基于多光譜技術(shù)表征漢麻分離蛋白構(gòu)象并分析pH對(duì)其構(gòu)象的影響

曾劍華，孟 妍，劉琳琳，楊 楊，李美瑩，王子玥，朱秀清，石彥國(guó)

哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省谷物食品與綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076

引 言

漢麻俗稱大麻、火麻，漢麻籽中油脂和蛋白的含量約為40%～50%和25%～30%； 國(guó)際上將四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻品種稱為工業(yè)大麻，我國(guó)將工業(yè)大麻稱為漢麻[1]。 中國(guó)是全球漢麻籽最大生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，目前，漢麻籽的主要利用方式是提取漢麻纖維和制備高端植物油，而剩下大量富含蛋白的漢麻籽餅粕沒有得到充分的利用。 如何充分利用豐富的漢麻籽餅粕資源開發(fā)高品質(zhì)的漢麻籽蛋白粉及其衍生物已成為目前漢麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大問題之一。

國(guó)外較早研究報(bào)道了漢麻分離蛋白(hemp protein isolate，HPI)，漢麻蛋白主要由35%的白蛋白和65%球蛋白組成，而球蛋白主要由麻仁球蛋白構(gòu)成，其中麻仁球蛋白是由酸性亞基和堿性亞基通過二硫鍵鍵合而成的六聚體[2]。 國(guó)外關(guān)于漢麻蛋白的功能、生物活性及其衍生肽的相關(guān)報(bào)道已有很多[3]； 如，Hadnaev等[4]研究顯示HPI的最低溶解度在pH 5.0，且堿提過程有助于提高HPI的保水性； Teh[3]和Malomo等[5]研究顯示漢麻水解物具有抗氧化和降血壓等作用。 目前國(guó)外對(duì)漢麻蛋白的研究已深入到蛋白結(jié)構(gòu)與功能的構(gòu)效關(guān)系研究，如Malomo等[2]研究了漢麻蛋白中水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，與麻仁球蛋白比，白蛋白因含有的二硫鍵含量較少，因而其蛋白結(jié)構(gòu)具有良好的柔性，致使其具有較高的溶解性和起泡性； 發(fā)現(xiàn)漢麻蛋白產(chǎn)品的功能特性不僅取決于蛋白濃度和pH值，還與漢麻分離蛋白構(gòu)象具有密切關(guān)系[6]。 而國(guó)內(nèi)對(duì)漢麻蛋白的研究主要是2000年后，對(duì)漢麻蛋白的研究起步較晚； 且主要集中在漢麻蛋白的提取及其肽的衍生物制備研究，如張濤等[7]通過正交優(yōu)化得到漢麻蛋白提取率達(dá)70.56%； Tang等[8]研究顯示漢麻蛋白水解物具有良好的抗氧化功能。 然而，關(guān)于漢麻分離蛋白構(gòu)象特征等研究國(guó)內(nèi)還未有報(bào)道，而蛋白構(gòu)象對(duì)其功能性有著重要的影響，因此有必要對(duì)HPI的構(gòu)象展開研究。

本試驗(yàn)以脫脂漢麻餅粕為原料制備HPI，利用圓二色譜、傅里葉紅外光譜、熒光光譜和紫外光譜等手段表征HPI構(gòu)象； 并探究不同pH條件對(duì)HPI構(gòu)象的影響。 本文對(duì)HPI構(gòu)象的研究有助于了解漢麻分離蛋白結(jié)構(gòu)及與小分子相互作用等信息，為特異性改性HPI制備高品質(zhì)的漢麻籽蛋白粉以及具有生理活性的多肽提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nano-ZS-90馬爾文激光粒度儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)； Spectrum Two傅里葉變換近紅外光譜儀和LAMBDA 365紫外光譜(美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司)； F-7000熒光光譜儀(日本日立儀器(上海)有限公司)； ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ)； Chirascan qCD(英國(guó)應(yīng)用光物理公司)。

漢麻籽仁(廣西巴馬： 蛋白31.11%±1.15%、脂肪53.05%±2.32%)； 大豆分離蛋白(實(shí)驗(yàn)室自制，蛋白92.64%±1.34%，脂肪0.4%±0.12%)； 硼酸、硫酸銅、磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 漢麻分離蛋白提取

漢麻籽仁先用正己烷以1∶4(w/v)脫脂4 h，后在通風(fēng)櫥烘干(40 ℃)。 稱取一定量的脫脂漢麻籽餅粕(蛋白57.93%±1.32%)，與去離子水以按1∶15(w/v)料液比混合，用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)料液至pH 8.5，震蕩(200 r·min-1、60 min、25 ℃)堿提1 h，離心(10 000 r·min-1，20 min)，上清液用1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)至pH 4.7，靜置30 min后，離心(10 000 r·min-1、20 min)，得到漢麻籽蛋白凝乳，調(diào)節(jié)漢麻籽蛋白凝乳pH值為7.0，冷凍干燥得到漢麻分離蛋白(蛋白含量90.54%±1.45%，脂肪含量1.4%±0.32%)備用。

如圖1，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析可知HPI主要為分子量為37 kDa(2號(hào)條帶)和21 kDa(3號(hào)條帶)由酸性亞基和堿性亞基組成的麻仁球蛋白； 光密度分析結(jié)果顯示HPI中麻仁球蛋白組分占HPI 76.41%，白蛋白占23.59%左右。 此外，51 kDa和12 kDa左右有一條明顯的條帶(1和4號(hào)條帶)，可能與HPI中白蛋白成分相對(duì)應(yīng)，此結(jié)論與Tang等人研究結(jié)論相一致[13]。

1.3 pH對(duì)HPI構(gòu)象的影響

將HPI用0.05 mol·L-1不同pH(3.0～10.0)的磷酸鹽緩沖溶液配制成2 mg·mL-1蛋白溶液，溶解過夜后備用。

1.4 游離巰基和二硫鍵含量分析

HPI和SPI巰基含量的測(cè)定參考Beveridge[9]改進(jìn)的Ellman試劑法。

圖1 HPI電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of HPI

1.5 粒徑和zeta電位測(cè)定

采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定樣品的流體動(dòng)力學(xué)粒徑及其分布。 將蛋白樣品用 pH 7.2的磷酸鹽緩沖液配制成1 mg·mL-1的蛋白溶液，過0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜。 測(cè)定溫度為25 ℃、平衡時(shí)間為120 s、分散相折射率為1.471和分散劑折射率為1.330條件下測(cè)定3次取平均值。 將蛋白樣品用DTS1060C皿在Malvern Zeta Plus測(cè)定電位。

1.6 圓二色譜

將樣品用磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，0.01 mol·L-1)稀釋成濃度為0.2 mg·mL-1，采用Chirascan qCD圓二色光譜儀在波長(zhǎng)范圍為190～260 nm內(nèi)掃描三次取平均值，光徑10 mm，掃描頻率為90 nm·min-1，間隔時(shí)間0.25 s，以相應(yīng)磷酸鹽緩沖液為溶劑空白。

1.7 傅里葉變換紅外光譜

將凍干的蛋白樣品置于干燥器內(nèi)，充分干燥，精確稱取2 mg干燥的蛋白樣品，加入200 mg的KBr，研磨混合均勻，然后進(jìn)行壓片，樣品紅外光譜掃描，掃描波段 4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32。 采集的紅外圖譜進(jìn)行基線校正和平滑處理后，使用Peakfit 4.0.2結(jié)合Origin 2017對(duì)蛋白酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)做二階導(dǎo)數(shù)、去卷積和高斯曲線擬合，根據(jù)峰面積計(jì)算各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量。

1.8 熒光光譜

采用F-7000熒光光譜儀測(cè)定蛋白樣品熒光光譜，將樣品液用pH 7.2的鹽酸緩沖溶液(PBS)稀釋為濃度為0.1 mg·mL-1，在激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm、電壓為500 V條件下，以激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，從300～400 nm波長(zhǎng)范圍掃描得到熒光光譜，掃描3次取平均值最后得到內(nèi)源熒光光譜。

外源熒光采用1-苯胺基-8-萘磺酸熒光探針(ANS)法測(cè)定疏水性，用pH 7.2磷酸鹽緩沖液配制2 mg·mL-1的蛋白樣品溶液，并稀釋成0.02，0.04，0.06，0.08和1 g·mL-1的蛋白樣品溶液； 測(cè)試前，取2 mL樣品液加入20 μL 8 mmol·L-1ANS，搖勻靜置3 min； 在狹縫為5 nm、激發(fā)波長(zhǎng)330 nm、發(fā)射波長(zhǎng)490 nm測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度(FI)； 試劑做空白。 以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)(H0)。

1.9 紫外光譜

稱取一定量的蛋白樣品，溶于10 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.2)中，配置成濃度為0.5 mg·mL-1的溶液，磁力攪拌后于25 ℃離心(10 000 r·min-1，10 min)，上清液用于紫外光譜分析。 波長(zhǎng)范圍為190～800 nm，分辨率為0.2 nm，掃描速率為60 nm·min-1。 所得的紫外光譜經(jīng)origin軟件微分化得到紫外光譜二級(jí)導(dǎo)數(shù)光譜[圖4(b)]。

2 結(jié)果與討論

2.1 巰基二硫鍵含量分析

在pH 7時(shí)，漢麻蛋白(HPI)游離巰基和二硫鍵含量如表1所示，與SPI相比，HPI的游離巰基、二硫鍵和總巰基含量均顯著(p<0.01)高于大豆分離蛋白(SPI)中游離巰基、二硫鍵和總巰基含量，分別為10.06，12.14和32.26 μmol·g-1。 HPI中麻仁球蛋白含量約為65%，而SPI中大豆球蛋白含量約為50%～60%，即HPI中11S球蛋白含量比SPI中11S球蛋白含量高，11S球蛋白是由堿性亞基和酸性亞基通過二硫鍵維持的六聚體，因而由此也可以推測(cè)出HPI中二硫鍵含量高于SPI中二硫鍵的含量。 此外，HPI的游離巰基/總巰基比值顯著(p<0.05)小于SPI中游離巰基/總巰基比值，表明HPI三級(jí)結(jié)構(gòu)緊湊程度高于SPI的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.2 粒徑電位分析

在25 ℃、pH 7.2 條件下HPI和SPI粒徑分布如圖2(a)所示，HPI和SPI粒子數(shù)量主要分布范圍集中在10 nm左右，該部分粒子主要為HPI和SPI的天然態(tài)，與文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道SPI中11S球蛋白(9.5 nm×9.5 nm×4.0 nm)和7S球蛋白(9.6 nm×9.6 nm×4.4 nm)的大小基本一致； 由此推測(cè)，HPI中白蛋白和麻仁球蛋白的粒子大小約為10 nm左右，由于HPI三級(jí)結(jié)構(gòu)比SPI緊湊(表1)，導(dǎo)致HPI粒子大小相比SPI小一些。 還有一部分粒徑分布在100～1000 nm范圍內(nèi)的粒子，這主要是天然態(tài)HPI交聯(lián)形成的可溶性聚集體或者微小雜質(zhì)造成的； 由此得到的HPI平均粒徑為167.4 nm，SPI平均粒徑為83.5 nm，HPI平均粒徑大于SPI，可能是因?yàn)镠PI具有較大的表面疏水性(HPI： 374，SPI： 173)，HPI之間通過疏水相互作用形成較大的聚集體。

表1 HPI和SPI中游離巰基、總巰基和二硫鍵含量及游離巰基/總巰基比值Table 1 Free sulfydryl tatol sulfydryl and disulfide bond content in HPI and SPI, as well as the value of Free sulfydryl/tatol sulfydryl

圖2 HPI和SPI的粒徑(a)和表面電位(b)曲線Fig.2 Size (a) and zeta-potential profiles (b) of HPI and SPI

HPI和SPI表面電荷曲線分布如圖2(b)所示，在pH從10到2過程中，HPI和SPI的表面電荷由負(fù)值變成正值，也即蛋白質(zhì)分子逐漸質(zhì)子化過程； 且SPI的表面電荷變化程度大于HPI，SPI等電點(diǎn)(4.51)比HPI等電點(diǎn)(4.65)小，這個(gè)差異主要是由于SPI中酸性氨基酸含量大于HPI，這些氨基酸使得SPI具有酸性特征。 而本研究中HPI等電點(diǎn)(4.7)比現(xiàn)有文獻(xiàn)記載(pI=5)略低，可能是由蛋白品種差異造成[4]。

2.3 HPI構(gòu)象分析

2.3.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

HPI和SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)表征如圖3所示，由圖3(a)可知，與SPI相比，HPI在208和222 nm處有顯著的負(fù)吸收雙峰，表明HPI二級(jí)構(gòu)象中α-螺旋含量高于SPI； HPI和SPI在195 nm處具有顯著正吸收峰，表明HPI和SPI均含有β-折疊結(jié)構(gòu)[11]。 經(jīng)dichroweb擬合得出HPI和SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)分別為： α-螺旋39.1%和11.7%、β-折疊13.1%和34.4%、β-轉(zhuǎn)角21.9%和22.9%、無(wú)規(guī)則卷曲25.9%和31.9%。 此外，HPI的摩爾橢圓率大于SPI，也證實(shí)了HPI具有緊密的結(jié)構(gòu)特征[2]。

圖3 HPI和SPI的圓二色譜圖(a)、傅里葉紅外光譜(b)及其酰胺Ⅰ帶分峰擬合結(jié)果(c: HPI，d: SPI)圖Fig.3 Circular dichroism (a), FTIR (b) and curve-fitting results of amide I band (c: HPI, d: SPI) of HPI and SPI

2.3.2 三級(jí)構(gòu)象分析

由圖4(a)可知，HPI和SPI均在330～340 nm附近具有典型的色氨酸殘基最大熒光吸收峰，與SPI相比(λmax336.9)，HPI最大吸收波長(zhǎng)為λmax334.4，說(shuō)明HPI的親水性比SPI要差，也即HPI結(jié)構(gòu)更緊湊，這與現(xiàn)有文獻(xiàn)記載HPI溶解性低于SPI的結(jié)果相符[13]。 與SPI相比，在300～310 nm處，HPI出現(xiàn)一個(gè)小的吸收峰，可能是為HPI中酪氨酸高于SPI，因而暴露于親水環(huán)境的酪氨酸比SPI更多，導(dǎo)致吸收峰比SPI更明顯[6]，此外，該處的吸收峰還可能有苯丙氨酸殘基的熒光貢獻(xiàn)。 而SPI最大熒光吸收比HPI要強(qiáng)，可能是因?yàn)镠PI結(jié)構(gòu)緊密，導(dǎo)致芳香族氨基酸殘基暴露的程度比SPI差。

同理，由圖4(b)可知，HPI和SPI在190～400 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)蛋白特征吸收峰在200～230和260～280 nm； 在260～280 nm處HPI吸收峰強(qiáng)度比SPI弱，也說(shuō)明HPI暴露的芳香族氨基酸殘基含量較少，具有緊湊的三級(jí)結(jié)構(gòu)特征。 這兩個(gè)特征吸收峰是由芳香族氨基酸殘基π→π*躍遷產(chǎn)生，常規(guī)紫外光譜難以分辨酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基對(duì)局部微環(huán)境影響的貢獻(xiàn)，而二階導(dǎo)數(shù)光譜能很好得分辨以上三個(gè)發(fā)色基團(tuán)的貢獻(xiàn)率； 由HPI紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜可知，HPI和SPI在280～300 nm內(nèi)有兩個(gè)正吸收峰，分別為288，294 nm和289，296 nm，兩個(gè)負(fù)吸收峰285，289 nm和285，291 nm； 與SPI相比，HPI發(fā)生藍(lán)移，這與內(nèi)源熒光結(jié)果一致。 此外，兩正負(fù)吸收峰距離的比例(r=a/b)可用來(lái)推測(cè)酪氨酸對(duì)構(gòu)象變化的影響，r值越大，蛋白結(jié)構(gòu)伸展程度越大，由圖4(b)得到的rHPI和rSPI分別為0.441和0.589，即SPI伸展程度大于HPI。

圖4 HPI和SPI內(nèi)源熒光(a)和紫外光圖譜插圖為其二階導(dǎo)數(shù)譜(b)

2.4 pH對(duì)漢麻分離蛋白構(gòu)象的影響

基于以上得出的HPI結(jié)構(gòu)信息，為改善HPI溶解特性等功能特性，探究不同pH條件對(duì)HPI構(gòu)象的影響。

圖5可知，在pH 7→3過程中熒光強(qiáng)度先下降后增大，并伴隨著紅移； 當(dāng)pH 7→10時(shí)，熒光強(qiáng)度先增大后降低，伴隨著藍(lán)移。 HPI中含有Phe，Tyr和Trp 3個(gè)發(fā)色基團(tuán)，且能量轉(zhuǎn)移由Phe到Tyr和Trp是非常有效的，因而含有這些基團(tuán)的蛋白質(zhì)的吸收性質(zhì)并不是這些基團(tuán)的簡(jiǎn)單加和，通常認(rèn)為當(dāng)發(fā)射波長(zhǎng)大于290 nm時(shí)，可認(rèn)為熒光都來(lái)自Trp殘基[14]。 在pH 3.0時(shí)，大部分Trp暴露在親水環(huán)境中，且紅移至335.4 nm，表明此時(shí)HPI結(jié)構(gòu)比較松散[2]。 在pH 6.0時(shí)，熒光強(qiáng)度下降，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生微小紅移至334.6 nm，表明pH 6.0條件下，酸誘導(dǎo)HPI蛋白分子展開，降低了Phe到Tyr和Trp的能量傳遞效率，使得Trp的熒光強(qiáng)度下降[14]。 在pH 8.0時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了重排，Trp和Trp的相互作用增強(qiáng)，同時(shí)蛋白分子表面的芳香族氨基酸由表面轉(zhuǎn)移至疏水核心，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增大[2, 6]。 而在pH 10.0時(shí)，HPI熒光強(qiáng)度顯著下降，最大吸收峰波長(zhǎng)微小藍(lán)移，表面Trp微環(huán)境變得更疏水，熒光強(qiáng)度顯著下降可能歸因于： (1)解離的Tyr殘基熒光消失，且Trp殘基的熒光可能被陰離子狀態(tài)的Tyr殘基猝滅； (2)溶劑猝滅效應(yīng)； (3)也可能是Lys和Arg殘基的正電荷被中和[2, 14]。 本試驗(yàn)在高pH值條件下熒光峰出現(xiàn)藍(lán)移，在低pH條件下熒光峰出現(xiàn)紅移，并暴露出更多芳香族氨基酸殘基于親水環(huán)境中，與藜麥蛋白質(zhì)分離[14]和麻仁球蛋白的行為類似[6]。

圖5 不同pH條件對(duì)HPI內(nèi)源熒光吸收的影響Fig.5 Effects of different pH on theintrinsic fluorescence of HPI

圖6 不同pH條件對(duì)HPI紫外吸收的影響Fig.6 Effects of different pH on the ultravioletspectrum of HPI

由圖6可知，pH值由7.0到3.0時(shí)，紫外吸收強(qiáng)度先減小后增大，在250，270和285 nm附近出現(xiàn)新的吸收峰，并伴隨著紅移，且290 nm以后的吸收峰逐漸削弱； 該變化趨勢(shì)與熒光光譜反映出的現(xiàn)象基本一致。 在pH 3.0時(shí)，紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜峰信號(hào)和峰型與pH 7.0現(xiàn)象相比變化顯著，峰吸收強(qiáng)度增大，且發(fā)生紅移，表明低pH條件下HPI結(jié)構(gòu)得到適當(dāng)舒展，Phe和Tyr殘基的微環(huán)境變得更親水，在270 nm出現(xiàn)的峰是Tyr殘基特征峰，可能與Tyr上的酚羥基電離后酚氧原子與苯環(huán)的大π鍵的共軛效應(yīng)有關(guān)； 在250 nm附近出現(xiàn)新的峰是Phe的特征峰，這可能是由于Phe殘基之間的相互作用被減弱，同時(shí)Tyr殘基的吸收紅移，使得原本被掩蓋的Phe殘基特征峰顯露出來(lái)。 由此推測(cè)酸誘導(dǎo)HPI變性時(shí)，HPI分子結(jié)構(gòu)得到適當(dāng)舒展，使得更多疏水性氨基酸殘基暴露于微環(huán)境中。

在pH由7.0到10.0時(shí)，紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜峰型也發(fā)生顯著變化，紫外吸收增強(qiáng)且伴隨著藍(lán)移，而研究認(rèn)為在三種發(fā)色氨基酸中，Phe是疏水性最強(qiáng)的，pH變化基本不會(huì)引起其電離度和質(zhì)子化的變化； 引起這一變化主要可能是強(qiáng)堿條件下蛋白結(jié)構(gòu)打開，Phe殘基之間的相互作用減弱，導(dǎo)致π→π*能極差下降，由此推測(cè)堿性條件下含有Phe殘基的側(cè)鏈柔性增強(qiáng)。

圖7 不同pH條件對(duì)HPI粒徑的影響Fig.7 Effects of different pH on the size of HPI

由圖7可知，在不同pH條件下，HPI粒徑與天然態(tài)(pH 7.0)相比均增大，天然態(tài)的HPI主要以單體形式存在[圖2(a)]，在pH降低過程中，HPI粒徑不斷增大，pH 6.0時(shí)有最大平均粒徑，這是因?yàn)閜H 6.0條件最靠近等電點(diǎn)，HPI表面電荷絕對(duì)值較低，分子之間的排斥力減弱，容易發(fā)生聚集形成大的聚集體。 pH 3.0條件下HPI粒徑增大是因?yàn)閺?qiáng)酸條件蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，肽鏈展開(圖5和圖6)，且蛋白表面正電勢(shì)增大，分子間的排斥力增大，抑制了分子之間的聚集，但一定程度上促進(jìn)了線性多聚體的產(chǎn)生，從而提高蛋白溶解度[15]。 在pH增大過程中，蛋白粒徑逐漸增大； pH 8.0時(shí)，粒徑主要分布在10～11和50～60 nm范圍，保持了大部分單體。 在pH 10.0時(shí)，粒徑進(jìn)一步增大，可能是因?yàn)榈鞍捉Y(jié)構(gòu)舒展后，形成更多的單體分子形成線性聚集體。

由圖5—圖7可知，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，能使HPI分子結(jié)構(gòu)得到適當(dāng)伸展，粒徑變大，使得芳香族氨基酸殘基之間的距離增大，降低了Phe到Tyr和Trp的能量傳遞效率，最終導(dǎo)致Try殘基熒光強(qiáng)度減弱，Phe和Tyr殘基的熒光部分被顯示，表明在強(qiáng)酸強(qiáng)堿pH條件下HPI溶解度得到改善。 從熒光光譜和紫外光譜的變化趨勢(shì)可知，在酸性條件下HPI的構(gòu)象穩(wěn)定性相對(duì)較差，蛋白亞基容易發(fā)生解離締合反應(yīng)； 而在堿性條件下，HPI構(gòu)象則相對(duì)穩(wěn)定，且HPI構(gòu)象具有更大柔性，這與大豆硒蛋白的構(gòu)象類似[15]。 因此借助熒光光譜和紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜，可以推測(cè)HPI氨基酸殘基微環(huán)境的變化，從而了解蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的變化信息。

3 結(jié) 論

漢麻分離蛋白與大豆分離蛋白相比，其分子構(gòu)象存在很大差異，分子內(nèi)含有更多的二硫鍵，圓二色譜和傅里葉紅外光譜檢測(cè)結(jié)果顯示HPI含有更多的α-螺旋結(jié)構(gòu)； 熒光光譜和紫外光譜結(jié)果顯示HPI分子表面分布更多的芳香族氨基酸，增大表面疏水性，具有緊湊的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，能使HPI分子結(jié)構(gòu)得到適當(dāng)伸展，粒徑變大，使得芳香族氨基酸殘基之間的距離增大，降低了Phe到Tyr和Trp的能量傳遞效率，導(dǎo)致Try殘基熒光被屏蔽強(qiáng)度減弱，Phe和Tyr殘基的熒光部分被顯示。 相對(duì)而言，在酸性條件下HPI的構(gòu)象穩(wěn)定性相對(duì)較差，蛋白亞基容易發(fā)生解離締合反應(yīng)； 而在堿性條件下，HPI構(gòu)象則相對(duì)穩(wěn)定，且構(gòu)象靈活性更大。