻(xiàn)率(顯著性檢驗(yàn)利用999次重復(fù)模擬得到）和居群間遺傳分化指數(shù)Fst[19](顯著性檢驗(yàn)利用999 次重復(fù)模擬得到)，同時(shí)計(jì)算兩兩居群間遺傳距離。使用GenAlEx 6.5[19]中的Mantel test檢驗(yàn)遺傳距離和地理距離之間的相關(guān)性。采用STRUCTURE 2.3.4[20]進(jìn)行群體水平的遺傳結(jié)構(gòu)分析，參數(shù)設(shè)置如下：選用混合模型（admixture model） 和群體間相關(guān)聯(lián)的等位基因頻率模型（ correlated alleles frequencies）， length of burnin 長(zhǎng)度設(shè)置為500 000，馬爾科夫鏈蒙特卡洛迭代次數(shù)（MCMC replicates after burn-in）設(shè)置為2 000 000，分類數(shù)目（K）值范圍為1～10，每個(gè)K值重復(fù)計(jì)算10 次。利用最大值ΔK對(duì)應(yīng)的K值確定為最佳K值[21]。

2 結(jié)果

2.1 山西酸棗遺傳多樣性

6 個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記的長(zhǎng)度在199～846 bp 之間，分離位點(diǎn)數(shù)目和單倍型多樣性的變化區(qū)間為7～64 和0.663～0.979；核苷酸多樣性參數(shù)π和θw的平均值分別為0.007 20 和0.009 25；Rm的平均值為8，表明酸棗基因組內(nèi)重組事件發(fā)生頻率較高（表3）。在居群水平上，單倍型多樣性平均值為0.986，π和θw的平均值分別為0.006 50 和0.005 43，多樣性較高的居群如YQYX（π=0.007 89，θw=0.007 19），較低的如XZDX（π=0.005 02，θw=0.003 48）（表4）。

表3 6 個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記多樣性Table 3 Nucleotide variation of single-copy nuclear gene markers

表4 14 個(gè)山西省酸棗居群遺傳多樣性水平Table 4 Nucleotide variation of 14 Z. jujuba var. spinosa populations in Shanxi

2.2 山西酸棗遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA 分析結(jié)果（表5）表明：居群內(nèi)變異占總變異的85.48%，居群分化指數(shù)Fst平均值為0.145，表明山西省酸棗居群間基因交流平均水平較低，這與Nm分析結(jié)果基本一致（Nm平均值為1.33）。居群間遺傳距離結(jié)果（表6）表明：XZDX和DTYG 間遺傳距離最大（0.360），YCRC 和CZQX 間最低（0.025）。Mantel test 檢驗(yàn)表明：居群間地理距離與遺傳距離沒有相關(guān)性（r=0.177 5，P=0.216）。STRUCTU 分析顯示：當(dāng)K=2 時(shí)，山西省酸棗居群有最佳聚類結(jié)果，并沒有形成明顯的遺傳結(jié)構(gòu)，部分居群間個(gè)體遺傳組成差異較大（如DTYG 和JZTG）（圖2）。

表5 山西酸棗居群遺傳結(jié)構(gòu)分析Table 5 AMOVA and Fst analysis of Z. jujuba var. spinosa populations in Shanxi

表6 山西酸棗居群間遺傳距離Table 6 Genetic differentiation between Z. jujuba var. spinosa populations in Shanxi

圖2 STRUCTURE 運(yùn)行結(jié)果圖Fig. 2 Result of STRUCTURE

2.3 山西酸棗居群動(dòng)態(tài)

Tajima’D檢驗(yàn)結(jié)果均不顯著且大部分為負(fù)值，表明所選用的單拷貝核基因標(biāo)記符合中性進(jìn)化假設(shè)，且山西酸棗居群在進(jìn)化歷史上可能經(jīng)歷過(guò)居群擴(kuò)張（表3）。失配分析結(jié)果呈現(xiàn)明顯的單峰，表明山西省酸棗自然野生居群歷史上經(jīng)歷過(guò)擴(kuò)張，這與Tajima’D 檢測(cè)結(jié)果一致（圖3）。

圖3 失配分布分析結(jié)果Fig. 3 Result of mismatch distribution analysis

3 討論

3.1 酸棗單拷貝核基因標(biāo)記的篩選

基因組復(fù)制事件和高水平的序列變異是導(dǎo)致單拷貝核基因標(biāo)記篩選困難的主要原因[22]。例如在566 個(gè)中國(guó)白櫟組（section Quercus）單拷貝核基因標(biāo)記中，僅有19 個(gè)標(biāo)記能夠在本組不同物種間通用[5]。雖然棗近期沒有發(fā)生過(guò)全基因組復(fù)制事件，但是棗染色體融合與片段復(fù)制事件發(fā)生頻率很高[7]，這在一定程度上導(dǎo)致單拷貝核基因標(biāo)記篩選的困難。標(biāo)記篩選過(guò)程中，在棗基因組中成功檢索到50 個(gè)單拷貝核基因序列并設(shè)計(jì)了特異引物，但僅有6 個(gè)單拷貝核基因能夠在所有樣品中成功擴(kuò)增并測(cè)序。據(jù)估計(jì)，在植物基因組中大約有10%的基因?yàn)閱慰截怺9]。在棗基因組注釋到的32 808 個(gè)功能基因中[7]，單拷貝基因的個(gè)數(shù)在3 000 個(gè)左右，因此，未來(lái)能夠挖掘更多的單拷貝基因標(biāo)記應(yīng)用于酸棗和棗居群遺傳學(xué)和譜系地理學(xué)等相關(guān)研究中。

3.2 山西酸棗的遺傳多樣性

在位點(diǎn)水平上，分布于山西的酸棗表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平（π=0.007 20，θw=0.009 25），比在我國(guó)分布的其他物種如中國(guó)山楊（Populus davidiana Dode）（π=0.004 40，θw=0.007 50）[23]、甘蒙檉柳（Tamarix austromongolica Nakai）（π=0.002 59）[24]、沙芥[Pugionium cornntum (L.) Gaertn]（π=0.005 32）[25]的遺傳多樣性水平高。使用其他類型分子標(biāo)記技術(shù)的研究（如SSR、RAPD 等）也表明自然分布的酸棗具有較高的遺傳多樣性水平，積累了豐富的遺傳變異[26-27]。物種遺傳多樣性水平受取樣代表性、自然選擇、繁育系統(tǒng)及居群歷史等因素的影響[23]。本研究的取樣范圍覆蓋山西省，因此，可以排除取樣代表性對(duì)本研究結(jié)果的影響。Tajima’D 中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，6 個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記均符合中性進(jìn)化假設(shè)，因此，可以排除自然選擇的影響。酸棗為異交植物，異交可以增加物種的有效群體大小和有效重組率，從而提高遺傳多樣性水平[28]，并且自然狀態(tài)下酸棗居群內(nèi)很少發(fā)生近交繁殖[27]。第四紀(jì)冰期循環(huán)對(duì)北半球物種的多樣性與分布產(chǎn)生了重大的影響[29-30]，但在我國(guó)黃土高原地區(qū)冰期循環(huán)對(duì)物種的影響非常小，冰蓋也僅僅在黃土高原南部部分地區(qū)形成，持續(xù)時(shí)間非常短[31]。因此，分布于山西省的酸棗受第四紀(jì)冰期循環(huán)的影響非常小，可以保留大量的遺傳變異。同時(shí)，本研究中失配分布分析表明，山西省酸棗居群經(jīng)歷過(guò)居群擴(kuò)張，也支持了上述推論。

3.3 山西酸棗的遺傳結(jié)構(gòu)

本研究發(fā)現(xiàn)，分布于山西省的酸棗居群間遺傳距離差異較大（0.025～0.360）（表6），表明酸棗居群之間的基因交流存在較大的變化，由于Mantel test 表明地理距離與遺傳距離之間沒有相關(guān)性，因此，這可能與居群之間是否存在明顯的地理隔離（如山脈、河流）或人類活動(dòng)等因素相關(guān)。地理隔離可以阻礙居群之間的基因交流，而人類活動(dòng)有時(shí)可以打破這種阻礙[32]，因此，山西省酸棗居群間遺傳距離差異是上述因素共同作用的結(jié)果。整體上居群間表現(xiàn)出較高水平的遺傳分化（Fst=0.145）且基因流較小（Nm=1.33），但居群內(nèi)的變異是總體變異的主要來(lái)源（表3、5）。張春梅等[27]研究了黃河流域3 個(gè)酸棗居群的遺傳分化水平，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)居群間分化水平非常低（Fst=0.017～0.039）且基因流較高，推測(cè)黃河水流攜帶種子傳播是導(dǎo)致黃河流域3 個(gè)酸棗居群出現(xiàn)低分化水平的主要原因。Zhang等[33]進(jìn)一步對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)酸棗居群的遺傳分化水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)酸棗居群間遺傳分化指數(shù)Fst為0.12。Zhang 等[33]指出，河流在酸棗居群間基因交流中（種子傳播）發(fā)揮著重要的作用；但本研究中，采樣居群間無(wú)河流連接，因此，居群間種子傳播的可能性非常小，同時(shí)酸棗花粉活力弱，擴(kuò)散能力不強(qiáng)[34]。上述因素是導(dǎo)致山西省酸棗居群間表現(xiàn)出較高水平遺傳分化的主要原因。隨著人類活動(dòng)的加劇，同時(shí)由于酸棗在棗培育過(guò)程中的使用及其種仁蘊(yùn)含的藥用價(jià)值，酸棗資源不合理開發(fā)利用的情況日益嚴(yán)重，使酸棗這一寶貴的野生果樹資源得不到有效的保護(hù)與開發(fā)利用。本研究發(fā)現(xiàn)，分布于山西中部及南部的酸棗居群普遍表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平，因此，在未來(lái)一方面應(yīng)該加強(qiáng)保護(hù)，防止多樣性丟失；另一方面應(yīng)加強(qiáng)人工馴化栽培、就地?fù)嵊脑斓裙ぷ?，利用好這一寶貴的種質(zhì)資源[3]。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法篩選了酸棗中的6 個(gè)單拷貝核基因標(biāo)記并將其應(yīng)用于山西酸棗居群遺傳學(xué)相關(guān)研究，這為未來(lái)我國(guó)酸棗種質(zhì)資源遺傳學(xué)及譜系地理學(xué)等研究提供了重要的技術(shù)支持。通過(guò)對(duì)山西省酸棗居群遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及居群歷史動(dòng)態(tài)的初步分析，發(fā)現(xiàn)山西省酸棗表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平，繁育系統(tǒng)及居群歷史動(dòng)態(tài)是影響遺傳多樣性的主要原因。山西省酸棗居群之間表現(xiàn)出較高水平的遺傳分化，未來(lái)應(yīng)對(duì)分布于山西中部及南部地區(qū)的酸棗居群加強(qiáng)保護(hù)與開發(fā)利用。本研究的開展為深入進(jìn)行山西省及我國(guó)酸棗種質(zhì)資源保護(hù)、可持續(xù)開發(fā)利用等奠定了基礎(chǔ)。