多殺菌素影響下黑斑側(cè)褶蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組分析

王愛麗 李娜 王金園 聶茂菊

摘要：多殺菌素是常用殺蟲劑，能有效防治各種害蟲，在蔬菜種植區(qū)應(yīng)用廣泛。黑斑側(cè)褶蛙是山東壽光的一種常見蛙類，受環(huán)境影響數(shù)量逐年減少，本文以未處理的和多殺菌素處理的黑斑側(cè)褶蛙皮膚為研究對(duì)象，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法研究差異基因的功能和富集通路，預(yù)測(cè)多殺菌素對(duì)黑斑側(cè)褶蛙皮膚基因表達(dá)的影響。

關(guān)鍵詞：多殺菌素;黑斑側(cè)褶蛙;轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：X174文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ?文章編號(hào)：1003-2177（2020）12-0109-02

0引言

多殺菌素（Spinosad），又名刺糖菌素，是由好氧型革蘭氏陽性土壤放線菌刺糖多孢菌（Saccharopoly-spora spinosa）發(fā)酵液中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類無公害高效生物殺蟲劑，沒有抑菌活性，但有殺蟲活性。其具有獨(dú)特的殺蟲機(jī)理，能夠有效地防治各種害蟲，且無交叉抗性，對(duì)大多非靶標(biāo)動(dòng)物都有極高的安全性等優(yōu)點(diǎn)，且多殺菌素可較快地通過光和土壤微生物降解，因而不會(huì)造成環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。由于多殺菌素具有上述優(yōu)點(diǎn)，所以，多殺菌素在蔬菜種植區(qū)應(yīng)用廣泛[1]。

黑斑側(cè)褶蛙（Pelophylax nigromaculata），又名黑斑蛙，屬無尾目，蛙科，側(cè)褶蛙屬，是山東壽光地區(qū)常見蛙類之一。因其清晨及夜間大量捕食斜紋夜蛾、螻蛄、金花蟲等昆蟲，而成為經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大的蛙類之一[2]。黑斑側(cè)褶蛙水陸兩生環(huán)境復(fù)雜，對(duì)環(huán)境的依賴性大，環(huán)境的變化對(duì)他們的生長和進(jìn)化都會(huì)產(chǎn)生很大的影響。本文擬對(duì)經(jīng)過多殺菌素處理的皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，找出差異基因顯著富集的通路，預(yù)測(cè)多殺菌素對(duì)黑斑側(cè)褶蛙皮膚的功能影響。

1材料和方法

1.1樣品處理和RNA提取

本試驗(yàn)樣品采集于山東省煙臺(tái)市昆崳山。黑斑側(cè)褶蛙10只分成2組，每組5只標(biāo)記養(yǎng)殖，其中對(duì)照組標(biāo)記為c，處理組標(biāo)記為n。處理組為用2.5%懸浮劑50～100毫升稀釋多殺菌素溶液噴霧進(jìn)行刺激的黑斑側(cè)褶蛙。對(duì)照組和處理組在完全相同的環(huán)境中生長，48小時(shí)后搗毀脊髓法處理，取背部中央皮膚液氮保存?zhèn)溆?。分別測(cè)定6只黑斑側(cè)褶蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組信息，序列比對(duì)，差異基因，差異抗菌肽分析。同時(shí)確定黑斑側(cè)褶蛙轉(zhuǎn)錄組序列發(fā)生改變的多殺菌素濃度為有效刺激濃度?？俁NA用TRIzol（Invitgen，Carlsbad，CA，USA）試劑提取，260/280nm（A260/A280）和Agilent BioAnalyzer 2100（Agilent，上海，中國）測(cè)量吸光度來檢測(cè)RNA樣品的完整性和質(zhì)量。

1.2 文庫的構(gòu)建

將總RNA隨機(jī)切割成短片段，以片段RNA為模板合成具有隨機(jī)六聚體的第一鏈cDNA，然后加入緩沖dNTPs（dUTP而不是dTTP），RnaseH，用DNA聚合酶Ⅰ合成第二鏈cDNA，用QiaQuick PCR試劑盒純化，用EB緩沖液洗脫。末端修復(fù)，堿基A加上測(cè)序連接物，然后通過UNG（Uracil-N-Glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶）鏈降解，連接產(chǎn)物通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物富集生成cDNA文庫，并使用Gene Denovo Biotechnology Co.的Illumina HiSeqTM 4000進(jìn)行測(cè)序。（中國廣州）

1.3測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與分析

轉(zhuǎn)錄本使用軟件Trinity進(jìn)行組裝得到同源的和（或）可變剪接形式的轉(zhuǎn)錄本?；谶^濾后的Clean Data，用Trinity組裝出全長轉(zhuǎn)錄本序列，并基于轉(zhuǎn)錄本序列，取每個(gè)基因中最長的轉(zhuǎn)錄本序列作為Unigene。

利用Bowtie2（2.2.3版）將用于組裝的序列與組裝后的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比對(duì)，使其定位到組裝轉(zhuǎn)錄本，然后統(tǒng)計(jì)比對(duì)上序列的Reads比例。采用序列比對(duì)的方法對(duì)Trinity組裝得到的全部轉(zhuǎn)錄本和Unigene分別進(jìn)行BUSCO評(píng)估，核心蛋白比對(duì)率評(píng)估，準(zhǔn)確性評(píng)估，注釋比例評(píng)估，Reads利用率評(píng)估，利TransDecoder軟件進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)，然后基于Trinity組裝的Unigene序列和TransDecoder預(yù)測(cè)得到的ORF序列，通過Blast、HmmScan、SignalP、TmHMMP等工具得到組裝結(jié)果在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫中的注釋信息，然后采用Trinotate（Trinotate Release v3.0.2）整合得到綜合的功能注釋結(jié)果。

1.4 DEGs的篩選

使用RPKM估計(jì)基因表達(dá)值，使用DESeq2對(duì)對(duì)照組和處理組之間的mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析。以q值和log2差異倍數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的篩選，閾值為|log2Ratio|≥1和q<0.05。

1.5 DEGs表達(dá)模式的聚類分析

根據(jù)差異表達(dá)基因在每個(gè)樣品里的表達(dá)量，取以2為底的對(duì)數(shù)后，計(jì)算歐氏距離，利用R軟件（3.1.1版），對(duì)不同樣本的差異表達(dá)基因進(jìn)行分層聚類分析。

1.6 GO和KEGG pathway功能富集分析DEGs表達(dá)模式的聚類分析

使用R package clusterProfiler進(jìn)行GO terms和KEGG pathways富集分析。將差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本富集到GO數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org/），并計(jì)算每個(gè)術(shù)語的富集數(shù)，以獲得具有特定GO term的轉(zhuǎn)錄本列表和富集數(shù)。

將差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本映射到KEGG數(shù)據(jù)庫（www.genome.jp/KEGG/）進(jìn)行KEGG pathway分析，該分析與數(shù)據(jù)進(jìn)行GO分析的方法相同。在KEGG通路的分析中，使用經(jīng)過FDR校準(zhǔn)后的Q值作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，Q≤0.05的通路被認(rèn)定為顯著富集通路。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1測(cè)序數(shù)據(jù)匯總

6個(gè)的皮膚cDNA文庫測(cè)序共獲得273945858個(gè)raw reads。篩選獲得266625548個(gè)clean reads，占所有樣品序列總數(shù)的98%以上。

2.2注釋結(jié)果

對(duì)ORF同Uniprot數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果，基因注釋到Uniprot、NR、NT的基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。ORF同Uniprot數(shù)據(jù)庫共比對(duì)到比對(duì)18217條結(jié)果，基因從NR數(shù)據(jù)庫比對(duì)到32512條基因，基因從NT數(shù)據(jù)庫比對(duì)25821條基因，從Uniprot數(shù)據(jù)庫的比對(duì)結(jié)到25084條基因。各數(shù)據(jù)庫共同注釋基因數(shù)為10945條。

2.3 DEGs基因的鑒定和分析

通過對(duì)DEGs分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與處理組之間有1695個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因737條，下調(diào)基因958條。各小組差異基因聚類效果較好，可用于下一步的數(shù)據(jù)分析。

2.4 GO and KEGG pathway分析

對(duì)DGEs進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以進(jìn)一步確認(rèn)它們參與生物過程調(diào)控的功能。GO分析結(jié)果顯示c-vs-n差異基因富集結(jié)果中，得到4377個(gè)GO分類。contractile fiber part、myosin filament、Z disc是細(xì)胞組分Ontology最顯著富集的三個(gè)通路。muscle contraction、muscle system process、striated muscle contraction是生物過程Ontology最顯著富集的三個(gè)通路。structural constituent of muscle是分子功能Ontology富集顯著程度最高的GO條目。

KEGG通路分析顯示，顯著富集的前4條KEGG通

路分別是Antigen processing and presentation、Est-

rogen signaling pathway、IL-17 signaling pathway和MAPK signaling pathway，在這四條通路中Hsp70和Hsp90均顯著上調(diào)。

3討論

隨著農(nóng)藥使用量的逐年增加，農(nóng)藥污染日益嚴(yán)重。生物化合物多殺菌素常用于農(nóng)業(yè)和有機(jī)農(nóng)業(yè)中以對(duì)抗害蟲[3]。全球兩棲類動(dòng)物種群衰退現(xiàn)象十分嚴(yán)重，黑斑側(cè)褶蛙是壽光地區(qū)常見的兩棲動(dòng)物，有研究證明這些年來，黑斑蛙的數(shù)量急劇減少[4]。

對(duì)照組和處理組差異基因顯著富集到muscle con-traction、structural constituent of muscle等條目中。而顯著富集的KEGG通路則有四個(gè)，其中基因Hsp70、Hsp90和IL-17均上調(diào)。Hsp70、Hsp90是一種熱休克蛋白，在應(yīng)激條件下表達(dá)明顯增加[5]。IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，與受體結(jié)合，通過MAP激酶途徑和核轉(zhuǎn)錄因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途徑發(fā)揮生物學(xué)作用[6]。我們預(yù)測(cè)多殺菌素的處理引起黑斑側(cè)褶皮膚細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫相關(guān)因子表達(dá)水平的提高，從而提高了黑斑側(cè)褶蛙皮膚對(duì)外界農(nóng)藥刺激的免疫反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1]徐磊.多殺菌素：又一個(gè)潛力股？[J].農(nóng)藥市場(chǎng)信息，2019

（7）：36.

[2]吳紀(jì)國.淺談蛙類資源的保護(hù)與增殖[J].漁業(yè)致富指南，2017（20）：15-16.

[3]黃敏毅，季曉麗，段仁燕，等.三氯殺螨醇對(duì)雄性黑斑蛙的毒性效應(yīng)研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2011，32（3）：70-73.

[4]何志剛，伍遠(yuǎn)安，王冬武，等.農(nóng)藥對(duì)稻田共生黑斑蛙毒性影響研究[J].江西飼料，2018（2）：27-31.

[5]張晶晶，朱靜，林鐘婷.麗江雙團(tuán)棘胸蛙熱馴化中HSP70表達(dá)量的變化[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29（4）：42-46.

[6]林瑩瑩，王鋒.IL-17C參與炎癥性疾病的機(jī)制概述[J].免疫學(xué)雜志，2019，35（8）：718-721+731.

（責(zé)編：陳靜姝）