非生物脅迫下植物DNA甲基化研究進(jìn)展

劉治民 楊芷怡 冀鳳丹 梅志超 于佳慧 解莉楠

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

植物生活在不斷變化的環(huán)境中，這些環(huán)境通常不利于植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。一般來(lái)說(shuō)，環(huán)境脅迫可以大致分為生物脅迫和非生物脅迫，其中生物脅迫包括各種病原體感染和食草動(dòng)物侵襲等；非生物脅迫主要包括干旱脅迫、高鹽脅迫、極端溫度脅迫和重金屬脅迫等［1］。這些脅迫在一定程度上打破植物細(xì)胞內(nèi)已建立的穩(wěn)態(tài)，從而使細(xì)胞代謝紊亂，生理功能失調(diào)，阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育，最終降低農(nóng)作物的產(chǎn)量。氣候變化導(dǎo)致極端天氣發(fā)生的頻率增加，并且加劇了這些非生物脅迫對(duì)植物的不利影響［2］。作為固著生長(zhǎng)的植物，不能主動(dòng)躲避自然界中不良的環(huán)境刺激，但在漫長(zhǎng)的進(jìn)化和適應(yīng)過(guò)程中，植物發(fā)展出適應(yīng)某些環(huán)境因素的能力，演化出能自我保護(hù)和適應(yīng)不良環(huán)境的機(jī)制［3-4］。通常，植物可以采取3種策略來(lái)降低甚至避免這些不利影響，即耐受、抵抗和逃逸。生物適應(yīng)性應(yīng)答是由多基因控制的，在很大程度依賴基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，需要逆境相關(guān)基因表達(dá)的激活或抑制來(lái)協(xié)調(diào)，植物可以通過(guò)在整個(gè)基因組轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上的快速而協(xié)調(diào)地變化來(lái)完成這些防御行為［5-6］。

生存在各種不利條件下，植物可以通過(guò)多種基因調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)恢復(fù)和重建細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在過(guò)去幾十年里，科學(xué)家們開(kāi)展了大量對(duì)環(huán)境脅迫相關(guān)基因的研究，包括環(huán)境脅迫下基因表達(dá)模式，轉(zhuǎn)錄后修飾模式，以及基因編碼的蛋白質(zhì)的功能及其作用模式。這些研究豐富了對(duì)植物在干旱、高鹽、冷和熱等非生物脅迫下如何提高適應(yīng)性的理解，并且逐漸應(yīng)用于提升植物抗性，以便于擴(kuò)寬耕地，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量［7-11］。近年來(lái)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾廣泛參與植物脅迫應(yīng)答中。

表觀遺傳學(xué)是一門(mén)快速發(fā)展的學(xué)科，它指在基因的核苷酸序列沒(méi)有發(fā)生改變的情況下，研究生物體可以遺傳的表型變化。表觀遺傳機(jī)制在動(dòng)植物的生命周期中起著十分重要的作用。表觀遺傳修飾，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA（Non-coding RNA，ncRNA），會(huì)影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和可及性，從而動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［12］。DNA甲基化是目前研究最為廣泛的表觀遺傳修飾類型，科學(xué)家對(duì)DNA甲基化機(jī)理和功能的研究也最為清楚。研究表明，DNA甲基化在植物非生物脅迫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，使植物能夠在惡劣的環(huán)境中生存。例如，RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RNAdirected DNA methylation，RdDM）途徑介導(dǎo)的DNA甲基化可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)大量熱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)［13］；受鹽誘導(dǎo)的AtMYB74轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在正常條件下被RdDM沉默，但在鹽處理后被激活［13-14］。本文主要綜述了近年來(lái)DNA甲基化的基本概況，以及非生物脅迫下的DNA甲基化調(diào)控，旨在為利用表觀遺傳機(jī)制提高植物的抗脅迫能力提供指導(dǎo)。

1 DNA甲基化概述

在植物中，DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，將S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）的甲基轉(zhuǎn)移給DNA胞嘧啶，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的過(guò)程。一種特定的DNA甲基化狀態(tài)是DNA甲基化建立、維持和主動(dòng)清除的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的結(jié)果，這些活動(dòng)由不同的酶催化，并通過(guò)不同途徑靶向特定的基因組區(qū)域。在植物中，DNA甲基化發(fā)生在含有各種胞嘧啶的序列中，包括CG、CHG和CHH（其中H表示A、T或C），它們分別被甲基轉(zhuǎn)移酶1（Methyl-transferase 1，MET1）、染色質(zhì)甲基化酶3（Chromomethylase3，CMT3）和結(jié)構(gòu)域重排甲基化酶2（Domain Rearranged Methylase 2，DRM2）催化。CG和CHG對(duì)稱性位點(diǎn)上的甲基化是通過(guò)甲基化維持機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，而非對(duì)稱CHH位點(diǎn)甲基化必須通過(guò)在DNA復(fù)制后進(jìn)行從頭甲基化來(lái)維持，RdDM途徑對(duì)CHH甲基化的維持起著至關(guān)重要的作用。DNA去甲基化有有兩種形式，一種是在復(fù)制過(guò)程中由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性不足或甲基供體不足導(dǎo)致無(wú)法維持甲基，即被動(dòng)去甲基化；另一種是通過(guò)DNA去甲基化酶介導(dǎo)的主動(dòng)去甲基化［12，15-17］。

1.1 DNA甲基化的建立

在植物中，DNA從頭甲基化是通過(guò)RdDM途徑介導(dǎo)的，除了蛋白質(zhì)外，小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）和 支 架RNA（Scaffold RNA）也參與了該途徑［15］。在經(jīng)典的RdDM途徑中（圖1），植物特有的DNA依賴性RNA聚合酶POL Ⅳ催化產(chǎn)生長(zhǎng)為30-40個(gè)核苷酸（Nucleotide，nt）的轉(zhuǎn)錄本，隨后RNA依賴性RNA聚合酶RDR2（RNAdependent RNA polymerase 2，RDR2）以之為模板合成雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA），并通過(guò)切割樣酶DCL3（Dicer-like protein 3，DCL3）將dsRNA裂解為24 nt siRNA。siRNA被裝載到AGO（Argonaute，AGO）蛋白上，主要是AGO4和AGO6，并與由DNA依賴的RNA聚合酶POL Ⅴ催化產(chǎn)生的互補(bǔ)支架RNA配對(duì)，AGO4招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2到靶位點(diǎn)，催化DNA從頭甲基化［16，18-20］。RDM1（RNA-directed DNA methylation 1，RDM1）可以與DRM2和AGO4締合，并結(jié)合單鏈甲基化DNA，從而輔助該反應(yīng)進(jìn)行［21］。已存在的染色質(zhì)修飾可以介導(dǎo)POL IV和POL V被特異性招募到RdDM靶向位點(diǎn)。SHH1招募POL IV，并通過(guò)它的Tudor結(jié)構(gòu)域與H3K9me2的H3結(jié)合，同時(shí)與CLSY1相互作用，介導(dǎo)Pol IV定位到靶向位點(diǎn)［22-24］。SUVH2和SUVH9可以和DDR（DRD1/ DMS3/ RDM1）復(fù)合體相互作用，并通過(guò)其SRA結(jié)構(gòu)域識(shí)別甲基化的胞嘧啶，介導(dǎo)POL V定位到適當(dāng)?shù)奈恢茫?5］。POL V轉(zhuǎn)錄的ncRNA通過(guò)RRP6L1被保留在染色質(zhì)附近［26］。IDP復(fù)合體可以穩(wěn)定支架RNA，并與SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體相互作用，通過(guò)SWI/SNF復(fù)合體改變核小體位置［27-28］。

圖1 擬南芥中經(jīng)典的RdDM途徑介導(dǎo)DNA甲基化［15］

除了經(jīng)典的RdDM途徑外，DNA依賴性RNA聚合酶II（POL II）和RDR6參與非經(jīng)典的RdDM途徑產(chǎn)生siRNA。POL II和RDR6產(chǎn)生的前體RNA可以被DCL2和DCL4切割產(chǎn)生21 nt或22 nt siRNA，21 nt或22 nt siRNA結(jié)合AGO6蛋白，從而激發(fā)24 nt siRNA依賴的甲基化途徑，也可以被DCL3切割生成24 nt siRNA，起始DNA甲基化［29-31］。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些不依賴于DCL蛋白產(chǎn)生的siRNA也有可能參與 DNA 甲基化的起始過(guò)程［32］。

1.2 維持DNA甲基化

植物中DNA甲基化的維持取決于特定的胞嘧啶序列，并受DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化。MET1可以識(shí)別復(fù)制后半甲基化的CG序列，并介導(dǎo)子鏈中未甲基化的胞嘧啶甲基化，以維持CG甲基化［33］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，CHG甲基化的維持主要受CMT3催化，少量由CMT2催化［34-35］。Du等［36］發(fā)現(xiàn)玉米（Zea mays）中CMT3同源蛋白MET2A可以和H3K9me2結(jié)合，阻斷CMT3和H3K9me2相互作用，會(huì)破壞CMT3與核小體的結(jié)合，并導(dǎo)致CMT3失去活性，DNA甲基化水平顯著下降。SUVH4通過(guò)其SRA結(jié)構(gòu)與甲基化的CHG結(jié)合，并促使H3K9甲基化［37］。CHH甲基化由DRM2或CMT2維持，DRM2可以在RdDM靶向區(qū)域維持CHH甲基化［38］，而CMT2 則催化含有組蛋白H1的異染色質(zhì)的CHH甲基化［39］。

1.3 DNA去甲基化

DNA甲基化可以被動(dòng)失去或主動(dòng)清除，這兩者分別稱為被動(dòng)DNA去甲基化和主動(dòng)DNA去甲基化。被動(dòng)DNA去甲基化取決于DNA復(fù)制。在DNA復(fù)制過(guò)程中（圖2-A），如果新合成的DNA鏈沒(méi)有被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶正確靶向或者甲基供體不足，則會(huì)導(dǎo)致新的DNA鏈沒(méi)有發(fā)生甲基化，DNA甲基化水平就會(huì)隨著DNA復(fù)制被稀釋［40］。主動(dòng)DNA去甲基化由DNA去甲基化酶催化。在植物中，DNA去甲基化酶有雙功能酶活性功能域，即DNA糖基化酶活性和無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶裂解酶活性，DNA去甲基化酶通過(guò)參與堿基切除修復(fù)途徑啟動(dòng)DNA去甲基化［41-43］。在植物中，DNA糖基化酶可以直接識(shí)別并切除5-mC堿基。在擬南芥中，DNA去甲基化酶家族主要含有4種蛋白質(zhì)：沉默抑制因子（Repressor of silencing 1，ROS1）、5-mC糖基化酶Demeter（DME）、DML2（Demeter-like proteins 2）和DML3［41，43］。在去甲基化過(guò)程中（圖2-B），IDM復(fù)合體識(shí)別高度甲基化區(qū)域，介導(dǎo)H3K18Ac，為其招募的ROS1行使功能提供相對(duì)松散的染色質(zhì)環(huán)境，但目前尚不清楚ROS1被招募的具體機(jī)制［44］。DNA去甲基化酶被招募后首先發(fā)揮DNA糖基化酶活性，水解堿基和脫氧核糖之間的糖苷鍵，然后作為無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶裂解酶切割DNA骨架，產(chǎn)生無(wú)堿基位點(diǎn)。在切口處3'末端進(jìn)行β-消除產(chǎn)生3'-磷酸-α，β-不飽和醛（3'-PUA）或進(jìn)行β，δ-消除產(chǎn)生3'-磷酸。隨后APE1L將β-消除產(chǎn)生的3'-PUA轉(zhuǎn)化為3'-OH，ZDP將β，δ-消除產(chǎn)生的3'-磷酸轉(zhuǎn)化為3'-OH，然后DNA聚合酶和連接酶來(lái)連接切口［45-46］。目前尚不清楚哪種聚合酶參與這一過(guò)程，但在擬南芥中發(fā)現(xiàn)DNA連接酶LIG1與ROS1、ZDP和APE1L共定位，介導(dǎo)去甲基化后DNA鏈切口的連接［47］。

圖2 擬南芥DNA去甲基［15］

2 非生物脅迫下的DNA甲基化調(diào)控

2.1 鹽脅迫

土壤中鹽（主要是Na+）含量過(guò)高會(huì)使植物遭到滲透脅迫、離子脅迫以及氧化脅迫等次生脅迫，這將阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而降低農(nóng)作物的產(chǎn)量。研究員對(duì)植物適應(yīng)鹽脅迫的機(jī)理研究較為透徹。在植物中，細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)是由Ca2+-鈣調(diào)素B樣蛋白（CBL）-CBL相互作用蛋白激酶（CIPK）模塊調(diào)控。高Na+、低K+、過(guò)量的Mg2+和高/低PH會(huì)使Ca2+快速轉(zhuǎn)移，分別激活SOS3-SOS2-SOS1（Salt overly sensitive，SOS）、CBL1/9-CIPK23-AKT1（Arabidopsis K+Transporter，AKT1）、CBL2/3-CIPK3/9/23/26- Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和CBL2-CIPK11/14-H+ATPase信號(hào)通路［1］。HKT1（High-affinity K+channel 1，HKT1）是 參 與SOS途徑中重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)植物中Na+內(nèi)流。植物中，HKT1基因的突變可以抑制sos3對(duì)NaCl的超敏表型［48］。從ATG起始密碼起HKT1基因啟動(dòng)子的2.6 kb串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)域被高度甲基化［49］。在RdDM途徑中，RDR2是24-nt siRNA的生物合成所必需的。Baek等［49］揭示RDR2的突變導(dǎo)致AtHKT1基因的高轉(zhuǎn)錄，并且耗盡AtHKT1的RdDM靶向區(qū)域和串聯(lián)重復(fù)序列，從而產(chǎn)生NaCl敏感表型，這說(shuō)明AtHKT1是RdDM介導(dǎo)的DNA甲基化的靶基因。Kumar等［50］在小麥（Triticum aestivum）中也發(fā)現(xiàn)類似的調(diào)節(jié)行為。AtMYB74是R2R3-MYB基因家族的成員，其表達(dá)受鹽誘導(dǎo)，徐瑞等［14］發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下24-nt siRNA可以通過(guò)RdDM途徑調(diào)節(jié)AtMYB74的表達(dá)。Song等［51］發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下大豆（Glycine max）約有49個(gè)轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)表達(dá)差異，對(duì)這些基因的表達(dá)水平和DNA甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MYB、b-ZIP和AP2/DREB轉(zhuǎn)錄因子家族的表達(dá)圖譜與其序列的甲基化顯著相關(guān)。Huang等［52］在轉(zhuǎn)基因番茄（Solanum lycopersicum）中發(fā)現(xiàn)，SlAGO4A基因表達(dá)下調(diào)會(huì)改變一些活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除系統(tǒng)和植物防御相關(guān)基因的表達(dá)水平，以增強(qiáng)對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性，并且與野生型和SlAGO4A過(guò)表達(dá)植株相比，一些DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和RNAi途徑基因表達(dá)水平顯著偏低。這說(shuō)明SlAGO4A通過(guò)DNA甲基化和RNAi途徑的調(diào)節(jié)發(fā)揮負(fù)作用。

2.2 干旱脅迫

干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重影響正常植物的生理生化過(guò)程，產(chǎn)生滲透脅迫、氧化損傷以及光合作用下降等不良危害。為了減輕干旱對(duì)自身的影響，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物演化出能抵御和適應(yīng)不良環(huán)境的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。已經(jīng)證明DNA甲基化是植物參與適應(yīng)干旱脅迫的調(diào)節(jié)系統(tǒng)中重要的一環(huán)。Liang等［53］發(fā)現(xiàn)在毛果楊（Populus trichocarpa）中干旱脅迫可以誘導(dǎo)DNA甲基化水平的改變，進(jìn)而改變?cè)S多干旱脅迫基因的表達(dá)模式。Komivi等［54］將甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)合，分析芝麻（Sesamum indicum）中胞嘧啶甲基化模式、轉(zhuǎn)錄組的積累以及其在耐旱基因型中的相互作用。與對(duì)照組相比，干旱脅迫顯著增加DNA甲基化水平，而當(dāng)脅迫條件去除時(shí)，甲基化水平傾向于恢復(fù)到對(duì)照組水平。差異積累的轉(zhuǎn)錄 本（Differentially accumulated transcripts，DATs）分析顯示77%的DATs水平在干旱脅迫時(shí)下降，在恢復(fù)階段，超過(guò)80%的DATs水平升高，轉(zhuǎn)錄水平變化的模式與DNA甲基化改變密切相關(guān)。這說(shuō)明在干旱脅迫下高的從頭甲基化水平可能導(dǎo)致大量干旱應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄本水平的降低，而在恢復(fù)階段高去甲基化水平允許恢復(fù)干旱應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄本的積累。Sharma等［55］研究嚴(yán)重干旱對(duì)芥菜（Brassica juncea（L.）Czern.）變種RH30各種脅迫響應(yīng)基因甲基化水平的變化發(fā)現(xiàn)，在所有基因中基因體甲基化均增加，而啟動(dòng)子甲基化取決于基因的功能，負(fù)責(zé)延遲凋亡的基因啟動(dòng)子被低甲基化，而負(fù)責(zé)正?；顒?dòng)的許多基因在啟動(dòng)子區(qū)域被高甲基化。在響應(yīng)干旱脅迫時(shí)，脅迫相關(guān)基因通常表現(xiàn)出不同的甲基化和去甲基化事件，通過(guò)甲基化和去甲基化使脅迫響應(yīng)基因沉默或激活，以適應(yīng)極端的環(huán)境。脅迫因子可能也會(huì)直接影響甲基化酶和去甲基化酶來(lái)介導(dǎo)調(diào)節(jié)甲基化水平。Moglia等［56］發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫下，茄子（Solanum melongena L.）某些C5-MTases（Cytosine-5 DNA methyltransferase）和去甲基酶基因表達(dá)存在明顯的上調(diào)和下調(diào)，其他C5-MTase和脫甲基酶基因的表達(dá)譜無(wú)變化。

2.3 極端溫度脅迫

2.3.1 低溫脅迫 低溫脅迫被認(rèn)為是制約丘陵地區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展和作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一［57］。非冷凍低溫脅迫會(huì)引起冷害，如造成光合作用相關(guān)的損害，細(xì)胞凋亡失調(diào)，膜流動(dòng)性喪失以及最終萎縮，從而破壞植物的生長(zhǎng)生理。ICE-CBF-COR途徑在植物對(duì)抗低溫脅迫中起著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化調(diào)控與植物的耐寒性顯著相關(guān)。Guo［58］通過(guò)對(duì)篩選出的耐寒水稻（Oryza sativa L.cv.）P427低溫處理下生理特性、轉(zhuǎn)錄組和甲基化的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下ICE-CBF-COR途徑相關(guān)的基因包括WRKY基因表達(dá)量增加；OST1同源基因Os03g0610900啟動(dòng)子區(qū)域甲基化降低，而其表達(dá)水平升高。這表明低溫脅迫下，甲基化與基因表達(dá)水平存在差異。Kumar等［59］檢測(cè)到低溫和甲基化變化之間存在顯著的相關(guān)性，蘋(píng)果（Malus domestica）休眠期間的低溫處理很可能通過(guò)DNA甲基化來(lái)影響表觀遺傳調(diào)控。Song等［60］發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；种苿═richostatin A）和DNA甲基化抑制劑（5-Aza-2'-Deoxy cytidine）處理可以提高擬南芥在低溫脅迫下的耐寒性并影響低溫誘導(dǎo)基因的表達(dá)。產(chǎn)祝龍等［61］發(fā)現(xiàn)在rdm4突變體中，擬南芥耐寒性降低，CBFs和CBF調(diào)節(jié)基因表達(dá)量下降；但過(guò)表達(dá)RDM4時(shí)CBFs和CBF調(diào)節(jié)基因表達(dá)量增加，并且低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的膜損傷減少，表明RDM4在調(diào)節(jié)低溫下的基因表達(dá)中具有重要作用，可能是通過(guò)CBF途徑介導(dǎo)的。Zhu等［62］檢測(cè)到茶樹(shù)（Camellia sinensis）在低溫和干旱脅迫下，除CsCMT1和CsCMT2外，大多數(shù)CsC5-MTases基因表達(dá)顯著下調(diào)，而4種CsdMTase（DNA demethylase）基因的轉(zhuǎn)錄豐度顯著增加。綜上所述，脅迫因子可以改變DNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而改變脅迫響應(yīng)基因甲基化水平，介導(dǎo)植物對(duì)逆境的適應(yīng)。植物的低溫反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因和多個(gè)信號(hào)通路。甲基化調(diào)控只是植物低溫反應(yīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)方面。

2.3.2 熱脅迫 與低溫脅迫一樣，熱脅迫使植物發(fā)生一系列的形態(tài)、生理和生化變化，嚴(yán)重威脅植物的生長(zhǎng)發(fā)育。植物中熱脅迫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)得到了全面的闡述［63］。HsfA1（Heat shock transcription factor A1s）是參與熱脅迫響應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子，其活性受到如磷酸化/去磷酸化和蛋白-蛋白相互作用等翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，并且HsfA1可以直接誘導(dǎo)下游熱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，介導(dǎo)熱脅迫應(yīng)答［63］。已有研究表明表觀遺傳修飾調(diào)控了熱響應(yīng)基因的表達(dá)，并起到了預(yù)防熱相關(guān)損傷的作用。Qian等［64］通過(guò)熱脅迫下玉米葉片的DNA構(gòu)建了6個(gè)MethylRAD文庫(kù)，在對(duì)照組和熱脅迫處理?xiàng)l件下分別獲得14 187 048和16 985 118個(gè)凈讀數(shù)，其中有25 470個(gè)基因甲基化，并獲得325個(gè)差異甲基化基因（Differentially methylated genes，DMGs）（200個(gè)CCGG位點(diǎn)，125個(gè)在CCWGG位點(diǎn)），并發(fā)現(xiàn)在CCGG位點(diǎn)的101個(gè)DMGs和在CCWGG位點(diǎn)的57個(gè) DMGs甲基化水平上調(diào)，在CCGG位點(diǎn)的99個(gè)DMGs和 在CCWGG位 點(diǎn) 的68個(gè)DMGs甲基化水平下調(diào)。這說(shuō)明熱脅迫會(huì)誘導(dǎo)脅迫抗性基因的甲基化水平發(fā)生變化。擬南芥中，DRM1、DRM2和CMT3抑制蛋白SDC（Suppressor of DRM1 DRM2 CMT3，SDC）是一種介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的F-BOX家族蛋白，可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)一些長(zhǎng)期熱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)［65］。SDC基因是RdDM途徑的靶基因，在正常情況下被表觀沉默，但在熱脅迫下被激活。因此，該基因的活性有助于植物從脅迫中恢復(fù)［13］，表明熱脅迫的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)至少部分依賴于RdDM通路。Naydenov等［66］發(fā)現(xiàn)野生型DNA甲基化相關(guān)基因?qū)Ω邷赜刑禺愋苑磻?yīng)，一方面DRM2、NRPD1和NRPE1的表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)，且上調(diào)幅度低于ROS1；另一方面，高溫處理6 h后，MET1和CMT3的轉(zhuǎn)錄水平升高，但與對(duì)照組相比，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，MET1和CMT3轉(zhuǎn)錄水平下降；而在nrpd1a-1和nrpd1b-1的雙突變體中，高溫處理產(chǎn)生與野生型不同的表達(dá)譜圖：DRM2和MET1表達(dá)被強(qiáng)烈抑制，且ROS1的表達(dá)幾乎完全消失。此外，F(xiàn)an等［67］在油菜（Brassica napus）中鑒定了22 個(gè)DNA甲基化酶和去甲基化酶基因，在熱脅迫下，這些基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。這說(shuō)明，熱脅迫可能通過(guò)直接或間接影響參與DNA甲基化的基因的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)熱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，以達(dá)到對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)。

2.4 其他脅迫

適宜的營(yíng)養(yǎng)吸收方式對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制來(lái)適應(yīng)土壤中養(yǎng)分的變化。迄今為止，關(guān)于植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)脅迫反應(yīng)的表觀遺傳調(diào)控的研究主要集中在組蛋白甲基化、組蛋白變異和DNA甲基化等方面［68］。擬南芥在低磷脅迫下全基因組DNA甲基化發(fā)生廣泛重塑，一般情況下這些影響與基因的表達(dá)有關(guān)［69］。MSAP研究證實(shí)缺氮情況下，受脅迫植物的葉片組織中發(fā)生了基因座特異性甲基化改變［70］。Chen等［71］鑒定了長(zhǎng)期缺鋅時(shí)擬南芥全基因組范圍內(nèi)DNA甲基化的變化，并證明CG和CHG中的差異DNA甲基化與一些鋅缺乏基因的上調(diào)有關(guān)，而CHH沒(méi)有差異DNA甲基化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏非CG甲基化的ddc（drm1、drm2和cmt3）三突變體中，缺鋅時(shí)表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的發(fā)育缺陷。這說(shuō)明DNA甲基化動(dòng)態(tài)性與鋅缺乏引起的反應(yīng)有特殊的聯(lián)系。此外也有研究表明，一些關(guān)鍵的硫酸鹽反應(yīng)基因在響應(yīng)硫酸鹽脅迫時(shí)也依賴于DNA甲基化的調(diào)控［72］。脫落酸（Abscisic acid，ABA）是重要的植物逆境激素，多種環(huán)境脅迫會(huì)誘導(dǎo)ABA的生成。越來(lái)越多的研究表明ABA廣泛參與調(diào)控DNA甲基化與去甲基化依賴性基因的表達(dá)。例如，Kim等［73］發(fā)現(xiàn)一些受ABA誘導(dǎo)基因的表達(dá)也會(huì)受ROS1依賴的DNA去甲基化的調(diào)節(jié)。在黑藻（Hydrilla verticillate）中，過(guò)量的銅可以顯著誘導(dǎo)DRM、CMT和SUVH6等DNA甲基化相關(guān)蛋白的表達(dá)，這與暴露在過(guò)量的銅下黑藻DNA甲基化水平發(fā)生顯著變化一致，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ROS的產(chǎn)生參與全基因組DNA甲基化水平的改變［74］。與敏感型和沒(méi)有脅迫處理的抗性小麥相比，在重金屬鉛、鎘和鋅脅迫下，抗性小麥金屬解毒轉(zhuǎn)運(yùn)體基因TaHMA2和TaABCC2/3/4啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平偏低，轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)上調(diào)［75］。這說(shuō)明DNA甲基化參與小麥抵抗金屬毒性。

3 DNA甲基化介導(dǎo)的非生物脅迫記憶

在自然條件下，植物通常不可避免地經(jīng)歷重復(fù)的脅迫。如圖3所示，植物響應(yīng)脅迫刺激而產(chǎn)生的應(yīng)答可以是短期的，也可以是長(zhǎng)期的［76］。短期的應(yīng)答不可遺傳，只能給予植物當(dāng)代抗性和適應(yīng)性。越來(lái)越多的證據(jù)表明，脅迫條件下生長(zhǎng)的植物DNA甲基化模式可以跨代遺傳，給予植物當(dāng)代及其后代穩(wěn)定的抗性。例如，F(xiàn)eng等［77］發(fā)現(xiàn)在鹽和堿脅迫下，水稻不同基因型的自交后代中DNA甲基化水平持續(xù)存在。植物的這種脅迫誘導(dǎo)的跨代記憶有助于快速適應(yīng)多變的環(huán)境，在生存和繁殖之間達(dá)到更好的平衡［78］。Cong等［79］發(fā)現(xiàn)DNA甲基化參與水稻對(duì)重金屬脅迫反應(yīng)的跨代記憶，在響應(yīng)重金屬脅迫時(shí)重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶基因HMA表達(dá)上調(diào)，而且在去除重金屬后觀察到基因表達(dá)出現(xiàn)跨代記憶。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tos17的DNA甲基化狀態(tài)在重金屬脅迫下發(fā)生改變，并在三代內(nèi)表現(xiàn)為跨代遺傳。Verhoeven等［80］對(duì)蒲公英（Taraxacum officinale）無(wú)性系DNA甲基化的研究揭示與對(duì)照組相比，脅迫處理中甲基化位點(diǎn)改變的比例相對(duì)較高，且DNA甲基化的改變可以遺傳給后代。

圖3 DNA甲基化介導(dǎo)的逆境應(yīng)答和脅迫記憶過(guò)程示意圖

4 展望

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、介導(dǎo)植物對(duì)逆境的響應(yīng)以及控制植物的生長(zhǎng)發(fā)育方面起著重要的作用。通過(guò)對(duì)模式植物擬南芥以及其他生物的研究，人們對(duì)DNA甲基化建立、維持和主動(dòng)去除的動(dòng)態(tài)性機(jī)制有了更深的了解，并逐漸挖掘出DNA甲基化的功能。但是對(duì)一些介導(dǎo)DNA甲基化動(dòng)態(tài)性的關(guān)鍵酶的了解還不夠全面，甚至仍有一些關(guān)鍵酶是未知的。雖然已經(jīng)證明環(huán)境脅迫會(huì)導(dǎo)致DNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，但是這些脅迫信號(hào)是如何作用于這些基因還有待去發(fā)現(xiàn)。此外，在有絲分裂和減數(shù)分裂中，脅迫相關(guān)基因的甲基化模式有多大程度可以遺傳給后代，以及在后代中，這些脅迫記憶如何調(diào)控基因表達(dá)控，控制植物發(fā)育和抗逆性，還需要研究。作為一個(gè)完整的系統(tǒng)的有機(jī)體，脅迫處理會(huì)導(dǎo)致植物發(fā)生一系列包括DNA甲基化但又不局限于DNA甲基化的反應(yīng)，來(lái)適應(yīng)周圍的環(huán)境刺激。經(jīng)典的遺傳機(jī)制和包括組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA等在內(nèi)的表觀遺傳修飾共同參與植物對(duì)外在脅迫的應(yīng)答。隨著DNA測(cè)序技術(shù)、表達(dá)芯片以及高通量DNA甲基化分析技術(shù)的發(fā)展，研究人員得以深入研究逆境脅迫下植物基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組的變化，使得系統(tǒng)研究植物響應(yīng)脅迫因子的反應(yīng)機(jī)理成為可能。同時(shí)，對(duì)DNA甲基化調(diào)控的脅迫應(yīng)答的深入研究，為改良作物抗性和提高產(chǎn)量提供新的途徑。