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    二維液相色譜法在線檢測哈茨木霉發(fā)酵液中2460A含量

    2014-12-18 21:14:47山廣志等
    分析化學(xué) 2014年12期
    關(guān)鍵詞:哈茨木霉液相色譜儀

    山廣志等

    摘 要 建立了在線檢測哈茨木霉發(fā)酵液中微量2460A的二維液相色譜方法。利用Ultimate 3000雙三元液相色譜儀,采用閥切換二維色譜技術(shù),組合3根色譜柱實(shí)現(xiàn)2460A的在線凈化、富集和含量檢測。凈化柱采用資生堂MF C

    1 引 言

    2460A是從植物病原菌拮抗菌哈茨木霉(Trichoderma hazianum)的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得的一種具有抗腫瘤活性的新結(jié)構(gòu)化合物,結(jié)構(gòu)見圖1插圖。2460A具有白細(xì)胞介素6受體(IL6R)的配基活性,同時(shí)對骨髓癌CM126細(xì)胞和結(jié)腸癌HT29細(xì)胞具有抑制作用[ 1]。

    2460A水溶性較差(水中溶解度<1 mg/L),采用常規(guī)分析型HPLC方法在進(jìn)樣量100 μL條件下僅能達(dá)到定量限水平。哈茨木霉發(fā)酵液基質(zhì)較為復(fù)雜,嚴(yán)重干擾目標(biāo)物的分離。為了研究和優(yōu)化2460A的發(fā)酵工藝,需要對不同發(fā)酵條件下哈茨木霉發(fā)酵液中的2460A含量進(jìn)行測定。采用傳統(tǒng)液液萃取方法進(jìn)行樣品預(yù)處理時(shí),需要發(fā)酵液樣品量較大,操作步驟繁瑣,耗時(shí)較長,難以滿足發(fā)酵工藝優(yōu)化所需的快速、準(zhǔn)確的檢測要求。

    近年來,由普通一維液相色譜發(fā)展起來的多維液相色譜技術(shù)有力地推動了復(fù)雜體系成分的分離[ 2,3]。Gidding等[ 4,5]指出,多維色譜分離系統(tǒng)比一維色譜具有更好的分辨率和更高的峰容量,更適合分離復(fù)雜體系。本研究利用Ultimate 3000雙三元液相色譜儀,采用六通閥切換技術(shù)(見圖2)[ 6~9]、大體積進(jìn)樣器和3根色譜柱,綜合利用“中心切割”、在線富集等二維色譜技術(shù),實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜發(fā)酵液的在線預(yù)處理,減輕了實(shí)驗(yàn)人員操作強(qiáng)度,節(jié)約了樣品處理時(shí)間,提高了檢測的自動化程度和通量,方法重現(xiàn)性較手動提取得到較大提高。通過大體積進(jìn)樣和在線富集,提高了方法靈敏度,解決了微量組分的檢測難題。建立的方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏、通用性強(qiáng),適用于2460A發(fā)酵工藝優(yōu)化過程中的大量檢測研究工作,同時(shí)為復(fù)雜基質(zhì)中微量代謝產(chǎn)物的測定提供了方法依據(jù)和借鑒。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    Determination of 2460A in Trichoderma Hazianum Fermentation

    Liquor by Online Twodimensional Liquid Chromatographic Method

    SHAN GuangZhi*, ZHOU Jie, ZUO LiMin, JIANG Wei, LIU GuiXia, ZHANG Yang, LI Yuan, JIANG Rong*

    (Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China)

    Abstract An online two dimensional liquid chromatographic (2DLC) method was established by using an ultimate dual gradient liquid chromatography, three chromatographic columns and valveswitching technology to detect 2460A in trichoderma hazianum fermentation liquor. MF C8 column (10 mm×4.6 mm, 5.0 μm) was used as purification column and MG C18 column (20 mm×4.6 mm, 5.0 μm) was used as enriching column. Methanol and water were used as mobile phase with a gradient elution at a flow rate of 2.0 mL/min. The sample was separated on the Thermo Hypersil GOLD C18 column (250 mm×4.6 mm, 5.0 μm) maintained at 40 ℃ using methanol and water. The flow rate was 1.0 mL/min and 1.0 mL sample was injected into the 2DLC system. The detection wavelength was 424 nm. The whole analytical time was less than 60 min. The standard curve was linear over the 2460A concentration range of 0.0025-10.0 mg/L(r=0.9981, n=8). The limit of detection was calculated to be 1.2 μg/L (S/N=3) and the limit of quantification was calculated to be 2.5 μg/L (S/N=10). The average recoveries varied from 88.0% to 104.4%.

    Keywords Twodimensional liquid chromatography; Trichoderma hazianum; Fermentation liquor; 2460A

    (Received 29 August 2014; accepted 20 October 2014)

    This work was supported by the National S & T Major Special Project on Major New Drug Innovation (No. 2012zx09301002001019)

    摘 要 建立了在線檢測哈茨木霉發(fā)酵液中微量2460A的二維液相色譜方法。利用Ultimate 3000雙三元液相色譜儀,采用閥切換二維色譜技術(shù),組合3根色譜柱實(shí)現(xiàn)2460A的在線凈化、富集和含量檢測。凈化柱采用資生堂MF C

    1 引 言

    2460A是從植物病原菌拮抗菌哈茨木霉(Trichoderma hazianum)的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得的一種具有抗腫瘤活性的新結(jié)構(gòu)化合物,結(jié)構(gòu)見圖1插圖。2460A具有白細(xì)胞介素6受體(IL6R)的配基活性,同時(shí)對骨髓癌CM126細(xì)胞和結(jié)腸癌HT29細(xì)胞具有抑制作用[ 1]。

    2460A水溶性較差(水中溶解度<1 mg/L),采用常規(guī)分析型HPLC方法在進(jìn)樣量100 μL條件下僅能達(dá)到定量限水平。哈茨木霉發(fā)酵液基質(zhì)較為復(fù)雜,嚴(yán)重干擾目標(biāo)物的分離。為了研究和優(yōu)化2460A的發(fā)酵工藝,需要對不同發(fā)酵條件下哈茨木霉發(fā)酵液中的2460A含量進(jìn)行測定。采用傳統(tǒng)液液萃取方法進(jìn)行樣品預(yù)處理時(shí),需要發(fā)酵液樣品量較大,操作步驟繁瑣,耗時(shí)較長,難以滿足發(fā)酵工藝優(yōu)化所需的快速、準(zhǔn)確的檢測要求。

    近年來,由普通一維液相色譜發(fā)展起來的多維液相色譜技術(shù)有力地推動了復(fù)雜體系成分的分離[ 2,3]。Gidding等[ 4,5]指出,多維色譜分離系統(tǒng)比一維色譜具有更好的分辨率和更高的峰容量,更適合分離復(fù)雜體系。本研究利用Ultimate 3000雙三元液相色譜儀,采用六通閥切換技術(shù)(見圖2)[ 6~9]、大體積進(jìn)樣器和3根色譜柱,綜合利用“中心切割”、在線富集等二維色譜技術(shù),實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜發(fā)酵液的在線預(yù)處理,減輕了實(shí)驗(yàn)人員操作強(qiáng)度,節(jié)約了樣品處理時(shí)間,提高了檢測的自動化程度和通量,方法重現(xiàn)性較手動提取得到較大提高。通過大體積進(jìn)樣和在線富集,提高了方法靈敏度,解決了微量組分的檢測難題。建立的方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏、通用性強(qiáng),適用于2460A發(fā)酵工藝優(yōu)化過程中的大量檢測研究工作,同時(shí)為復(fù)雜基質(zhì)中微量代謝產(chǎn)物的測定提供了方法依據(jù)和借鑒。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    Determination of 2460A in Trichoderma Hazianum Fermentation

    Liquor by Online Twodimensional Liquid Chromatographic Method

    SHAN GuangZhi*, ZHOU Jie, ZUO LiMin, JIANG Wei, LIU GuiXia, ZHANG Yang, LI Yuan, JIANG Rong*

    (Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China)

    Abstract An online two dimensional liquid chromatographic (2DLC) method was established by using an ultimate dual gradient liquid chromatography, three chromatographic columns and valveswitching technology to detect 2460A in trichoderma hazianum fermentation liquor. MF C8 column (10 mm×4.6 mm, 5.0 μm) was used as purification column and MG C18 column (20 mm×4.6 mm, 5.0 μm) was used as enriching column. Methanol and water were used as mobile phase with a gradient elution at a flow rate of 2.0 mL/min. The sample was separated on the Thermo Hypersil GOLD C18 column (250 mm×4.6 mm, 5.0 μm) maintained at 40 ℃ using methanol and water. The flow rate was 1.0 mL/min and 1.0 mL sample was injected into the 2DLC system. The detection wavelength was 424 nm. The whole analytical time was less than 60 min. The standard curve was linear over the 2460A concentration range of 0.0025-10.0 mg/L(r=0.9981, n=8). The limit of detection was calculated to be 1.2 μg/L (S/N=3) and the limit of quantification was calculated to be 2.5 μg/L (S/N=10). The average recoveries varied from 88.0% to 104.4%.

    Keywords Twodimensional liquid chromatography; Trichoderma hazianum; Fermentation liquor; 2460A

    (Received 29 August 2014; accepted 20 October 2014)

    This work was supported by the National S & T Major Special Project on Major New Drug Innovation (No. 2012zx09301002001019)

    摘 要 建立了在線檢測哈茨木霉發(fā)酵液中微量2460A的二維液相色譜方法。利用Ultimate 3000雙三元液相色譜儀,采用閥切換二維色譜技術(shù),組合3根色譜柱實(shí)現(xiàn)2460A的在線凈化、富集和含量檢測。凈化柱采用資生堂MF C

    1 引 言

    2460A是從植物病原菌拮抗菌哈茨木霉(Trichoderma hazianum)的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得的一種具有抗腫瘤活性的新結(jié)構(gòu)化合物,結(jié)構(gòu)見圖1插圖。2460A具有白細(xì)胞介素6受體(IL6R)的配基活性,同時(shí)對骨髓癌CM126細(xì)胞和結(jié)腸癌HT29細(xì)胞具有抑制作用[ 1]。

    2460A水溶性較差(水中溶解度<1 mg/L),采用常規(guī)分析型HPLC方法在進(jìn)樣量100 μL條件下僅能達(dá)到定量限水平。哈茨木霉發(fā)酵液基質(zhì)較為復(fù)雜,嚴(yán)重干擾目標(biāo)物的分離。為了研究和優(yōu)化2460A的發(fā)酵工藝,需要對不同發(fā)酵條件下哈茨木霉發(fā)酵液中的2460A含量進(jìn)行測定。采用傳統(tǒng)液液萃取方法進(jìn)行樣品預(yù)處理時(shí),需要發(fā)酵液樣品量較大,操作步驟繁瑣,耗時(shí)較長,難以滿足發(fā)酵工藝優(yōu)化所需的快速、準(zhǔn)確的檢測要求。

    近年來,由普通一維液相色譜發(fā)展起來的多維液相色譜技術(shù)有力地推動了復(fù)雜體系成分的分離[ 2,3]。Gidding等[ 4,5]指出,多維色譜分離系統(tǒng)比一維色譜具有更好的分辨率和更高的峰容量,更適合分離復(fù)雜體系。本研究利用Ultimate 3000雙三元液相色譜儀,采用六通閥切換技術(shù)(見圖2)[ 6~9]、大體積進(jìn)樣器和3根色譜柱,綜合利用“中心切割”、在線富集等二維色譜技術(shù),實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜發(fā)酵液的在線預(yù)處理,減輕了實(shí)驗(yàn)人員操作強(qiáng)度,節(jié)約了樣品處理時(shí)間,提高了檢測的自動化程度和通量,方法重現(xiàn)性較手動提取得到較大提高。通過大體積進(jìn)樣和在線富集,提高了方法靈敏度,解決了微量組分的檢測難題。建立的方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏、通用性強(qiáng),適用于2460A發(fā)酵工藝優(yōu)化過程中的大量檢測研究工作,同時(shí)為復(fù)雜基質(zhì)中微量代謝產(chǎn)物的測定提供了方法依據(jù)和借鑒。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    Determination of 2460A in Trichoderma Hazianum Fermentation

    Liquor by Online Twodimensional Liquid Chromatographic Method

    SHAN GuangZhi*, ZHOU Jie, ZUO LiMin, JIANG Wei, LIU GuiXia, ZHANG Yang, LI Yuan, JIANG Rong*

    (Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China)

    Abstract An online two dimensional liquid chromatographic (2DLC) method was established by using an ultimate dual gradient liquid chromatography, three chromatographic columns and valveswitching technology to detect 2460A in trichoderma hazianum fermentation liquor. MF C8 column (10 mm×4.6 mm, 5.0 μm) was used as purification column and MG C18 column (20 mm×4.6 mm, 5.0 μm) was used as enriching column. Methanol and water were used as mobile phase with a gradient elution at a flow rate of 2.0 mL/min. The sample was separated on the Thermo Hypersil GOLD C18 column (250 mm×4.6 mm, 5.0 μm) maintained at 40 ℃ using methanol and water. The flow rate was 1.0 mL/min and 1.0 mL sample was injected into the 2DLC system. The detection wavelength was 424 nm. The whole analytical time was less than 60 min. The standard curve was linear over the 2460A concentration range of 0.0025-10.0 mg/L(r=0.9981, n=8). The limit of detection was calculated to be 1.2 μg/L (S/N=3) and the limit of quantification was calculated to be 2.5 μg/L (S/N=10). The average recoveries varied from 88.0% to 104.4%.

    Keywords Twodimensional liquid chromatography; Trichoderma hazianum; Fermentation liquor; 2460A

    (Received 29 August 2014; accepted 20 October 2014)

    This work was supported by the National S & T Major Special Project on Major New Drug Innovation (No. 2012zx09301002001019)

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