紅麻肌醇加氧酶基因的分離及表達(dá)分析

張高陽+鄧接樓+柯維忠+黃思齊+李德芳

摘要：干旱是限制植物生長(zhǎng)分布和影響作物產(chǎn)量形成的重要非生物因素之一，在響應(yīng)干旱脅迫過程中植物細(xì)胞壁發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，肌醇加氧酶是植物細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì)UDP-葡萄糖醛酸合成中的關(guān)鍵酶。為研究該基因在紅麻（Hibiscus cannabinus L.）抗旱和耐鹽過程中的作用，通過紅麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到肌醇加氧酶（myo-inositol oxygenase）基因的核心片段，利用染色體步移技術(shù)獲得肌醇加氧酶基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為HcMIOX；生物信息學(xué)分析表明，HcMIOX基因編碼序列長(zhǎng)948 bp，編碼315個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為31.9 ku，等電點(diǎn)為4.75；RT-PCR分析表明，HcMIOX基因在紅麻根、莖、葉中均有表達(dá)，根中表達(dá)量最高，該研究結(jié)果對(duì)分析該基因功能和了解紅麻抗旱的分子機(jī)制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：紅麻；轉(zhuǎn)錄組；肌醇加氧酶；分離；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S563.501 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0048-02

收稿日期：2016-04-01

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：GJJ151050））；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（編號(hào)：ASTIP-IBFC03）；上饒師范學(xué)院2014年博士科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：001055）。

作者簡(jiǎn)介：張高陽（1982—），男，河南駐馬店人，博士，主要從事植物生物技術(shù)研究。Tel：（0793）8153721；E-mail：gyzhang2015@163.com。

通信作者：李德芳，博士，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究。Tel：（0731）88998506；E-mail：chinakenaf@126.com。 干旱、鹽堿和極端溫度等是目前世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成的主要非生物因素[1-2]。紅麻（Hibiscus cannabinus L.）是錦葵科木槿屬一年生草本韌皮纖維多用途經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)廣大地區(qū)都有種植，因其纖維可以與棉混紡而應(yīng)用于紡織工業(yè)，越來越受到人們的重視。因此，通過基因工程技術(shù)培育紅麻耐旱品種，在我國(guó)廣大干旱地區(qū)種植，實(shí)現(xiàn)其不與糧爭(zhēng)地等具有重要意義。

干旱脅迫下，植物葉片細(xì)胞生長(zhǎng)受阻與細(xì)胞壁的硬化密切相關(guān)，可有效減少植物綠葉面積，進(jìn)而明顯降低綠葉的蒸騰失水。因此，植物細(xì)胞延伸生長(zhǎng)與細(xì)胞膨壓、細(xì)胞壁伸展性變化等，可在響應(yīng)干旱脅迫過程中應(yīng)對(duì)植物失水過程[3]。植物體內(nèi)的肌醇在加氧酶作用下通過氧化還原生成UDP-葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸是植物細(xì)胞壁主要成分葡糖醛酸、木糖、芹菜糖和阿拉伯糖等合成的主要前體物質(zhì)[4-5]。維生素C在植物體內(nèi)不僅參與生長(zhǎng)發(fā)育，還作為一種能清除超氧自由基的抗氧化劑，以緩解其對(duì)植物細(xì)胞造成的傷害。已有大量研究表明，抗壞血酸參與了對(duì)植物逆境脅迫下的保護(hù)作用，肌醇加氧酶基因在植物維生素C的生物合成中具有重要作用，在擬南芥中過量表達(dá)肌醇加氧酶基因，植物體內(nèi)維生素C含量比對(duì)照提高了2～3倍，植株的抗旱性也能有所增強(qiáng)[6-7]。因此，可以認(rèn)為該基因在應(yīng)對(duì)植物干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

有關(guān)該基因在植物中的研究，目前只見在水稻中有報(bào)道[8]，本研究旨在分離紅麻肌醇加氧酶基因，并對(duì)其在各個(gè)組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為今后了解該基因在植物干旱脅迫分子應(yīng)答中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅麻（Hibiscus cannabinus L.）抗旱品種“非引四號(hào)”保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究室，Taq plus DNA聚合酶、載體pMDl9-T、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa AMV Ver 3.0）、dNTPs均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，感受態(tài)細(xì)胞DH5α保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 紅麻莖皮總RNA提取及引物設(shè)計(jì) 取田間生長(zhǎng)旺盛的紅麻莖皮組織，迅速放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，按TaKaRa公司RNA提取試劑盒操作方法提取總RNA，以2 μL總RNA為模板，按TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)體系和方法合成cDNA第1條鏈，并作為后續(xù)反應(yīng)的模板。以從紅麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選的MIOX基因核心片段為基礎(chǔ)，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)染色體步移引物，MIOX基因3′端擴(kuò)增引物為3F1：（5′-TGACGAAACTGTCTGGAATCGC-3′），3F2：（5′-TTCGCTTACTCTACGGTTCACG-3′）；5′端擴(kuò)增引物為5F1：（5′-CGGTGGTGAACATTTCGCTACAG-3′），5F2：（5′-GAAGTTACGGTGAGGAGCAGG-3′）。

1.2.2 紅麻MIOX基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 紅麻MIOXT基因3′末端擴(kuò)增參照TaKaRa公司試劑盒。使用接頭引物進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，然后通過與接頭引物部分重疊的3′-OUT、3′-IN引物分別與基因特異性引物3F1、3F2進(jìn)行巢式PCR，5′端克隆利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶法（TdT），在cDNA的3′末端加上1個(gè)多聚的dC尾，然后用5′-OUT、5′-IN以及基因特異性引物5F1、5F2進(jìn)行巢式PCR，RT-PCR體系為25 μL，含無菌去離子水（17.5 μL）、10×PCR buffer（2.5 μL）、10 mmol/L dNTP Mix（2.5 mmol/L，2 μL）、上下游引物（10 μmol/L）各2.5 μL、10 U μL/L Taq（0.2 μL）、DNA聚合酶（2 U）。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性94 ℃ 40 s，退火55 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min），PCR產(chǎn)物用天根生物有限公司瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化，連入pMDl8-T載體，熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證正確的單克隆送華大基因測(cè)序。利用DNAMAN軟件拼接MIOXT基因的3′末端、5′末端和核心片段。endprint

1.2.3 紅麻MIOX基因序列及表達(dá)分析 采用ProtParam分析HcMIOX基因的各種基本理化特性，采用在線軟件NCBI ORFfinder尋找MIOXT基因的編碼區(qū)及其推倒的氨基酸序列。紅麻成長(zhǎng)至50 d后，采用20%PEG6000誘導(dǎo)處理后分別取根、莖和葉組織中的RNA樣品，紅麻18S RNA為內(nèi)參，對(duì)不同組織中的MIOXT基因進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅麻RNA提取

紅麻是一種富含多糖、多酚和其他次生代謝物質(zhì)的植物，高質(zhì)量的RNA獲取比較困難，筆者參照陳美霞等的提取方法[9]，利用SDS法并稍作改進(jìn)獲得高質(zhì)量的RNA，總RNA主帶清晰，條帶鋒利，無明顯降解，28S條帶約為18S的2倍，提取的RNA濃度為876 ng/μL，D260 nm/D280 nm=2.02，其濃度和純度較好，可滿足下一步試驗(yàn)的要求。

2.2 紅麻HcMIOX基因克隆

通過對(duì)紅麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，獲得紅麻MIOX基因的核心片段，根據(jù)核心片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因的5′端和3′端末端引物，在5′末端克隆中，以5′-IN和5′F2為引物擴(kuò)增得到1條502 bp的片段，3′末端擴(kuò)增反應(yīng)中，以3′-IN和3′F2為引物擴(kuò)增得到約213 bp的條帶；最后利用基因特異引物擴(kuò)增獲得包括5′UTR部分序列的MIOX基因cDNA全長(zhǎng)1 216 bp的片段（圖1）。

2.3 紅麻HcMIOX基因序列及表達(dá)分析

利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后得到948 bp的核苷酸序列，編碼1段含有315個(gè)氨基酸的推導(dǎo)性蛋白質(zhì)（圖2），分子量為31.9 ku，等電點(diǎn)為4.75。圖3表明，紅麻HcMIOX在根、莖、葉中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高。

3 結(jié)論與討論

肌醇加氧酶是植物細(xì)胞壁合成中前體物質(zhì)UDP-葡萄糖醛酸和抗壞血酸的生物合成中的關(guān)鍵酶，在植物的逆境成長(zhǎng)發(fā)育過程中，抗壞血酸起著重要的保護(hù)作用，有關(guān)植物肌醇加氧酶的研究只在水稻中有報(bào)道[4-6]。王海光等研究了不同

水稻肌醇加氧酶基因水分脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在旱稻（IRAT109）中OsMIOX基因的表達(dá)上調(diào)，在旱稻（IRAT109和毫格勞）中的表達(dá)量明顯高于水稻（越富和日本晴）品種，這說明水稻和旱稻中存在不同的分子響應(yīng)機(jī)制以應(yīng)對(duì)水分脅迫[8]。肌醇加氧酶基因在紅麻不同組織中都有表達(dá)，但根中表達(dá)量最高，水分脅迫直接影響著根部的生理代謝活動(dòng)，很可能是因?yàn)榧t麻主要通過根部生理變化、基因表達(dá)來應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

本研究通過分析紅麻干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到1個(gè)紅麻受干旱脅迫誘導(dǎo)高效表達(dá)的基因（MIOX）片段，利用染色體步移技術(shù)獲取該基因全長(zhǎng)cDNA序列。生物信息學(xué)分析表明，HcMIOX基因編碼序列長(zhǎng)948 bp，編碼315個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為41.8 ku，等電點(diǎn)為4.86。干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分

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析表明，MIOX基因在紅麻根、莖和葉組織中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高。這是在纖維作物紅麻中首次分離得到該基因，研究結(jié)果為下一步分析該基因的功能和了解紅麻抗旱的分子機(jī)制提供參考。

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