海鞘附著相關(guān)微生物膜中細(xì)菌原核群落結(jié)構(gòu)解析

劉倩倩 史宏偉 郭長(zhǎng)祿 張治洲

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，威海 264209；2.山東省海洋船舶防污工程技術(shù)研究中心，威海 264209）

海鞘屬于重要的海洋污損生物［1］。在全球范圍內(nèi)很多海域，海鞘可以占據(jù)污損生物總量的30%-70%。但是與藤壺、貽貝及管蟲(chóng)相比，針對(duì)海鞘的防污研究要少得多。通常情況下在清除船艦表面的藤壺和管蟲(chóng)時(shí)，不損傷船艦涂層幾乎是不可能的；而海鞘可以很容易使用高壓水槍清洗干凈，且?guī)缀鯇?duì)船艦表面涂層沒(méi)有明顯的損傷。這也是針對(duì)海鞘的防污技術(shù)研究較少的原因之一。可是海鞘在污損生物量中的占比經(jīng)常非常大，給船艦航行增加的能耗不容小覷，且清除它們?nèi)匀灰馁M(fèi)大量的人力物力。所以海鞘的附著生長(zhǎng)控制技術(shù)在防污領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)該加大研究力度。

在眾多不同的海洋防污技術(shù)研究領(lǐng)域，海洋微生物膜與污損生物幼蟲(chóng)附著過(guò)程之間的關(guān)系研究一直很受重視［2-4］。這里涉及幾個(gè)重要的問(wèn)題，一是不同的污損生物幼蟲(chóng)擁有不同的附著器官［5-7］，這些附著器官各自的附著機(jī)理需要很長(zhǎng)時(shí)間才能研究清楚；二是海洋微生物種類(lèi)繁多，在不同的附著表面形成具有不同組成結(jié)構(gòu)和表面形貌的生物膜，且大部分海洋微生物目前都是不可培養(yǎng)的；生物膜內(nèi)成百上千的細(xì)菌、真核微生物和其他微小生物存在著復(fù)雜的相互作用［8-9］。所以污損生物幼蟲(chóng)與海洋生物膜的相互作用機(jī)理也需要很多年才能逐一得到闡明。但是有一點(diǎn)理論上基本可以肯定，不同的污損生物幼蟲(chóng)會(huì)與海洋生物膜上特定的位置更容易產(chǎn)生互動(dòng)。

海洋微生物膜與海鞘幼蟲(chóng)附著過(guò)程之間的關(guān)系研究已經(jīng)積累了少量文獻(xiàn)［10-15］，它們都是直接的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察結(jié)果。Wieczorek等［12］發(fā)現(xiàn)海水自然形成的生物膜對(duì)苔蟲(chóng)幼蟲(chóng)和海鞘幼蟲(chóng)的附著有截然不同的作用，1-12 d內(nèi)形成的海水生物膜對(duì)苔蟲(chóng)附著有抑制作用，但對(duì)海鞘起促進(jìn)作用，且越老的生物膜效果越好。張朝霞等［14］從幾種海鞘的被囊表面及其附著基附近分離到9株細(xì)菌制備成細(xì)菌黏膜，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌黏膜對(duì)冠瘤海鞘幼體的附著和變態(tài)所起的作用差別很大，甚至發(fā)現(xiàn)一種弧菌可以明顯地促進(jìn)附著卻強(qiáng)烈抑制海鞘幼體變態(tài)。Zardus等［15］測(cè)試了不同天數(shù)形成的天然海水生物膜對(duì)次口海鞘、華美盤(pán)管蟲(chóng)、紋藤壺和總合草苔蟲(chóng)幼蟲(chóng)的附著強(qiáng)度；與光滑玻璃對(duì)照相比發(fā)現(xiàn)，生物膜的存在可以讓海鞘幼蟲(chóng)的附著強(qiáng)度增加近一半。上述研究表明生物膜與海鞘幼蟲(chóng)的附著關(guān)系密切，但是具體與生物膜中哪些微生物關(guān)系密切需要更多的觀(guān)察和研究。

本研究通過(guò)在兩類(lèi)不同的商用底漆中，分別添加4種防污性能不同的納米材料，制備了8種不同的涂層。實(shí)海測(cè)試發(fā)現(xiàn)它們的綜合防污打分比較接近［16］，但是在本研究中發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)涂層上的海鞘附著程度差異十分明顯。使用16S rRNA基因全長(zhǎng)高通量測(cè)序分析兩類(lèi)涂層表面早期生物膜原核菌群的組成差異，試圖初步從中找到與海鞘附著潛在密切相關(guān)的若干菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

使用3種碳納米管（Carbon nanotubes，CNTs，TimesNano）和一種納米鉑（Sigma）（添加量均為0.1%，W/V，表1）與兩種不同的常見(jiàn)商用底漆涂料制備復(fù)合涂層。底漆涂料選擇環(huán)氧鐵紅防銹漆（鐵紅）和丙烯酸樹(shù)脂成膜物（丙烯酸），均購(gòu)自威海欽灝涂料有限公司。兩種底漆涂料分別與碳納米管充分混勻制備復(fù)合防污涂層，涂在鋼板一面；室溫固化72 h后涂制另外一面，在72 h后徹底風(fēng)干固化后進(jìn)行海洋實(shí)地掛板。實(shí)驗(yàn)所用鋼板選擇Q235材質(zhì)的常見(jiàn)船體鋼板，尺寸大小為500 mm×500 mm×3 mm，鋼板上部左右邊緣處各開(kāi)一個(gè)直徑15 mm的圓孔，用以固定粗尼龍繩。先利用拋光機(jī)打磨平整光亮，使用去離子水沖洗鋼板表面，再用無(wú)水乙醇擦拭3次去除表面油污，自然風(fēng)干后用鉛筆劃線(xiàn)均分為25塊10 cm×10 cm小格（圖1）。

表1 納米材料信息

圖1 涂層設(shè)計(jì)示意圖

1.2 方法

1.2.1 涂層的表征 采用掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM，Zeiss MERLIN compact）對(duì)涂層進(jìn)行表面形貌表征分析。以硅片為載體制作出對(duì)應(yīng)納米復(fù)合涂層，完全固化后做噴金處理并立刻進(jìn)行表征。利用接觸角測(cè)量?jī)x（JGW-360B，承德市成惠試驗(yàn)機(jī)有限公司）測(cè)試上述涂層在室溫條件下的靜態(tài)接觸角和表面潤(rùn)濕性能，在涂層表面隨機(jī)取3個(gè)不同的位置測(cè)量并取平均值，測(cè)試液體使用的是純水和0.22 μm過(guò)濾海水。

1.2.2 實(shí)地海洋浸沒(méi)實(shí)驗(yàn)、生物膜樣本采集、宏基因組提取 實(shí)海測(cè)試位置位于山東省威海市西港小石島海域（N37°31'51″，E121°58'19″）的觀(guān)景和科研觀(guān)測(cè)兩用平臺(tái)。海水深度在10-12 m，掛板深度為2.5 m。觀(guān)察取樣時(shí)間為2019年夏季，掛板周期為28 d，分別在7 d、14 d、21 d、28 d對(duì)鋼板各復(fù)合涂層表面生物膜取樣，觀(guān)察期間海鞘屬于生物量最大的污損生物。每次取樣時(shí)測(cè)量海水溫度、pH值、鹽度3種環(huán)境因子，5次取樣的平均海水溫度在18.7℃左右，pH值約為7.79，鹽度為32±0.7%。鋼板的A面涂覆鐵紅基質(zhì)的涂層，包括鐵紅底漆分別添加4種納米材料制備的復(fù)合涂層及鐵紅底漆陰性對(duì)照；B面涂覆丙烯酸基質(zhì)的涂層，包括丙烯酸底漆分別添加4種納米材料制備的復(fù)合涂層及丙烯酸底漆陰性對(duì)照；每種納米材料從上至下設(shè)置4個(gè)重復(fù)，以消除浸沒(méi)深度對(duì)菌群分布的影響。最下面一層涂覆陰性對(duì)照，不取樣（圖1）。圖中“鐵紅”表示鐵紅陰性涂層，“丙”表示M133丙烯酸樹(shù)脂成膜物陰性涂層。生物膜取樣和后續(xù)處理參照文獻(xiàn)［16-17］進(jìn)行，每次共采集40個(gè)涂塊的生物膜樣本。采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（B518251，上海生工）獲取生物膜宏基因組DNA。

1.2.3 16S rRNA基因全長(zhǎng)高通量測(cè)序 將第28天提取的40個(gè)宏基因組樣本按照每4個(gè)相同涂塊等量混合成一個(gè)DNA樣本的方式得到10個(gè)生物膜DNA。鐵紅涂層的海鞘（主要是玻璃海鞘）附著量明顯多于丙烯酸涂層，后者在實(shí)驗(yàn)期間幾乎未見(jiàn)明顯的海鞘附著和生長(zhǎng)，而其他污損生物在兩類(lèi)涂層上的附著程度差異遠(yuǎn)小于海鞘，第28天的觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)表2。所以本次掛板結(jié)果適合比較兩類(lèi)涂層上與海鞘附著可能密切相關(guān)的生物膜菌群結(jié)構(gòu)差異。為此，將表2中的10個(gè)宏基因組樣本作如下處理：鐵紅陰性對(duì)照記為S3，4個(gè)鐵紅納米涂層宏基因組進(jìn)一步等量混合成S4，丙烯酸陰性對(duì)照記為S7，4個(gè)丙烯酸納米涂層宏基因組進(jìn)一步等量混合成S8。

表2 第28天觀(guān)察結(jié)果

1.2.4 qPCR驗(yàn)證Neptuniibacter菌含量課題組近期依據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果為涂層中含量較高的Neptuniibacter屬成功設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，上游引物：5'-CGC GTA GGT GGA TTG GSC-3'，下游引物：5'-CCG TCA ATT CAT TTG AGT TTT AAC CTT-3'。利用實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)（ABI Stepone system）定量測(cè)定不同取樣點(diǎn)、不同涂層表面生物膜樣本中Neptuniibacter的相對(duì)含量，即測(cè)定樣本中Neptuniibacter屬16S rDNA總的拷貝數(shù)。通過(guò)獲取更全面的各涂層定量信息，以達(dá)到進(jìn)一步考察Neptuniibacter與海鞘的潛在作用規(guī)律的目的。qPCR定量測(cè)試的樣本為4次取樣的10個(gè)涂層總計(jì)40個(gè)生物膜宏基因組樣本，使用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連續(xù)稀釋10倍獲得10-1-10-5共5個(gè)濃度梯度作為定量標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本及待測(cè)樣本均重復(fù)3次［18］。PCR擴(kuò)增體系為NPK62 2×buffer 6 μL，上下游引物各1.5 μL，Taq酶0.25 μL，基因組模板4.25 μL。擴(kuò)增條件為94℃，4 min，（94℃，30 s；57℃，40 s；72℃，40 s）×42 個(gè)循環(huán)，72℃，2min。

2 結(jié)果

2.1 多樣性指數(shù)分析（Alpha-diversity）

表3數(shù)據(jù)顯示各組Coverage值均在0.96以上，可以較好地反映樣本生物膜中微生物的真實(shí)情況。環(huán)氧鐵紅組的alpha多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）低于丙烯酸樹(shù)脂組；環(huán)氧鐵紅陰性組的多樣性較添加CNTs組稍大，丙烯酸組與之相反。環(huán)氧鐵紅陰性組的observed_otus最高，添加CNTs后OTU數(shù)明顯減少，但在丙烯酸樹(shù)脂組添加CNTs前后差異卻非常小，暗示了納米材料對(duì)鐵紅涂層性質(zhì)影響較大，而對(duì)丙烯酸涂層影響較小。

表3 原核菌落多樣性參數(shù)

2.2 物種分類(lèi)與豐度分析

16S測(cè)序結(jié)果表明，全部樣品中包含的OTU個(gè)數(shù)為778，涵蓋了26個(gè)門(mén)，40個(gè)綱，80個(gè)目，144個(gè)科，284個(gè)屬，350個(gè)種的菌類(lèi)。圖2為4組生物膜樣本細(xì)菌在屬層面上的相對(duì)豐度比較，排名前9位的均隸屬于Proteobacteria（變形菌門(mén)）。其中，Cycloclasticus（解環(huán)菌屬）豐度最高，在兩種底漆基質(zhì)豐度占約為19%-22%。其次是Rhodovulum（小紅卵菌屬），該屬在環(huán)氧鐵紅底漆中豐度（16.6%-17%）遠(yuǎn)高于丙烯酸底漆（2%-3%），含有CNTs的生物膜組豐度略高于陰性對(duì)照組。Neptuniibacter屬隸屬于Oceanospirillaceae（海洋螺桿菌科）在環(huán)氧鐵紅底漆中相對(duì)豐度達(dá)到11.6%左右，然而在丙烯酸底漆中該菌屬含量幾乎為零；而海洋螺桿菌科的另一屬Neptunomonas的豐度狀況與Neptuniibacter恰好相反，在環(huán)氧鐵紅底漆中豐度極低，僅占1%左右。Sulfitobacter（亞硫酸桿菌）的豐度低于前幾種菌，丙烯酸底漆中豐度（6.3%）略高于鐵紅底漆（1.1%）。

圖2 屬分類(lèi)水平的豐度比較

圖3為4組生物膜樣本細(xì)菌在種層面的豐度比較，除了占20%左右的未知菌種外，豐度排名最前的兩名依然是Cycloclasticus pugeti和Rhodovulum sp.KU27F。Cycloclasticus pugeti在各組生物膜中差異量不大；Rhodovulum sp.KU27F3在鐵紅底漆中豐度很高（約為18%），在丙烯酸底漆中豐度很小（僅為2%-3%），為鐵紅組的1/7左右。Neptuniibacter sp._CAR-SF在丙烯酸組中的豐度近乎為零（0-0.03%），而鐵紅組豐度在3%-5%之間，形成了極大的差異。Cellvibrionales unclassified菌也有類(lèi)似情況，在鐵紅涂層（占比3%-5%）中含量遠(yuǎn)高于丙烯酸涂層（0%）。Neptuniibacter_sp._CAR-SF和Cellvibrionales unclassified菌的含量在鐵紅涂層中含量均在4%左右，而在丙烯酸涂層中幾乎為零，對(duì)應(yīng)的OTU序列讀數(shù)在兩類(lèi)涂層中相差100倍以上。由于該兩種菌在兩種基質(zhì)中含量構(gòu)成的明顯差異，后續(xù)便使用qPCR定量實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步驗(yàn)證這一差異。

圖3 種分類(lèi)水平的豐度比較

圖4-A為qPCR樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線(xiàn)，各樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)單一的融解峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好，定量結(jié)果可信。由圖4-B可以看出，丙烯酸涂層中Neptuniibacter屬的含量比鐵紅涂層要低幾倍到幾十倍，這與高通量測(cè)序的結(jié)果一致。另外，qPCR數(shù)據(jù)顯示，Neptuniibacter在鐵紅涂層較之于丙烯酸涂層中的含量?jī)?yōu)勢(shì)從第7-14-21-28天是逐漸增大的，但是鐵紅/DPt涂層的上述優(yōu)勢(shì)一開(kāi)始就很大，而該涂層表面海鞘的平均附著程度也是所有涂層中最大的（表2）。暗示Neptuniibacter屬的存在對(duì)海鞘的附著可能是因而不是果。

圖4 qPCR溶解曲線(xiàn)（A）涂層生物膜樣本中Neptuniibacter屬的qPCR測(cè)定結(jié)果（B）

2.3 PCA分析

PCA（Principal component analysis）分析即主成分分析，是一種對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)化分析的技術(shù)，這種方法可以有效的找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，可以用來(lái)對(duì)含有多參數(shù)變量的一組復(fù)雜樣本進(jìn)行聚類(lèi)分析。如圖5所示，S3與S4之間的差距大于S7與S8之間的差距，說(shuō)明丙烯酸涂層添加納米材料前后的菌群結(jié)構(gòu)變化相對(duì)較小，而鐵紅基質(zhì)在添加納米材料前后其菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的變化。另外，圖5橫坐標(biāo)反映了92.7%的差異，而縱坐標(biāo)只反映了6.09%的差異，說(shuō)明兩種基質(zhì)帶來(lái)的菌群結(jié)構(gòu)差異遠(yuǎn)大于納米材料在兩種基質(zhì)中帶來(lái)的菌群結(jié)構(gòu)差異。

2.4 表征結(jié)果

圖6為放大1 000倍后，兩種陰性涂層及其對(duì)應(yīng)的共8種納米涂層的SEM圖片?？擅黠@觀(guān)察到兩種底漆的表面形貌有很大的差別，本研究所用的環(huán)氧鐵紅基質(zhì)的5個(gè)涂層（a-e）均比較粗糙，丙烯酸基質(zhì)的5個(gè)涂層（f-j）除表面除少量突起外，觀(guān)察窗口下表面較為光滑平整。鐵紅涂層表面與自身對(duì)照相比并沒(méi)有觀(guān)察到納米材料在表面形成任何規(guī)律性的形貌，說(shuō)明盡管大部分納米材料被埋藏于表面以下，但是仍然對(duì)涂層表面性質(zhì)產(chǎn)生了一定的影響，繼而改變了生物膜中菌群的多樣性特征；丙烯酸涂層與自身對(duì)照相比表面出現(xiàn)了較大的顆粒，可能暗示這些納米材料在基質(zhì)中的聚集現(xiàn)象。

圖5 復(fù)雜菌群組成差異的PCA分析

表4為10個(gè)涂層的靜態(tài)接觸角測(cè)試結(jié)果。每種基質(zhì)在添加納米材料前后表面接觸角數(shù)值非常接近。無(wú)論浸潤(rùn)液體為純水還是海水中，兩種涂層均表現(xiàn)出親水性（接觸角＜90°），在海水環(huán)境中，丙烯酸基質(zhì)涂層疏水性略大于鐵紅基質(zhì)涂層，兩種涂層的浸潤(rùn)性能差別不大。

3 討論

本研究以鐵紅防銹漆和丙烯酸樹(shù)脂成膜物為基質(zhì)，混合4種CNTs制備了兩類(lèi)涂層。經(jīng)過(guò)實(shí)地海洋掛板，發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)涂層上海鞘的附著程度有很大差異。采集了涂層表面生物膜并提取宏基因組DNA進(jìn)行16S rRNA全長(zhǎng)高通量測(cè)序，分析了原核微生物在兩類(lèi)不同基質(zhì)中的菌落組成、多樣性分析及物種豐度，以及添加納米材料對(duì)涂層表面菌群結(jié)構(gòu)的影響。

全長(zhǎng)測(cè)序表明涂層表面的原核菌群以變形菌門(mén)為主，在兩種基質(zhì)占比達(dá)80%以上，這與非全長(zhǎng)測(cè)序結(jié)果一致［19］。屬層面豐度最高的Cycloclasticus菌是一種嗜油類(lèi)微生物，在我國(guó)海域分布較廣。Rhodovulum、Neptuniibacter兩種菌在不同基質(zhì)中形成了十分明顯的差異，鐵紅基質(zhì)有大量的分布，而丙烯酸基質(zhì)分布極少，尤其是Neptuniibacter菌豐度近乎為零。文獻(xiàn)表明前一種菌的部分菌株能適應(yīng)較寬的CO2濃度范圍，在海岸線(xiàn)、內(nèi)陸環(huán)境中高效同化CO2，對(duì)緩解全球變暖具有重要意義［20］。Neptunomonas與Neptuniibacter同屬一科，豐度分布規(guī)律則恰恰相反，同一種常見(jiàn)的海水養(yǎng)殖中后期優(yōu)勢(shì)菌（Sulfitobacter）［21］在丙烯酸涂層中大量分布，而在鐵紅基質(zhì)中僅占比1%左右。全長(zhǎng)測(cè)序能在種層面提供較為全面的信息，本研究初步發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)菌株Neptuniibacter sp.CAR-SF和Cellvibrionales unclassified與海鞘存在積極的作用關(guān)系，但目前還沒(méi)有任何與海鞘幼蟲(chóng)附著相關(guān)的生物學(xué)報(bào)道。其中海洋細(xì)菌Neptuniibacter sp.CAR-SF被發(fā)現(xiàn)可以降解咔唑［22-23］，而Cellvibrionales unclassified尚未完成基本的命名，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步確認(rèn)并加強(qiáng)功能研究。

圖6 涂層的SEM表征結(jié)果

關(guān)于納米材料對(duì)生物膜菌群組成的影響，所觀(guān)察到的結(jié)果比較出人意料。在兩類(lèi)基質(zhì)的涂層中，幾種納米材料對(duì)生物膜菌群的組成影響較小。通過(guò)SEM表征發(fā)現(xiàn)100 μm的觀(guān)察窗口下鐵紅涂層表面比較粗糙，且表面局部形貌的形狀不規(guī)則，而丙烯酸樹(shù)脂成膜物涂層表面相對(duì)光滑，有少量細(xì)小顆粒狀突起。本研究所用的納米材料除納米鉑以外長(zhǎng)度都在10 μm以上，添加納米材料之后表面的無(wú)規(guī)則凸起數(shù)量也有增多，但在2-10 μm的觀(guān)察窗口下并不明顯，納米材料對(duì)表面結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生大的影響。肉眼對(duì)涂層進(jìn)行觀(guān)察時(shí)發(fā)現(xiàn)添加了CNTs的涂層顏色偏暗，丙烯酸的透明基質(zhì)中能發(fā)現(xiàn)分布較為均勻的黑色小顆粒，或?yàn)椴糠諧NTs聚集所致，這一現(xiàn)象可以更有力的說(shuō)明納米材料不是浮于表面而發(fā)揮防污作用，而是懸浮或沉積于底部，但仍然在一定程度上改變了涂層的表面性質(zhì)［16，24-25］。這一點(diǎn)需要后續(xù)研究中設(shè)法消除納米材料的聚集并實(shí)施更細(xì)致的形貌分析（如原子力顯微鏡）和理化參數(shù)分析。

表4 全部涂層的靜態(tài)接觸角

基于丙烯酸酯及其衍生物作為基質(zhì)的涂層具有優(yōu)越的防污性能［26］，若想研制出具備更高環(huán)保性質(zhì)的防污涂層則離不開(kāi)對(duì)污損生物幼蟲(chóng)附著機(jī)制的研究，且這類(lèi)機(jī)制的研究與涂層表面生物膜關(guān)系是密不可分的。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)丙烯酸基質(zhì)的原核菌群多樣性略高于鐵紅基質(zhì)，納米材料的添加對(duì)兩類(lèi)涂層上菌群結(jié)構(gòu)的改變程度都比較有限，但是兩類(lèi)涂層中個(gè)別菌種的含量差異非常巨大。差異最大的兩個(gè)種分別是Neptuniibacter sp.CAR-SF和Cellvibrionales unclassified，兩者在鐵紅涂層中含量均在4%左右，而在丙烯酸涂層中幾乎為零，對(duì)應(yīng)的OTU序列讀數(shù)在兩類(lèi)涂層中相差100倍以上，構(gòu)成的差異十分明顯。而qPCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Neptuniibacter屬在兩類(lèi)涂層中含量相差確實(shí)很大，暗示了該菌的存在對(duì)玻璃海鞘的附著可能具有誘導(dǎo)作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于該兩種菌與海鞘附著相互作用關(guān)系的文獻(xiàn)，上述研究結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)需要將來(lái)更細(xì)致的探索。