基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路探討針刺對(duì)超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷及骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響

劉祥華，羅湘筠，李文倩

作者單位：湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院（湖南省直中醫(yī)醫(yī)院）針灸科，湖南 株洲412000

近年來，隨著人們對(duì)體育競技的重視，出現(xiàn)超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)損傷的人日益增加。長時(shí)間或大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌纖維會(huì)出現(xiàn)損傷，不僅會(huì)出現(xiàn)延遲性肌肉酸痛現(xiàn)象同時(shí)會(huì)伴隨肌力下降，嚴(yán)重影響正常生活［1］。研究表明：超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后，會(huì)使得骨骼肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的肌酸激酶進(jìn)入血液循環(huán)，使得肌酸激酶可以作為骨骼肌微細(xì)損傷的重要指標(biāo)［2］?，F(xiàn)階段有生物或化學(xué)藥物改善超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌損傷，但這些藥物會(huì)在體內(nèi)留下代謝垃圾甚至有一定的毒副作用［3］。針灸是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方式，相對(duì)藥物治療具有一定的優(yōu)勢［4］。尚畫雨等［5］研究證明：針刺可以緩解超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后的延遲性肌肉酸痛，同時(shí)具有促進(jìn)骨骼肌恢復(fù)的效果。劉曉然等［6］研究證明：針刺可以有效抑制超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌骨架蛋白的解聚或降解，并加強(qiáng)骨架蛋白的合成代謝。本研究于2018年12月至2019年6月進(jìn)行，旨在研究針刺足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴等穴位對(duì)超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷及骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響，以期了解針刺對(duì)超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷及骨骼肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，從而為超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)6周齡SD大鼠60只，購于湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（湘）2017-0054；醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2016-0004，所有SD大鼠分12個(gè)籠子飼養(yǎng)，每個(gè)籠子5只。所有SD大鼠均在湖南省直中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對(duì)濕度50%～65%，本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2藥物與試劑丙二醛、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）和琥珀酸脫氫酶（Succinic acid dehydrogenase，SDH）試劑盒均購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；肌酸激酶試劑盒子購于北京吉美生物技術(shù)有限公司；蘇木素、伊紅購于武漢博士得生物有限公司；中性甲醛、乙醇、二甲苯購于天津科密歐有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒購于杭州四季青生物工程材料有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）等一抗蛋白購于美國Santa Cruz公司；蛋白抑制劑、辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗蛋白購于美國Thermo公司。

1.3儀器BS-124s型電子天平購于北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TGL-16M低溫離心機(jī)購于濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購于上海光學(xué)儀器廠；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購于美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR公司；LD-66實(shí)驗(yàn)室切片機(jī)購于長沙益廣制藥機(jī)械公司；流式細(xì)胞儀購于賽默飛世爾科技有限公司。

1.4方法

1.4.1 分組及超負(fù)荷運(yùn)動(dòng) 將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：空白組（Control，C）、超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（Overload，O）、針刺組（Acupuncture，A）和超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組（Overload and Acupuncture，OA），每組各15只；空白組不做任何處理；超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組和超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組均建立超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型，具體操作如下：在100 cm×100 cm×100 cm的游泳池中，注入70 cm深的水，保持溫度在32～35℃，每次持續(xù)訓(xùn)練120 min，訓(xùn)練前60 min讓SD大鼠適應(yīng)水性，后60 min負(fù)重大鼠體質(zhì)量5%的重物，第2周開始120 min均讓大鼠負(fù)重其體質(zhì)量8%的重物。

1.4.2 針刺干預(yù) 各組SD大鼠針刺按照2003年《實(shí)用動(dòng)物針灸手冊》［7］標(biāo)準(zhǔn)，在超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后針刺SD大鼠雙側(cè)足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴，每日1次，每次留針20 min。

1.5檢測項(xiàng)目

1.5.1 氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)檢測 各組SD大鼠完成針刺干預(yù)后12 h內(nèi)，使用腹腔注射10%水合氯醛麻醉，行頸部脫臼處死，頸動(dòng)脈采血并保存在-80℃超低溫冰箱中，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用；切下SD大鼠骨骼肌，使用0.9%氯化鈉溶液沖洗，剪碎置于勻漿器內(nèi)勻漿，研磨后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，在4℃恒溫下，以3 700 r/min，離心5 min，取沉淀使用超聲破碎儀破碎線粒體并加入倒入1.5 mL裂解液，使用丙二醛、SOD、GSH-Px、SDH試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行檢查其水平。

1.5.2 血清中肌酸激酶活性檢測 取上述各組SD大鼠血清，在4℃的恒溫離心機(jī)中以3 000 r/min速度離心10 min，按照肌酸激酶試劑盒子操作說明書方法檢測各組SD大鼠血清中肌酸激酶含量水平。

1.5.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 取SD大鼠骨骼肌，使用剪刀剪碎，使用胰蛋白酶消化成單層細(xì)胞后，使用恒溫離心機(jī)保持4℃，離心5 min收集細(xì)胞；收集細(xì)胞后加入100μL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）重懸細(xì)胞并加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶（PI），輕輕混勻；室溫避光孵育15 min并加入400μL Binding Buffer使用流式細(xì)胞儀檢測SD大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡情況。

1.5.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測蛋白表達(dá)水平 使用蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Akt、P-Akt、PI3K蛋白，取大鼠骨骼肌，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠骨骼肌情況 HE染色觀察大鼠骨骼肌，使用二甲苯浸泡、不同梯度乙醇脫水、蘇木精浸泡、鹽酸乙醇分化、沖洗、伊紅染色、乙醇浸泡、二甲苯浸泡后中性樹膠封片即并在400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠骨骼肌組織情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0，作圖采用軟件為GraphPda Prism5，計(jì)量資料采用xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，當(dāng)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用SNK方法進(jìn)行進(jìn)一步的多重比較，若P＜0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠氧化應(yīng)激情況由表1可以看出，相比空白組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠丙二醛水平顯著升高，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著降低（P＜0.05）；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠丙二醛水平顯著降低，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，針刺組大鼠丙二醛水平顯著降低，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著升高（P＜0.05）；相比針刺組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠丙二醛水平顯著升高，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/

表1 各組大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/

注：GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶，SDH為琥珀酸脫氫酶。與空白組相比，aP＜0.01；與超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組相比，bP＜0.01；與針刺組相比，cP＜0.01

SDH/（kU/L）35.75±8.78 10.58±6.50a 31.25±5.50b 24.28±4.99bc 41.517＜0.001組別空白組超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組針刺組超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組F值P值鼠數(shù) 1 5 15 15 15丙二醛/（mol/L）4.75±0.29 13.97±0.55a 4.99±0.32b 7.89±0.41bc 1 681.193＜0.001 GSH-Px/（kU/L）142.25±8.39 55.68±6.97a 130.25±7.14b 135.58±8.14bc 416.066＜0.001 SOD/（kU/L）2.50±0.25 1.02±0.17a 2.38±0.30b 2.10±0.21bc 121.047＜0.001

2.2各組大鼠骨骼肌凋亡情況相比空白組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，針刺組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；相比針刺組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。相比空白組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，針刺組大鼠細(xì)胞凋亡水平顯著降低（P＜0.05）；相比針刺組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠細(xì)胞凋亡水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡水平顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖1、圖2。

2.3各組大鼠骨骼肌損傷情況由圖3可以看出，相比空白組大鼠腸骨骼肌肌肉組織正常，肌外膜完整，可見血管及神經(jīng)；肌束膜包裹肌纖維，肌纖維完整，肌細(xì)胞核大小形態(tài)未見異常；超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌肌肉組織肌纖維彎曲，肌紅蛋白溶解，肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；針刺組大鼠腸骨骼肌肌肉組肌正常肌肉組織，肌外膜完整，可見血管及神經(jīng)；超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠少量肌纖維斷裂溶解彎曲，余未見異常。相比空白組肌酸激酶水平（457.54±45.02）kU/L，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠血清肌酸激酶水平顯著升高至（1 985.50±88.87）kU/L；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組肌酸激酶水平，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠肌酸激酶水平顯著降低至（1 402.51±64.50）kU/L（F＝485.60，P＜0.001）。

表2 各組大鼠骨骼肌凋亡檢測結(jié)果/

表2 各組大鼠骨骼肌凋亡檢測結(jié)果/

注：Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，β-actin為β-肌動(dòng)蛋白，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Caspase-3為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。與空白組相比，aP＜0.01；與超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組相比，bP＜0.01；與針刺組相比，cP＜0.01

細(xì)胞凋亡率/%9.89±1.02 32.58±3.50a 11.52±1.02b 22.58±2.51bc 323.283＜0.001組別空白組超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組針刺組超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組F值P值鼠數(shù) 1 5 15 15 15 Bcl-2/β-actin值1.62±0.20 0.41±0.10a 1.25±0.15b 0.82±0.09bc 204.690＜0.001 Bax/β-actin值0.55±0.09 1.59±0.19a 0.56±0.10b 1.52±0.18bc 231.524＜0.001 Caspase-3/β-actin值0.35±0.08 1.53±0.25a 0.52±0.09b 1.38±0.18bc 194.899＜0.001

注：Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Caspase-3為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，β-actin為β-肌動(dòng)蛋白，C為空白組，O為超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，A為針刺組，OA為超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組

2.4各組大鼠PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況由表3、圖4可以看出；相比空白組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，針刺組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；相比針刺組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。各組Akt水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況/

表3 各組大鼠PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況/

注：PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶，β-actin為β-肌動(dòng)蛋白，Akt為蛋白激酶B，p-AKT為磷酸化蛋白激酶B，m-TOR為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白。與空白組相比，aP＜0.01；與超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組相比，bP＜0.01；與針刺組相比，cP＜0.01

mTOR/β-actin值1.55±0.25 0.51±0.20a 1.54±0.18b 1.32±0.21bc 81.006＜0.001組別空白組超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組針刺組超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組F值P值鼠數(shù) 1 5 15 15 15 PI3K/β-actin值1.61±0.20 0.75±0.15a 1.55±0.18b 1.18±0.14bc 82.528＜0.001 Akt/β-actin值1.02±0.12 1.03±0.11 1.01±0.10 1.03±0.11 0.113 0.952 p-AKT/β-actin值1.60±0.22 0.45±0.14a 1.53±0.21b 1.30±0.20bc 110.427＜0.001

圖4 各組大鼠PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

針刺是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法，使用針刺治療骨骼肌已有較長歷史且療效顯著［8］。使用針刺穴位可以將局部刺激信號(hào)通過組織間機(jī)械力的傳導(dǎo)傳遞給周邊組織，使得機(jī)體產(chǎn)生一系列的反應(yīng)，例如脂質(zhì)過氧化、線粒體游離鈣的聚積、改變線粒體內(nèi)膜通透性等［9］。本實(shí)驗(yàn)探究通過使用針刺超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷大鼠足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴，檢測器氧化應(yīng)激損傷及骨骼肌細(xì)胞凋亡情況，初步了解針刺超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷的治療機(jī)制。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為：足三里、腎俞兩穴位可以平衡陰陽，益精補(bǔ)腎增加體能，具有保健作用［10］。針刺腎俞穴可以加強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減少自由基的累積，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)陰陽平衡。陽陵泉穴歸屬足少陽膽，內(nèi)關(guān)穴是手厥陰心包經(jīng)的常用腧穴之一，針刺這兩個(gè)穴位可以有效刺激免疫系統(tǒng)，同時(shí)具有養(yǎng)心安神、醒神開竅的作用［11］。可以使得超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后快速恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，使用針刺后大鼠骨骼肌均未出現(xiàn)肌紅蛋白溶解，肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂等情況，且骨骼肌微細(xì)損傷的重要指標(biāo)肌酸激酶含量水平也顯著降低，說明使用針刺可以有效緩解大鼠超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌的損傷。這可能是因?yàn)榇碳ぷ闳?、腎俞可以調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)陰陽平衡、益精補(bǔ)腎，增強(qiáng)大鼠對(duì)氧自由基的抵抗能力增強(qiáng)，同時(shí)調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體內(nèi)膜的鈣離子平衡，達(dá)到保護(hù)骨骼肌線粒體外模及增加抗疲勞能力，實(shí)現(xiàn)保護(hù)超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌的效果。

超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后氧化應(yīng)激是導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞損傷造成細(xì)胞損傷的重要因素之一［12］。在健康的細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，但是超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞膜通透性增，使得細(xì)胞內(nèi)的SOD、GPX等酶釋放至細(xì)胞外［13］。丙二醛的含量可以反映機(jī)體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度，使自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)并使得氧化產(chǎn)物分解［14］。SOD具有抗氧化性，是經(jīng)典的抗氧化酶之一，可以有效清除活性氧。機(jī)體內(nèi)SOD水平越高說明機(jī)體清除活性氧的能力越強(qiáng)，當(dāng)腦組織損傷時(shí)其含量會(huì)顯著降低［15］。SDH是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，可連接氧化磷酸化與電子傳遞，在有氧運(yùn)動(dòng)中起著關(guān)鍵的作用。SDH主要分布在線粒體中，為有氧呼吸提供電子，其活性直接影響著能量代謝的過程，SDH活性增強(qiáng)，組織的氧利用能力就會(huì)提高。本研究中發(fā)現(xiàn)，相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，使用針刺后丙二醛水平顯著降低，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著升高。說明使用針刺有效降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激，這可能是因?yàn)橥ㄟ^針刺物理刺激大鼠足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴等穴位后使得大鼠的增強(qiáng)線粒體SOD活性增強(qiáng)，其消除自由基的能力也顯著增強(qiáng)，并且減少了運(yùn)動(dòng)中的氧化應(yīng)激，從而減輕了大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化；保護(hù)了線粒體膜，抑制了骨骼肌線粒體游離鈣的聚積，反之進(jìn)一步抑制脂質(zhì)過氧化作用，實(shí)現(xiàn)有效降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。孫嫘等［16］研究表明：針刺可以有效降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，與本研究得出的結(jié)論相類似。

骨骼肌細(xì)胞凋亡在大鼠超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷中起著關(guān)鍵的作用，而骨骼肌的凋亡受相關(guān)基因的調(diào)控［17］。Bcl-2家族是一種常見的凋亡控制基因。Bcl-2家族中主要是由Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達(dá)量決定細(xì)胞是否凋亡［18］。Bax和Bcl-2表達(dá)呈相反趨勢，當(dāng)Bcl-2表達(dá)下降時(shí)Bax表達(dá)上升，此時(shí)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；當(dāng)Bcl-2表達(dá)升高，而Bax表達(dá)降低時(shí)，則會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡。除了Bcl-2家族，Caspase家族的Caspase-3、Caspase-9等是重要的凋亡因子［19］。Caspase家族主要執(zhí)行凋亡基因?yàn)镃aspase-3，其機(jī)制依靠凋亡因子啟動(dòng)子作用有活性的Caspase-9使得proCaspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3。并通過剪切另外的Caspase底物，達(dá)到引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)的目的最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，OA組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低。這可能是因?yàn)槌?fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌細(xì)胞膜受到損傷后鈣離子會(huì)大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)會(huì)引起骨骼肌肌原纖維的損傷，同時(shí)抑制線粒體的氧化代謝酶、激活細(xì)胞內(nèi)凋亡因子的產(chǎn)生，抑制抑凋亡因子的產(chǎn)生，引發(fā)細(xì)胞的凋亡。陳英華、郝志平［21］研究表明：針刺可以升高Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)并降低Bax陽性細(xì)胞表達(dá)，與本研究得出的結(jié)論相類似。

PI3K/Akt即磷脂酰肌醇-3-/蛋白激酶，這條信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要的作用。劉玫梅等［22］研究表明：PI3K活化后的Akt可作用于Bcl-2、Bax等底物，抑制細(xì)胞凋亡從而保護(hù)骨骼肌細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，相比超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組，超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)+針刺組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著升高。這可能是因?yàn)榇碳ご笫蟮淖闳?、陽陵泉、?nèi)關(guān)和腎俞穴后，促進(jìn)了PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)Akt的磷酸化，并進(jìn)一步干預(yù)其下游相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌的凋亡。陳玄等［23］研究表明：使用電針刺激足三里和上巨虛減少骨骼肌細(xì)胞的凋亡，與本研究得出的結(jié)論相類似。

綜上所述，針刺可以通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路抑制大鼠氧化應(yīng)激和骨骼肌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)治療超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷。其作用機(jī)制可能是通過針刺調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)促進(jìn)其下游的抑凋亡因子的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制骨骼肌的凋亡，同時(shí)抑制大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。但本研究仍存在不足之處，本研究使用的針刺方法較為單一，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步使用不同針刺方法及針刺不同穴位，觀察其作用效果。

（本文圖2，3見插圖12-4）