蓋子區(qū)域氨基酸的定點(diǎn)突變對(duì)T1脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

朱彩林 呂祥 夏小樂(lè)

（工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué)，無(wú)錫 214122）

脂肪酶是工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的酶之一，是一種綠色催化劑，可催化水解反應(yīng)、酯化反應(yīng)或者酯交換反應(yīng)，主要用于油脂加工、保健品、手性化合物、生物能源、造紙和皮革等領(lǐng)域［1-2］。脂肪酶具有一個(gè)典型的蓋子結(jié)構(gòu)，覆蓋住酶的活性位點(diǎn)，當(dāng)脂肪酶位于油水界面時(shí)，蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變，蓋子結(jié)構(gòu)打開(kāi)，酶的活性中心暴露，酶與底物結(jié)合發(fā)生催化作用，稱為界面激活現(xiàn)象［3-4］。由于脂肪酶應(yīng)用范圍廣，并且催化條件復(fù)雜多變，良好的穩(wěn)定性成為酶在實(shí)際應(yīng)用中必備的重要性質(zhì)［5］，因此通過(guò)對(duì)蓋子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造以增強(qiáng)脂肪酶性能的研究也很多。Shih等［6］將Geobacillus sp.NTU 03脂肪酶蓋子區(qū)域189號(hào)的Asp殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，導(dǎo)致活性增強(qiáng)，但熱穩(wěn)定性降低。Santarossa等［7］將來(lái)源于Pseudomonas fragi的脂肪酶PCL蓋子結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基Thr137和Thr138分別突變成Val和Asn，導(dǎo)致突變體對(duì)底物的鏈長(zhǎng)選擇性發(fā)生改變。Panizza等［8］對(duì)來(lái)源于 Pseudomonas sp.CR611 的 Lip I.3脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)改造后，使突變體對(duì)底物4-甲基傘形酮庚酯水解活力明顯增強(qiáng)。Karkhane 等［9］將來(lái)源于 Bacillus thermocatenulatus脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)中的苯丙氨酸突變成丙氨酸后，突變體水解活力增加2.6倍。林瑞鳳等［10］通過(guò)對(duì)擴(kuò)展青霉蓋子結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，使突變體T81P和K94E的酶活力為野生型的3.95倍和3.97倍。

T1脂肪酶是近年來(lái)研究比較火熱的脂肪酶之一，該酶是一種高溫嗜堿酶，來(lái)源于Geobacillus zalihae菌株，由于具有良好的耐熱性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等各個(gè)領(lǐng)域。T1脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)由α6和α7螺旋組成，螺旋覆蓋酶活性位點(diǎn)，α6螺旋在界面激活過(guò)程中會(huì)發(fā)生明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)重組現(xiàn)象，此時(shí)酶催化口袋打開(kāi)，底物與酶結(jié)合并發(fā)揮催化作用［11］。由于T1脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用中經(jīng)常受各種極端條件的壓迫，如高溫、極端pH、有機(jī)溶劑等，通過(guò)理性改造獲得各種極端條件耐受性強(qiáng)的T1脂肪酶突變體顯得尤其重要，高穩(wěn)定性將能極大拓寬脂肪酶的可進(jìn)化性，提高酶的發(fā)展和應(yīng)用潛力［12］。

近年來(lái)，研究者們通過(guò)各種策略對(duì)T1脂肪酶進(jìn)行修飾改造，Ruslan等［13］通過(guò)在環(huán)間引入額外的離子對(duì)設(shè)計(jì)了T1脂肪酶突變體D311E，增加了T1脂肪酶的熱穩(wěn)定性，突變體比野生型T1脂肪酶表現(xiàn)出更高的Tm值。Wang等［14］利用分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬分析了不同溫度下T1脂肪酶蓋子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，通過(guò)活性位點(diǎn)處水分子的分布推測(cè)出T1脂肪酶的催化機(jī)制，并適用于其他耐熱性脂肪酶。Tang等［15］研究了T1脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域的疏水氨基酸對(duì)底物選擇性和熱穩(wěn)定性的影響，使突變體A186S和A190S的催化效率（kcat/Km）提高了35%-50%，但熱穩(wěn)定性下降。Wahab等［16］將T1脂肪酶的Gln114突變成Trp，導(dǎo)致蛋白穩(wěn)定性顯著下降，催化活性降低。

然而，之前對(duì)于脂肪酶包括T1脂肪酶在內(nèi)的改造重心主要集中在酶活和熱穩(wěn)定性兩方面，很難使酶其他方面的酶學(xué)性質(zhì)，如pH、金屬離子、有機(jī)溶劑耐受性等盡可能同時(shí)得到改善，對(duì)這些酶學(xué)性質(zhì)的詳細(xì)研究比較少，由于T1脂肪酶作為生物催化劑在工業(yè)應(yīng)用中會(huì)受到各種條件的脅迫，因此酶整體的酶學(xué)性質(zhì)依舊有待改良?？紤]到適當(dāng)?shù)膲毫?huì)使酶的α螺旋和β折疊不易壓縮，可提高酶在高溫下的熱穩(wěn)定性［17］。此外，目前已知20多種酶在壓力下會(huì)更穩(wěn)定且存在明顯的壓力激活現(xiàn)象［18］?；诖耍狙芯壳捌谕ㄟ^(guò)壓力擾動(dòng)耦合分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法對(duì)蓋子結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，最終得到3個(gè)效果較好的單點(diǎn)突變體A190L、L188M和A190Y。有趣的是，將氨基酸殘基Ala190突變成疏水性強(qiáng)的Leu和疏水性較弱的Tyr后都產(chǎn)生使蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)的趨勢(shì)，于是將L188M與Ala190處的兩個(gè)定點(diǎn)突變分別組合作深入探究，對(duì)突變體展開(kāi)最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性、金屬離子耐受性以及底物選擇性等酶學(xué)性質(zhì)研究，同時(shí)將單點(diǎn)與復(fù)合突變效果進(jìn)行比較，試圖找到酶學(xué)性質(zhì)改善更為全面的T1脂肪酶突變體，以進(jìn)一步拓寬該酶的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要模擬與分析軟件 GROMACS 5.0.3、FoldX、I-mutant 2.0、STRUM、DynaMut。

1.1.2 菌種及質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)用到的克隆宿主Escherichia coli（E.coli）JM109和質(zhì)粒pET28a均由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌表達(dá)宿主E.coli BL21（DE3）購(gòu)自生工生物工程有限公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)材料 蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉和卡那霉素，上海生工生物科技有限公司；咪唑、IPTG和酪氨酸，上海麥克林生化科技有限公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（EcoR I 和 BamH I），TaKaRa公司；棕櫚酸對(duì)硝基苯酯，碧云天生物術(shù)有限公司；膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒，AxyGen公司；Fast Mutagenesis Kit V2，諾唯贊生物科技有限公司；目的基因及引物由金唯智生物科技有限公司合成。引物如表1所示。

表1 突變體引物

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 YP20002電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；TGL-16M 離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Tanon 電泳儀，上海天能科技有限公司；EDG-81 PCR儀，東勝創(chuàng)新生物技術(shù)科技有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific公司；DRB200 金屬浴，美國(guó)HACH公司。

1.2 方法

1.2.1 突變體的虛擬篩選 以野生型T1脂肪酶的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：2DSN）為初始模型，在不同壓力（1 Bar、100 Bar、500 Bar、1 000 Bar、2 000 Bar、4 000 Bar）及313 k條件下，通過(guò)GROMACS進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，計(jì)算蛋白質(zhì)的RMSD、Rg和RMSF，分析T1脂肪酶整體結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)，從而確定與T1脂肪酶功能密切相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域。對(duì)關(guān)鍵區(qū)域的氨基酸進(jìn)行虛擬飽和突變，通過(guò)FoldX計(jì)算自由能變化小于0的突變體，構(gòu)建初始突變體庫(kù)，運(yùn)用穩(wěn)定性預(yù)測(cè)軟件I-mutant 2.0、STRUM、DynaMut對(duì)初始突變體庫(kù)進(jìn)行再預(yù)測(cè)，選擇3個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為最終研究對(duì)象。

1.2.2 T1脂肪酶突變體構(gòu)建 將目的基因和pET28a質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物于16℃金屬浴過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB（含50 μg/mL的Kan）平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行PCR及核酸瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將顯示目的條帶的單菌落送樣進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)于測(cè)序驗(yàn)證成功的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。設(shè)計(jì)突變體引物（表1），通過(guò)PCR擴(kuò)增構(gòu)建目標(biāo)突變體，反應(yīng)體系及條件分別如表2和表3所示。用Dpn I酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂平板，挑取單菌落驗(yàn)證，將驗(yàn)證成功的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3），-20℃保存。

表2 突變體擴(kuò)增反應(yīng)體系

表3 突變體擴(kuò)增條件

1.2.3 T1脂肪酶突變體表達(dá)及純化 將突變體重組質(zhì)粒菌株E.coli BL21（DE3）接種到LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL的Kan）中，37℃振蕩培養(yǎng)6-8 h，得種子液，再轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3 h至OD600為0.6-0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG于16℃（200 r/min）振蕩培養(yǎng)16 h。收集菌體，用10 mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液重懸、破碎（450 W，5 s/5 s/，25 min），10 000 r/min高速離心1 h，收集上清。利用1 mL His Trap FF鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化并進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證，以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯為底物檢測(cè)酶活。

1.2.4 T1脂肪酶突變體最適溫度及溫度穩(wěn)定性 測(cè)定最適溫度時(shí)，以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯（pNPP）為底物，取100 μL純化酶液于40-80℃條件下分別測(cè)定酶活，分別將野生型及突變體最高酶活定義為100%，計(jì)算其余溫度下的相對(duì)酶活。測(cè)定溫度穩(wěn)定性時(shí)，取100 μL酶液于40-80℃條件下保溫2 h后，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定各溫度下的殘余酶活，將未保溫酶液在37℃條件下的酶活定義為100%。脂肪酶酶活單位定義：一定反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol 對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)脂肪酶水解酶活國(guó)際單位。

1.2.5 T1脂肪酶突變體最適pH及pH穩(wěn)定性 配制pH 4-12的緩沖液：50 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH 4-6）；50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7-8）；50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）；50 mmol/L glycine-NaOH緩沖液（pH 10-11）；50 mmol/L Na2HPO3/NaOH緩沖液（pH 12.0），將緩沖液與酶液以1∶1比例混勻［19］，以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯（pNPP）為底物檢測(cè)酶活。測(cè)定最適pH時(shí)，將酶液分別與pH 4.0-12.0緩沖液混勻，檢測(cè)酶活，分別將野生型及突變體的最高酶活定義為100%，并計(jì)算其余溫度下的相對(duì)酶活。測(cè)定pH穩(wěn)定性時(shí)，將酶液與pH 4.0-12.0緩沖液混勻，于37℃保溫1 h后，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定酶活，將野生型及突變體的最高酶活定義為100%，測(cè)定其余pH下的殘余酶活。

1.2.6 T1脂肪酶突變體的有機(jī)溶劑耐受性 將純化得到的酶液分別與不同log P值的有機(jī)溶劑：二甲基亞砜（-1.38）、乙腈（-0.4）、乙酸乙酯（1.8）、甲苯（2.5）、二甲苯（3.1）、正己烷（3.5）、異辛烷（4.4）、正十四烷（7.6）、正十六烷（8.8）以1∶3的體積比混合，在30℃條件下孵育30 min，并以200 r/min的速度振蕩混勻［16，20］，最后以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯為底物測(cè)定酶活，將未經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑處理的酶液酶活定義為100%，計(jì)算各有機(jī)溶劑處理后的相對(duì)酶活。

1.2.7 T1脂肪酶突變體的金屬離子耐受性 金屬離子是一種常見(jiàn)的添加劑，它對(duì)脂肪酶的反應(yīng)活性會(huì)產(chǎn)生明顯的影響［21-22］，配制Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+溶液，分別將各離子溶液添加到純化后的脂肪酶液中，使離子終濃度為1 mmol/L，在65℃條件下孵育30 min［16，23］，最后以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯為底物在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定脂肪酶酶活。將未經(jīng)過(guò)金屬離子處理的酶液酶活定義為100%，計(jì)算各金屬離子處理后的相對(duì)酶活［24］。

1.2.8 T1脂肪酶突變體的底物選擇性 以不同鏈長(zhǎng)的三?；视王ィ–12-C18）為底物測(cè)定野生型脂肪酶及突變體的底物偏好性，分別將野生型及突變體脂肪酶在不同鏈長(zhǎng)底物下的最高酶活定義為100%，計(jì)算其余鏈長(zhǎng)底物下的相對(duì)酶活［15］。

2 結(jié)果

2.1 突變體的虛擬篩選

通過(guò)不同壓力下的分子動(dòng)力學(xué)模擬及RMSD、RMSF和Rg分析發(fā)現(xiàn)組成T1脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)的α6螺旋為關(guān)鍵區(qū)域。該螺旋由15個(gè)氨基酸組成（176 FTDRFFDLQKAVLEA 190），為避免帶電氨基酸的突變?cè)斐傻鞍自宣}橋相互作用的損失，將螺旋上的5個(gè)帶電氨基酸Asp178、Arg179、Asp182、Lys185和 Glu189排除，對(duì)其余10個(gè)氨基酸進(jìn)行虛擬飽和突變并通過(guò)FoldX計(jì)算自由能變化小于0的突變體，得到36個(gè)突變體。運(yùn)用穩(wěn)定性預(yù)測(cè)軟件I-mutant 2.0、STRUM、DynaMut對(duì)36個(gè)突變體進(jìn)行再預(yù)測(cè)，選擇3個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，最終得到該研究的3個(gè)突變體L188M、A190L和A190Y。

2.2 T1脂肪酶突變體的表達(dá)及純化鑒定

T1脂肪酶及其突變體純化酶液的SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示，圖1-A為野生型T1脂肪酶純化結(jié)果，圖1-B為突變體純化結(jié)果，由圖可知蛋白純化后在43 kD處出現(xiàn)一個(gè)明顯的蛋白條帶，與目的蛋白大小相符，證明本實(shí)驗(yàn)通過(guò)純化得到了較純的目的蛋白，可用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。

以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯（pNPP）為底物表征酶活并計(jì)算蛋白收率（表4）。結(jié)果顯示野生型T1脂肪酶及突變體均表現(xiàn)出酶活，突變體酶活相比野生型提高為12%-22%，且復(fù)合突變體酶活較單點(diǎn)突變體略高，野生型及突變體的蛋白收率為43%-57%。

圖1 純化蛋白SDS-PAGE電泳驗(yàn)證結(jié)果圖

表4 突變體純化小結(jié)

2.3 T1脂肪酶突變體最適溫度及溫度穩(wěn)定性

最適溫度及溫度穩(wěn)定性結(jié)果分別如圖2和圖3所示，圖2顯示野生型T1和3個(gè)單點(diǎn)突變體的最適溫度為65℃，而復(fù)合突變體L188M/A190L和L188M/A190Y的最適溫度為70℃。圖3顯示單點(diǎn)突變體及復(fù)合突變體的溫度穩(wěn)定性相比野生型均提高，并且復(fù)合突變體相比單點(diǎn)突變體提高幅度更明顯，60℃時(shí)，野生型殘余酶活為56%，L188M/A190L殘余酶活為80%，相比野生型，復(fù)合突變體溫度穩(wěn)定性提高43%。L188M/A190Y的溫度穩(wěn)定性在70℃時(shí)提高顯著，殘余酶活為70%，而野生型殘余酶活為48%，相比野生型，復(fù)合突變體溫度穩(wěn)定性提高了46%。

2.4 T1脂肪酶突變體的最適pH及pH穩(wěn)定性

最適pH及pH穩(wěn)定性結(jié)果分別如圖4和圖5所示，結(jié)果顯示野生型T1及突變體的最適pH均為9.0，而突變體的pH穩(wěn)定性相比野生型呈現(xiàn)不同程度的提高，單點(diǎn)突變體A190L比L188M和A190Y的pH穩(wěn)定性略佳，在pH4-6的穩(wěn)定性提高較明顯，其中pH為6時(shí)提升效果更顯著，A190L殘余酶活為59%，野生型為41%，相比野生型，A190L的pH穩(wěn)定性提高44%。而復(fù)合突變體整體pH穩(wěn)定性高于單點(diǎn)突變體，其中L188M/A190L穩(wěn)定性幅度提高更明顯，對(duì)于pH 12的穩(wěn)定性約為野生型的2倍。

圖2 野生型T1脂肪酶及突變體最適溫度

圖3 野生型T1脂肪酶及突變體溫度穩(wěn)定性

2.5 T1脂肪酶突變體的有機(jī)溶劑耐受性

圖6反映了突變體對(duì)不同logP值有機(jī)溶劑的耐受性，結(jié)果顯示乙酸乙酯對(duì)野生型T1及突變體均有較強(qiáng)的抑制作用，酶活顯著降低。對(duì)于野生型及單點(diǎn)突變體而言，有機(jī)溶劑的作用效果基本相同，但是單點(diǎn)突變體的耐受性略高于野生型。復(fù)合突變體的耐受性相比野生型及單點(diǎn)突變體顯著增強(qiáng)，尤其是對(duì)二甲基亞砜及正十六烷的耐受性提高最為明顯，野生型脂肪酶經(jīng)兩種溶劑處理后的殘余酶活分別為45%和33%，L188M/A190L的殘余酶活分別為85%和95%，L188M/A190Y的殘余酶活為88%和85%，相比野生型，L188M/A190L對(duì)兩種溶劑的耐受性分別為野生型的1.88倍和2.73倍，L188M/A190Y的耐受性為野生型的1.96倍和2.58倍。

圖4 野生型T1脂肪酶及突變體最適pH

圖5 野生型T1脂肪酶及突變體pH穩(wěn)定性

圖6 野生型T1脂肪酶及突變體有機(jī)溶劑耐受性

2.6 T1脂肪酶突變體的金屬離子耐受性

如圖7所示，經(jīng)不同金屬離子處理后，野生型T1及突變體在Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Mn2+存在條件下依然能保持較高酶活，而Fe3+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活具有明顯的抑制作用。突變體對(duì)于各種金屬離子的耐受性相比野生型有不同程度的提高，復(fù)合突變效果更加顯著，經(jīng)Fe3+和Cu2+處理后，野生型殘余酶活為30%和35%，L188M/A190L殘余酶活為55%和62%，相比野生型脂肪酶，L188M/A190L對(duì)于Fe3+和Cu2+的耐受性分別提高50%和77%，且對(duì)Zn2+的耐受性為野生型的2倍。L188M/A190Y對(duì)Fe3+耐受性顯著增強(qiáng)，處理后殘余酶活為65%，對(duì)Fe3+的耐受性為野生型的2.17倍。

圖7 野生型T1脂肪酶及突變體金屬離子耐受性

2.7 T1脂肪酶突變體的底物選擇性

野生型T1及突變體對(duì)不同鏈長(zhǎng)底物的選擇性如圖8所示，結(jié)果表明底物鏈長(zhǎng)為C12時(shí)，脂肪酶的反應(yīng)活性最佳，偏好性次之的底物鏈長(zhǎng)為C10，而底物鏈長(zhǎng)為C14-C18時(shí)，反應(yīng)活性較低。整體而言，突變體較野生型T1對(duì)不同底物的反應(yīng)活性提高，復(fù)合突變體比單點(diǎn)突變體反應(yīng)活性提高趨勢(shì)更加顯著，對(duì)于長(zhǎng)鏈底物（C16-C18）的活性增強(qiáng)尤其明顯，底物鏈長(zhǎng)為C16和C18時(shí)，L188M/A190L反應(yīng)活性分別為野生型的1.65倍和2.7倍，L188M/A190Y為野生型的1.5倍和2.25倍。

3 討論

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出單點(diǎn)突變體L188M、A190L和A190Y的溫度、pH穩(wěn)定性以及有機(jī)溶劑耐受性、金屬離子耐受性相比野生型均有不同程度的提高，表明突變體較野生型更加穩(wěn)定，抗外界脅迫的作用力增強(qiáng)。推測(cè)L188M將Leu突變成側(cè)鏈更大的Met，一方面增加了空間位阻，有利于酶穩(wěn)定性的增強(qiáng)；另一方面，引入的Met可能增強(qiáng)了穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力，如氫鍵等，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性與氫鍵的數(shù)量成正比。疏水相互作用是指在水介質(zhì)中，疏水性側(cè)鏈或者基團(tuán)為了避開(kāi)水的需要而被迫接近的傾向，疏水作用主要影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵，是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素［25-27］。A190L將Ala突變成疏水性較強(qiáng)的Leu，可能增加了α螺旋內(nèi)部疏水側(cè)鏈之間的相互作用，使α螺旋更加穩(wěn)定，從而使蛋白整體剛性增加，穩(wěn)定性增強(qiáng)。A190Y將Ala突變成Tyr后，疏水性減弱，但是抗外界因子脅迫能力增強(qiáng)，表明穩(wěn)定性也得到了改善，推測(cè)突變后引入的酪氨酸因含有芳香環(huán)增強(qiáng)了與周圍氨基酸，如Phe、Tyr、Trp之間的芳香環(huán)作用，即π-π堆積，該作用力會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響［28］。另外將Ala突變成側(cè)鏈基團(tuán)更大的Tyr，會(huì)增加空間位阻，也有利于蛋白穩(wěn)定性的增強(qiáng)。突變體酶活及對(duì)不同鏈長(zhǎng)底物的反應(yīng)活性比野生型高，表明突變體除了整體穩(wěn)定性提高外，催化性能也得到了改善，突變后酶的活性位點(diǎn)更容易打開(kāi)，酶與底物結(jié)合更容易。脂肪酶活性中心的催化三聯(lián)體一般位于疏水性裂縫中，活性位點(diǎn)打開(kāi)主要依靠催化口袋周圍疏水氨基酸的疏水作用力，推測(cè)突變后蛋白蓋子結(jié)構(gòu)疏水作用力增強(qiáng)，蓋子作為活性位點(diǎn)的保護(hù)結(jié)構(gòu)在強(qiáng)疏水力的環(huán)境下更易打開(kāi)，活性中心暴露，底物更容易進(jìn)入疏水通道與活性部位相結(jié)合發(fā)生催化反應(yīng)［29-30］。

圖8 野生型T1脂肪酶及突變體底物選擇性

復(fù)合突變體L188M/A190L和L188M/A190Y較單點(diǎn)突變體而言，酶學(xué)性能改善效果更顯著，可能由于兩個(gè)突變位點(diǎn)之間產(chǎn)生了協(xié)同作用，另外由于兩個(gè)位點(diǎn)相隔很近，同時(shí)突變后酶學(xué)性能達(dá)到疊加改善效果的可能性很高［31-32］。突變位點(diǎn)L188和A190都位于T1脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)的C端，進(jìn)行組合突變后，由于C端氨基酸疏水等作用力增強(qiáng)，會(huì)使蓋子結(jié)構(gòu)C端與N端作用力發(fā)生變化，而兩者之間的相互作用對(duì)蛋白穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生巨大的影響［33］，因此推測(cè)蓋子結(jié)構(gòu)兩端作用力的增強(qiáng)也是導(dǎo)致復(fù)合突變體酶學(xué)性質(zhì)改善的重要原因。

4 結(jié)論

本研究對(duì)T1脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)進(jìn)行定點(diǎn)突變，對(duì)3個(gè)單點(diǎn)突變體L188M、A190L、A190Y和兩個(gè)復(fù)合突變體L188M/A190L、L188M/A190Y進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征，結(jié)果顯示突變體較野生型T1脂肪酶的酶學(xué)性能均呈現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)，且復(fù)合突變體酶學(xué)性能改善更明顯，溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑、金屬離子耐受性、底物選擇性等酶學(xué)性質(zhì)均得到綜合性提高，組合突變比單點(diǎn)突變效果更突出。從而獲得了酶學(xué)性能改善更為全面的T1脂肪酶突變體，使該酶抗外界環(huán)境因子脅迫的能力得到一定程度增強(qiáng)，對(duì)于擴(kuò)大T1脂肪酶的應(yīng)用價(jià)值具有重要意義，拓寬了T1脂肪酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。