脂肪酶底物結(jié)合口袋的分子改造策略及進(jìn)展

蔡玉貞 白巧燕 蘇敏 唐良華

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108）

脂肪酶是一種可以在水/油界面上將長鏈三?；视王ニ鉃槎；视王?、單酰基甘油酯、甘油和游離脂肪酸的酶。大部分的脂肪酶都具有α/β水解酶折疊的結(jié)構(gòu)特征，活性位點是由Ser-His-Asp/ Glu組成的催化三聯(lián)體，但與大多數(shù)絲氨酸蛋白酶不同，該活性位點被包埋在酶分子的結(jié)構(gòu)內(nèi)部。

脂肪酶的活性位點附近結(jié)構(gòu)大多呈口袋的形狀，因此根據(jù)脂肪酶底物結(jié)合口袋的形狀，可將脂肪酶分為3個種類：（1）具有疏水性的裂縫狀結(jié)合口袋的脂肪酶；（2）具有隧道狀的結(jié)合口袋的脂肪酶；（3）具有漏斗狀的結(jié)合口袋的脂肪酶［1］（圖1）。大部分的脂肪酶都含有“蓋子”結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)一般是由一至兩個兩親性的α螺旋或者是一段loop構(gòu)成［2］。在水相中，脂肪酶的“蓋子”呈“閉合”狀態(tài)，活性中心被“蓋子”遮擋，脂肪酶表現(xiàn)出極低的催化活性甚至沒有催化活性。而在水/油界面中，脂肪酶的“蓋子”呈“開放”構(gòu)象，酶被“激活”，原本被“蓋子”覆蓋的活性中心被暴露出來，底物因此能夠進(jìn)入酶的底物結(jié)合口袋，與催化位點結(jié)合，相應(yīng)的催化反應(yīng)得以進(jìn)行。

脂肪酶具催化高效性和廣泛的底物特異性，且進(jìn)行催化反應(yīng)的條件溫和、安全，這使其在工業(yè)應(yīng)用中備受青睞，不管是在醫(yī)療領(lǐng)域還是在食品、化工領(lǐng)域，人們對脂肪酶催化能力的期待越來越高。由于酶的活性中心對脂肪酶的催化活性起著至關(guān)重要的作用，因此催化活性中心附近，即催化位點或底物結(jié)合口袋成為了脂肪酶改造的熱點區(qū)域。

圖1 三類脂肪酶底物結(jié)合口袋的三維立體結(jié)構(gòu)

1 脂肪酶底物結(jié)合口袋的改造策略

目前對脂肪酶的改造都是利用蛋白質(zhì)工程。蛋白質(zhì)工程的方向主要有定向進(jìn)化，半理性設(shè)計以及理性設(shè)計。定向進(jìn)化存在突變體篩選效率低和篩選工作量過于龐大等缺陷；而半理性設(shè)計和理性設(shè)計，則是在序列信息、結(jié)構(gòu)信息和催化機(jī)制等已有的蛋白質(zhì)信息的基礎(chǔ)上，通過定點突變或是縮減密碼子表、迭代飽和突變等方案大幅縮小突變體文庫、提高優(yōu)良突變體獲得的機(jī)率。因而，目前在酶的底物選擇性、催化活性和熱穩(wěn)定性改造等方面，半理性設(shè)計和理性設(shè)計是相對主流的改造策略（表1）。

改造酶的催化活性和穩(wěn)定性的著眼點主要在于改變酶分子內(nèi)部的氫鍵、范德華力、疏水作用、離子鍵、二硫鍵和π環(huán)體系的非經(jīng)典相互作用等。在底物結(jié)合口袋范圍內(nèi)，影響脂肪酶催化活性的主要因素是關(guān)鍵氨基酸的體積大小，親/疏水性大小，氨基酸殘基之間的各種相互作用，而本文講述的大多數(shù)改造底物結(jié)合口袋的半理性設(shè)計和理性設(shè)計均是以氨基酸的側(cè)鏈大小、親/疏水性以及π環(huán)體系相互作用等為出發(fā)點進(jìn)行的。

1.1 理性設(shè)計

1.1.1 改變底物結(jié)合口袋中氨基酸殘基側(cè)鏈的大小 由于組成脂肪酶底物結(jié)合口袋的氨基酸的側(cè)鏈大小可以影響底物進(jìn)入口袋的空間位阻，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合，因此它們對脂肪酶的底物選擇性、底物的進(jìn)入和底物的釋放均有著緊密的聯(lián)系。一般可利用小側(cè)鏈氨基酸替代底物結(jié)合口袋內(nèi)的氨基酸以降低酶活性位點處的空間位阻，進(jìn)而增加酶與底物的結(jié)合或相互作用，從而影響酶的酶學(xué)性質(zhì)，如底物鏈長的偏好、立體選擇性和位置選擇性［3］。這一理性設(shè)計策略，事實上已被廣泛應(yīng)用［4］。

Brundiek等［5］對南極假絲酵母脂肪酶A（Candida antarctica lipase A，CALA）短鏈脂肪酸選擇性相關(guān)區(qū)域，即其?；Y(jié)合口袋進(jìn)行改造。選擇CALA初級?；Y(jié)合口袋處的G237進(jìn)行理性設(shè)計，以期達(dá)到提高CALA對中長鏈脂肪酸（C6-C12）的特異性的目的。與野生型CALA相比，突變體G237V 和G237Y對pNP-丁酸和pNP-己酸的水解活性顯著提高，其中G237Y對pNP-己酸的水解活性是野生型的3倍。突變體G237V 和G237Y都增加了底物結(jié)合主隧道的空間位阻，導(dǎo)致了中長鏈脂肪酸底物被分流到另一個可替代的結(jié)合口袋中，從而增加了酶對中長鏈脂肪酸的特異性。

Zhao等［6］對從鏈霉菌W007菌株中分離的脂肪酶MAS1進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，在MAS1的底物結(jié)合口袋中存在8個具有較大側(cè)鏈的氨基酸（F39、D137、H108、F153、Q201、V202、V203和V233），并且可能會影響脂肪酶MAS1的催化功能。

因此，Zhao等［6］利用丙氨酸分別替換這8個氨基酸，期望通過減小底物結(jié)合口袋的空間位阻以提高脂肪酶的催化活性。通過篩選得到較好的突變體H108A、F153A和V233A，以pNP-C8為底物測得它們的kcat/Km分別是野生型的2.3、2.1、1.4倍。這3個突變體鏈長偏好由中短鏈轉(zhuǎn)變?yōu)榱酥虚L鏈。它們對pNP-C16的比活分別比野生型提高了3.0、2.2、2.0倍。一般來說增大脂肪酶底物結(jié)合口袋處的氨基酸空間位阻，會降低其對長鏈脂肪酸的選擇性，但是也有例外［7］。

表1 脂肪酶底物結(jié)合口袋改造策略及成果

南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）具有一個立體專一性的口袋，該口袋由Thr42、Ser47和Trp104構(gòu)成。由于該立體專一性口袋空間的局限，導(dǎo)致其只對取代基不大于乙基的仲醇具有較高的立體選擇性。為提高CALB對具有大取代基的仲醇的選擇性，Magnusson等［8］構(gòu)建突變體Trp104Ala，以增大該結(jié)合口袋的空間。突變體Trp104Ala對4-庚醇和5-壬醇的底物特異性分別提高了270倍和5 500倍。

1.1.2 改變底物結(jié)合口袋的親、疏水性 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征是其親水/疏水性的作用的平衡結(jié)果：蛋白質(zhì)中大部分的非極性氨基酸側(cè)鏈因避開水向蛋白質(zhì)的內(nèi)核聚集，而在外層的大部分是親水性氨基酸，蛋白質(zhì)的這種結(jié)構(gòu)在水溶液中非常穩(wěn)定。疏水作用有助于肽鏈的折疊，因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在很大程度上受疏水作用的影響。由于脂肪酶的底物結(jié)合口袋呈疏水性，因此維持甚至是提高脂肪酶底物結(jié)合口袋的疏水性能夠增加其對底物酯的結(jié)合、選擇性［9］及口袋的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致脂肪酶的催化活性和熱穩(wěn)定性等方面的提高。

Wahab等［10］通過定點突變用疏水性的Leu和Met替代Geobacillus zalihae 脂肪酶（T1脂肪酶）氧陰離子洞處的Q114，以丁酸薄荷酯的酯化反應(yīng)為模型，評估了野生型和突變體的催化效率。最終發(fā)現(xiàn)酶的突變體Q114L的轉(zhuǎn)化率可達(dá)92%，而野生型只有84.6%。這是由于局部的疏水性的增加增強(qiáng)了疏水鍵、范德華力等相互作用，使酶能更長時間地保持催化位點附近有活性的結(jié)構(gòu)形狀。

通過增加底物結(jié)合口袋的親水性也能夠提高脂肪酶對長鏈脂肪酸的選擇性。江傳歡等［7］為了提高華根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶對長鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸的特異性，分別將底物結(jié)合口袋中的L285、T286突變成谷氨酰胺，并且另構(gòu)建一突變體HQL：在H284 和L285之間插入一個谷氨酰胺，以增加該位置的親水性。結(jié)果表明，突變體HQL對長鏈脂肪酸的特異性增強(qiáng)了，其對p-NPP（C16）的催化活性為野生型的2.72倍，且其水解不飽和脂肪酸的活性是飽和脂肪酸1.45倍，而野生型只有1.10倍。而L285Q在不同鏈長脂肪酸的底物中，對p-NPP（C16）的催化活性最高，是野生型的1.5倍。

1.1.3 增加π環(huán)體系的非經(jīng)典相互作用 脂肪酶中芳香族氨基酸除了能夠與周圍的氨基酸形成疏水相互作用之外，還能形成非經(jīng)典的相互作用，如π-π、C-H…π，N-H…π，O-H…π和陽離子…π相互作用［11］。芳香族氨基酸殘基之間的相互作用在蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起著重要的作用［12-13］。疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosus lipase，TLL）、疏綿狀嗜熱絲孢菌DSM 10635脂肪酶（Thermomyces lanuginosus DSM 10635 lipase，Lip）、米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase，ROL）和米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase，RML），具有高度的結(jié)構(gòu)同源性。Ding等［14］構(gòu)建了上述4個脂肪酶的雙突變體：TLL（P207F/L259F），Lip（P207F/L259F），ROL（P210F/L258F）和 RML（P209F/L258F），它們對中長鏈的對硝基苯酯的比活分別提高了7.13倍（C6）、2.94倍（C8）、6.16倍（C6）、3.98倍（C6）。以脂肪酶RML為例，P209和L258都位于RML的酰基口袋的底部，RML雙突變體（P209F/L258F）中的Phe209破壞了Pro209與Arg178之間的氫鍵相互作用，與Phe215形成了新的π-π鍵堆積相互作用，這個π-π相互作用有助于穩(wěn)定“蓋子”在開放構(gòu)象中的結(jié)構(gòu)，增加結(jié)合口袋對偏好底物的接受，從而提高RML突變體P209F/L258F的催化活性。

1.2 半理性設(shè)計

半理性設(shè)計結(jié)合了理性設(shè)計與定向進(jìn)化兩種改造策略的優(yōu)點，在酶分子結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)上，合理選擇一至多個氨基酸作為突變靶點，通過不同簡并性的氨基酸密碼子表構(gòu)建小的突變文庫，降低了篩選工作量，提高了分子改造的效率。

Yen等［15］分別對皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，LIP2）底物結(jié)合口袋中的L132和G450進(jìn)行定點飽和誘變，以研究這兩個氨基酸對LIP2底物特異性的影響。LIP2的野生型對短鏈的脂肪酸表現(xiàn)出很高的選擇性，而突變體L132A和L132I的底物特異性則表現(xiàn)出向中長鏈的脂肪酸轉(zhuǎn)移，這說明L132對LIP2的底物特異性具有很重要的作用。在單位點飽和突變的基礎(chǔ)上，結(jié)合應(yīng)用簡并密碼子、計算機(jī)預(yù)測和高通量篩選等技術(shù)的組合活性中心飽和突變（Combinatorial active-site saturation test，CAST）則是一種更高效的突變策略。Engstr?m等［16］為了提高南極假絲酵母脂肪酶A（Candida antarctica lipase A，CALA）對α-取代酯的對映體選擇性和催化活性，以2-苯基丙酸對硝基苯基酯為底物，進(jìn)行計算機(jī)對接分析，在底物結(jié)合口袋中選出了4個可能對CALA的對映選擇性影響較大的氨基酸。在CAST基礎(chǔ)上利用簡并氨基酸密碼子NDT，構(gòu)建了兩個組合突變文庫：文庫FI（Phe149和 Ile150）和文庫FG（Phe233和Gly237）。在文庫FI中篩選出活性和對映選擇性都得到提高的最佳突變體F233G，其E值高達(dá)259，而且發(fā)生了對映體選擇性的逆轉(zhuǎn)。

Reetz 等［17］于2007年首次提出迭代飽和突變（Iterative saturation mutagenesis，ISM）策略：選擇脂肪酶活性位點中的多個位點，對其分別進(jìn)行飽和突變、逐代循環(huán)；每個位點可以由1-3個氨基酸組成。每個位點包含的氨基酸的選擇可以是臨近氨基酸之間的組合，而位點之間的選擇可以跨脂肪酶的?；诖痛蓟诖M(jìn)行選擇。Wu等［18］為了篩選出能夠?qū)Ζ?取代羧酸酯進(jìn)行動力學(xué)拆分并具有高立體選擇性的南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）突變體，他們將醇基結(jié)合口袋的相關(guān)氨基酸殘基兩兩分成一個位點，位點A：Trp104 /Ser105、位點D：Ala281/Ala282；酰基結(jié)合口袋的相關(guān)氨基酸殘基分為位點B：Leu144/Val149、位點C：Ile189/Val190、位點E：Val154/Gln157。利用NDT密碼子簡并性對這5個位點進(jìn)行迭代飽和誘變（ISM），通過“A→D→B→E”的突變途徑篩選出立體選擇性逆轉(zhuǎn)的最佳R-選擇性突變體RG401；通過“D→C→B”突變途徑篩選出了最佳的S-選擇性突變體SG303。其中SG303對2-苯基丙酸對硝基苯酯的kcat/Km值是野生型的近277倍，突變體RG401對R-2-苯基丙酸對硝基苯酯的活性比野生型高15倍。在ISM的基礎(chǔ)上，Xu等［19］提出了聚焦合理迭代位點特異性突變（Focused rational iterative site-specific mutagenesis，F(xiàn)RISM）策略，通過使用高度縮減的氨基酸字母表在特定位點上構(gòu)建小型突變體文庫，再進(jìn)行迭代突變。利用這一策略，Xu等［19］分別對CALB的?；痛蓟Y(jié)合口袋進(jìn)行改造，獲得了4個立體選擇性高度互補(bǔ)的突變體：Mutant-RacidRalco、Mutant-SacidRalco、Mutant-RacidSalco和Mutant-SacidSalco，它們對各自最佳對映體的選擇性皆高于90%。以上策略的運用需要了解酶的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制和大量前期實驗成果的積累作為基礎(chǔ)，因此這項技術(shù)更適用于結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)被解析得較為透徹的酶的改造。迭代飽和誘變策略除了能夠用于提高對映體選擇性外，還能用于脂肪酶的熱穩(wěn)定性的改造［17］等。

2 展望

在脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)中，能夠影響其催化活性等理化性質(zhì)的因素主要有范德華力、離子鍵、氫鍵、鹽橋、疏水相互作用、二硫鍵、芳香環(huán)相互作用、氨基酸殘基大小等。針對底物結(jié)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造也有導(dǎo)致酶活性下降甚至失活的風(fēng)險。在這些影響因素中，疏水相互作用和氨基酸殘基大小常常是理性設(shè)計的考慮范圍，而鹽橋和二硫鍵更適合于在脂肪酶的表面進(jìn)行改造以提高其穩(wěn)定性。受限于目前對酶的結(jié)構(gòu)與功能的解析尚不夠全面的現(xiàn)狀，在底物結(jié)合口袋范圍內(nèi)，欲綜合地運用以上這些影響因素，對酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以大幅改善酶的諸多催化性質(zhì)，尚是一個較大的挑戰(zhàn)。

隨著越來越多酶分子改造研究資料的積累，酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系會越來越清晰，酶分子的改造也會更為容易。在可預(yù)期的一段時間內(nèi)，針對酶的活性中心、底物結(jié)合口袋的改造仍然是目前研究的熱點。一方面，要更加重視高通量篩選方法的構(gòu)建，來推進(jìn)定向進(jìn)化策略的應(yīng)用；另一方面，也要通過更多酶分子高級結(jié)構(gòu)的精確解析、計算機(jī)軟件更為準(zhǔn)確的模擬以及分子對接等，提升理性設(shè)計及半理性設(shè)計策略應(yīng)用的效率。2016年，Nature發(fā)表的“The coming of age of de novo protein design”一文表明蛋白質(zhì)設(shè)計時代的來臨。借助計算機(jī)的輔助可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行局部的設(shè)計改造，也可以進(jìn)行全蛋白設(shè)計。在信息技術(shù)飛速發(fā)展的當(dāng)今，在蛋白質(zhì)物理和能量理論基礎(chǔ)上發(fā)展出了許多算法，如蒙特卡羅（Monte Carlo，MC）算法及其衍生算法。基于Metropolis MC（MMC）算法的Rosetta服務(wù)器、基于副本交換（Replica exchange MC，REMC）算法的QUARK服務(wù)器等被用于改造酶的活性中心［20-21］、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測、蛋白質(zhì)從頭設(shè)計。甚至人工智能（機(jī)器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)等）也被應(yīng)用于酶工程［22］。因此，值此計算機(jī)設(shè)計在蛋白質(zhì)工程方面應(yīng)用的迅猛發(fā)展時代，如能將計算機(jī)輔助設(shè)計技術(shù)、人工智能靈活應(yīng)用于酶的底物結(jié)合口袋的改造，將加快酶分子進(jìn)化的效率與進(jìn)程，更好地適應(yīng)酶在各方面應(yīng)用中的不同需求。