白細胞分化抗原38、白細胞分化抗原138聯(lián)合宮腔鏡檢查對反復胚胎移植失敗病人慢性子宮內(nèi)膜炎的診斷價值

徐漢杰，張雨，鄭圣霞，劉雨生，吳大保，趙衛(wèi)東

作者單位：1中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院），a婦產(chǎn)科，b生殖醫(yī)學中心，安徽 合肥230001；2安徽省婦幼保健院婦產(chǎn)科，安徽 合肥230001

隨著輔助生殖技術的不斷發(fā)展，現(xiàn)階段體外受精和胚胎移植一個周期后的妊娠率高達60%，但仍有相當一部分病人出現(xiàn)反復胚胎移植失敗（Repeated Implantation Failure，RIF）。2005年歐洲人類生殖及胚胎協(xié)會將RIF定義為3次以上高質(zhì)量胚胎移植而未妊娠或多次胚胎移植中，合計移植＞10個胚胎仍未妊娠［1］。常見原因是基因異常、內(nèi)分泌功能障礙、血栓性疾病、自身免疫性疾病、黃體功能不全，但仍有一部分病人無法找到病因［2］。近年，越來越多的生殖遺傳學家認為慢性子宮內(nèi)膜炎（Chronic Endometritis，CE）與RIF的發(fā)生密切相關［3-5］。

CE是一種發(fā)生在子宮內(nèi)膜的慢性炎癥，大多數(shù)病人無臨床癥狀或僅表現(xiàn)為異常子宮出血、盆腔疼痛等輕微癥狀，其診斷的必備條件為在子宮內(nèi)膜間質(zhì)中存在漿細胞［6-7］。在實際工作中，采用傳統(tǒng)的蘇木精-伊紅（HE）染色難以區(qū)分漿細胞與單核細胞及子宮內(nèi)膜間質(zhì)的成纖維細胞，已有大量研究指出，白細胞分化抗原38（Cluster of Differentiation 38，CD38）、白細胞分化抗原138（Cluster of Differentiation 138，CD138）能特異的表達在漿細胞的細胞質(zhì)或細胞膜表面，為CE的診斷提供新的策略。但CE病人無癥狀或臨床癥狀輕微以及子宮內(nèi)膜組織取材的局限性，導致CE的準確診斷率仍不高。本研究擬初步了解CE在RIF病人中的患病率，同時探討CD38、CD138免疫組化聯(lián)合宮腔鏡檢查診斷CE的應用價值，為CE的診斷提供新的策略。

1 資料與方法

1.1一般資料選取中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院2017年2月至2019年6月RIF病人，納入標準：年齡＜40歲，彩超及子宮輸卵管造影未見明顯異常，行3次或以上胚胎移植失敗或至少累積移植6個高質(zhì)量的胚胎失敗。排除標準：月經(jīng)周期第3天卵泡刺激素（Follicle-Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）＞10 UI/L、體質(zhì)量指數(shù)（Body Mass Index，BMI）＞30 kg/m2、反復流產(chǎn)史、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜結核、黏膜下肌瘤、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜異位囊腫、子宮腺肌癥、免疫性疾病。以上所有病人簽署宮腔鏡檢查知情同意書并在卵泡期（月經(jīng)干凈3～7 d）行宮腔鏡檢查及子宮內(nèi)膜活檢術，取出的子宮內(nèi)膜組織行HE染色及CD38、CD138免疫組化染色，研究方案經(jīng)安徽省立醫(yī)院倫理委員會批準（P-019），所有入組病人已完成必要的輔助檢查，并簽署知情同意書。

1.2宮腔鏡檢查方法病人取截石位，用碘伏消毒外陰及陰道，鋪無菌洞巾，再次消毒宮頸外口，避免擴宮，連接宮腔鏡檢查鏡，全面觀察宮腔，然后觀察子宮內(nèi)膜是否存在CE征象：子宮內(nèi)膜點狀、局灶性或者彌漫性充血、子宮內(nèi)膜細小息肉、子宮內(nèi)膜血管增粗、子宮內(nèi)膜黏膜水腫等［8-9］，可予以定點活檢，若未見明顯異常，可予以分散活檢3～5處子宮內(nèi)膜，獲取子宮內(nèi)膜組織。

1.3免疫組織化學檢測CD38、CD138的表達使用10%的中性甲醛固定，常規(guī)脫水后行石蠟包埋，按2～4μm厚度連續(xù)切片，60℃烤箱過夜后脫蠟至水，制作成切片分別進行HE染色及免疫組織化學染色，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（Streptavidin-Perosidase，SP）法，乙醇梯度脫水后蒸餾水洗，加入檸檬酸抗原高壓修復，高壓鍋冒汽后2 min，室溫冷卻，3%的過氧化氫封閉10 min，加CD38抗體（1∶1 500；HPA022132，Sigma）或 CD138（1∶100；CM167CK，Biocare Medical），4 ℃冰箱過夜，磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）沖洗，加通用型二抗（PV6000工作液），DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹脂封片。用PBS液作為一抗為陰性對照。

1.4結果判定CD38定位于細胞膜，出現(xiàn)棕黃色為陽性，CD138定位于細胞膜及細胞質(zhì)中，出現(xiàn)棕黃色為陽性。在高倍鏡視野下發(fā)現(xiàn)有1個以上細胞CD38陽性，同時在相同高倍鏡視野下發(fā)現(xiàn)有1個以上細胞CD138表達陽性，診斷為組織病理學CE［10］。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料采取例數(shù)（%）表示。本研究以免疫組化診斷結果為參考，計算宮腔鏡診斷靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值等指標，并對比宮腔鏡檢測結果與免疫組化診斷結果的一致性（Kappa值）。當Kappa值在0.40～0.75認為兩種診斷方式具有中度至高度一致性，Kappa＞0.75則兩種診斷方式一致性好。

2 結果

2.1 RIF病人宮腔鏡下的表現(xiàn)情況186例RIF病人宮腔鏡下診斷為CE的病人為112例（CE/HS組），呈正常宮腔鏡表現(xiàn)的病人74例（非CE/HS組），詳見圖1。

圖1 宮腔鏡下慢性子宮內(nèi)膜炎的表現(xiàn)：A為宮腔下子宮內(nèi)膜充血；B為宮腔鏡下子宮內(nèi)膜微小息肉；C為宮腔鏡下子宮內(nèi)膜血管增粗；D為宮腔鏡下子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫伴微小息肉

2.2 RIF病人子宮內(nèi)膜組織CD38、CD138表達情況186例RIF病人子宮內(nèi)膜組織中CD38呈陽性83例（44.62%），CD138呈陽性 79例（42.47%），CD38、CD138表達均呈陽性77例（41.40%，診斷為組織病理學CE），詳見表1。

表1 反復胚胎移植失敗病人子宮內(nèi)膜組織CD38、CD138的表達情況/例（%）

2.3宮腔鏡對CE的診斷參數(shù)宮腔鏡對CE診斷結果與組織病理學結果具有中度一致性（Kappa＝0.553），靈敏度為94.81%，特異度為64.22%，陽性預測值為65.18%，陰性預測值為94.60%，詳見表2。

表2 宮腔鏡對慢性子宮內(nèi)膜炎（CE）的診斷參數(shù)/例

3 討論

CE是指各種原因引起的子宮內(nèi)膜炎性改變，其確切病因尚不清楚，現(xiàn)階段普遍認為是細菌、支原體、衣原體等感染引起的。雖然子宮內(nèi)膜周期性的剝落使感染的病原體排出體外，但是基底層內(nèi)膜無法周期性剝脫，一旦基底層內(nèi)膜組織發(fā)生長期感染，最終導致CE的發(fā)生。Kitaya等［11］對142例RIF病人行子宮內(nèi)膜活檢，結果發(fā)現(xiàn)33.7%的人患有CE，經(jīng)過有效的抗生素治療后，病人的臨床妊娠率明顯提高。Cicinelli等［8］同樣發(fā)現(xiàn)CE病人經(jīng)過抗生素治療后，病人的胚胎種植率、臨床妊娠率明顯提高，明顯改善其生殖預后。因此早期診斷、準確診斷CE顯得尤其重要。

CE診斷金標準為在子宮間質(zhì)發(fā)現(xiàn)漿細胞，但是單核細胞浸潤、大量有絲分裂的基質(zhì)細胞、呈類漿細胞樣的基質(zhì)細胞、月經(jīng)后期以及活檢取材的局限性，使?jié){細胞的尋找尤為困難，較易造成誤診、漏診［7，12-13］。因此，尋找新的方法提高漿細胞的檢出率顯得尤為重要。在正常漿細胞中，免疫表型主要表現(xiàn)為CD38、CD138等，漿細胞較為特異的指標為CD138，同時另有研究表明，漿細胞中的CD38分子具有較強的著色力。CD38是轉(zhuǎn)膜糖蛋白中的Ⅱ型，主要表達于漿細胞，但也表達在活化的T細胞、胸腺細胞；CD138是由核心蛋白和未分枝的糖胺聚糖鏈共價結合形成的一類糖結合物，也是漿細胞特異性標志物之一，表達于活化的β細胞、漿細胞以及胸腺細胞，大約95%石蠟切片的漿細胞表明均有CD138表達。因CD38、CD138不僅僅表達在漿細胞，在臨床實際工作中，采用免疫組化方法聯(lián)合檢測CD38、CD138提高對漿細胞的準確識別，該方法對于CE的診斷優(yōu)于傳統(tǒng)HE染色法，并被學者廣為推薦［14-16］。

Johnston-MacAnanny等［10］獲取33例RIF病人的子宮內(nèi)膜組織，并使用CD138行免疫組化進行染色，結果發(fā)現(xiàn)10例病人表達為陽性，陽性率為30.3%；另一研究顯示，同樣對RIF病人的子宮內(nèi)膜行CD138免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)33.7%（142/421）的病人表達為陽性，被診斷為CE［11］。Yang等［17］對202例RIF病人的子宮內(nèi)膜組織行CD38、CD138免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)43.6%的病人表達為陽性，診斷為子宮內(nèi)膜炎。本研究結果顯示，CD38細胞膜強陽性，CD138為漿細胞胞膜強陽性，胞質(zhì)弱陽性染色，在顯微鏡下相對于HE染色尋找漿細胞更容易，尤其在疑似CE病人標本時，HE染色無法準確辨認漿細胞時，免疫組化染色可以有效顯示漿細胞，從而提高CE診斷的靈敏度和特異度。研究結果顯示，186例RIF病人中，77例CD38、CD138表達皆為陽性，診斷為CE，陽性率為41.40%。這與Johnston-MacAnanny等［10］、Yang等［17］團隊的研究結果相似，顯示CD138主要表達于漿細胞膜及細胞質(zhì)，CD38表達于細胞膜，大約有1/3的RIF病人患有CE。但國外研究中多采用CD138單一指標行CE的診斷，容易造成假陽性的出現(xiàn)，聯(lián)合采用CD38，可提高診斷的特異度。

CD38、CD138免疫組化染色能夠很好地解決尋找漿細胞的問題，但在臨床工作中，取材受限也是造成漏診的重要原因。隨著微創(chuàng)器械技術的不斷發(fā)展，宮腔鏡已被廣泛應用于宮腔狀況評估，具有檢查時間短，創(chuàng)傷較小的優(yōu)點，通過直觀觀察宮腔形態(tài)，明確病變部位，對可疑異常部位做出精確的活檢。子宮內(nèi)膜炎引起的子宮內(nèi)膜間質(zhì)、血管、腺體等多方面的改變，可以通過宮腔鏡檢測，宮腔鏡下子宮內(nèi)膜局灶或彌漫性充血、子宮內(nèi)膜微小息肉（＜1 mm）、子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫等對于CE的診斷具有重要作用［8-9，18-19］，但國內(nèi)對宮腔鏡下CE診斷的靈敏度及特異度性鮮有報道，其診斷CE臨床價值尚需進一步證實。本研究中，186例病人均行宮腔鏡檢查，112例宮腔鏡下診斷為CE，余下74例宮腔鏡下未見明顯異常，在CE/HS組病人中，73例組織學診斷為CE，陽性率為65.18%，74例非CE/HS組病人中，4例診斷為CE，陽性率為5.41%，宮腔鏡在診斷CE與免疫組化病理學診斷結果具有中度一致性，靈敏度為94.81%，特異度為64.22%，陽性預測值為65.18%，陰性預測值為94.60%。結果提示，宮腔鏡檢查在CE的診斷具有一定的臨床意義，其靈敏度較高，特異度稍低，陰性預測值較高，不易漏診，但是其特異度、陽性預測值低，無法取代組織病理學診斷方法。因其靈敏度較高，同時可以全面評估宮腔以及子宮內(nèi)膜情況，對于RIF病人可行宮腔鏡檢查，評估子宮內(nèi)膜情況，對于可疑CE的部位進行取材，聯(lián)合CD38、CD138進行免疫組化診斷CE，在臨床工作中對于CE的診斷具有重要意義。

綜上所述，宮腔鏡診斷CE具有較高的靈敏度及陰性預測值，因其特異度低，無法替代組織病理學診斷方法，聯(lián)合CD38、CD138免疫組化染色能顯著提高CE的檢出率，具有重要的臨床意義。