非洲豬瘟病毒K196R和A240L蛋白的可溶性表達(dá)及酶活力分析

李鵬昊 梁嚴(yán)予 王彥偉 關(guān)洋 逄文強(qiáng) 田克恭

（國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽 471003）

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever virus，ASFV）引起的一種高致死性傳染病，危害巨大，目前在我國已被列為一類動物疫病［1］。安全、有效疫苗的研制對于ASF的防控具有非常重要的意義，但ASFV基因組較大，約為170-190 kb，共編碼了150多個開放閱讀框［2］；不同ASFV毒株基因組之間存在有一定的差異，病毒自身也有著非常復(fù)雜的免疫逃避機(jī)制［3］，這些都為ASFV疫苗的研發(fā)帶來了較大的挑戰(zhàn)和困難。

ASFV主要感染宿主的單核巨噬細(xì)胞，可引起嚴(yán)重的組織壞死、出血，最終導(dǎo)致宿主死亡［4］。ASFV對宿主巨噬細(xì)胞的特異性吸附及內(nèi)化，主要依賴自身編碼的p54和p30等蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來實現(xiàn)［5］。而ASFV感染后在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，需在多個由其自身編碼的DNA復(fù)制相關(guān)蛋白酶的催化作用下完成，如A240L、B962L、EP1242L、NP1450L和E165R等［6］。其中，部分參與DNA復(fù)制的酶與ASFV的毒力密切相關(guān)。已有研究表明，ASFV缺失DP69R、DP71L、A240L、B119L和DP148R能夠針對親本毒株提供較好的攻毒保護(hù)［7］。在ASFV臨床診斷方面，參與其DNA復(fù)制的一些酶類如K196R通常在感染早期表達(dá)，多作為ASFV相關(guān)診斷試劑研究的靶蛋白［8］。因此，對ASFV相關(guān)蛋白酶進(jìn)行表達(dá)和功能研究，對其臨床診斷及免疫預(yù)防研究都具有十分重要的意義。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)可以快速實現(xiàn)異源蛋白的高效表達(dá)，然而也存在目的蛋白易形成包涵體等問題。研究表明，密碼子優(yōu)化［9］、載體表達(dá)元件優(yōu)化［10］及添加促溶標(biāo)簽［11］等，是提高目的蛋白可溶性的有效方法。目前，已有較多ASFV的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實現(xiàn)了可溶性表達(dá)；為了探究K196R和A240L蛋白的特性及其在ASFV感染宿主過程中的潛在功能作用，本研究通過添加促溶標(biāo)簽的方式，將其在大腸桿菌中進(jìn)行了可溶性表達(dá)，并對其反應(yīng)性及體外酶催化活力進(jìn)行了初步考察，旨在為ASFV相關(guān)診斷試劑的研究提供候選抗原蛋白，并為相關(guān)蛋白的功能研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；激酶通用酶活檢測試劑盒購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；pET28a、pET28a-SUMO和pET28a-MBP載體（SUMO和MBP標(biāo)簽C端帶有TEV酶切位點，N端帶有His標(biāo)簽）由本實驗室構(gòu)建保藏；引物及基因序列合成與測序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix（-dye） 高保真DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技公司；TEV酶由本實驗室制備保藏；ASF陽性參考血清購自歐洲非洲豬瘟參考實驗室（Centro de Investigación en Sanidad Animal（CISA-INIA），Madrid，Spain）；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)ASFV SY18株K196R和A240L密碼子優(yōu)化后的基因序列設(shè)計PCR引物，A240L-F（5'-3'）：CGCGGATCCATGCGTGGAATACTCATTGC（包含BamH I酶切位點），A240L-R（5'-3'）：CCCAAGCTTTTAAACGATGAAGTCGTATT（包 含HindIII酶切位點）；K196R-F（5'-3'）：CGCGGATCCATGAACATCATCCGTAAACT（包含BamHI酶切位點），K196R-R（5'-3'）：CCCAAGCTTTTAGTATTTGATCGGCTGCA（包含HindIII酶切位點）。以合成的目的基因序列為模板，擴(kuò)增出目的基因片段，PCR反應(yīng)程序為95℃變性20 s、56℃退火20 s、72℃延伸35 s，共35個循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后與表達(dá)載體一同用BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶37℃酶切1 h，并進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物由T4 DNA連接酶室溫連接1 h，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗證正確后，進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2 目的蛋白的表達(dá) 表達(dá)載體驗證正確后分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵考察。搖瓶發(fā)酵條件如下：種子液按1%接種量接種至LB液體培養(yǎng)基（添加終濃度為50 μg/mL的卡那霉素），37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)時長為12 h。收集菌體沉淀，使用緩沖液A（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH 7.0）按1∶20的體積比進(jìn)行重懸破碎，4℃、13 500 r/min離心10 min分離上清、沉淀（用原倍體積的上述緩沖液重懸），用于SDS-PAGE檢測。

1.2.3 目的蛋白的純化和鑒定 搖瓶發(fā)酵所得菌體破碎上清，經(jīng)0.45 μm過濾后用裝有Ni Sepharose 6 Fast Flow填料的Tricon柱進(jìn)行純化，利用咪唑進(jìn)行梯度洗雜、洗脫，所得產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測。蛋白洗脫樣品用PBS緩沖液透析后，添加1/50（V/V）的TEV酶室溫酶切處理1 h，經(jīng)過Ni親和層析進(jìn)行標(biāo)簽去除，收集流穿液用于SDS-PAGE檢測。蛋白純化后進(jìn)行Western blot鑒定，條件如下：電壓25 V，電流2.5 mA，轉(zhuǎn)膜時間7 min；以稀釋1 000倍的ASF陽性參考血清和陰性血清分別作為一抗，以稀釋2 000倍的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG作為二抗。1.2.4 體外酶活力測定 使用激酶通用酶活檢測試劑盒對目的蛋白的體外酶反應(yīng)活力進(jìn)行檢測。依次向96孔反應(yīng)板中加入20 μL的激酶反應(yīng)溶液（溶液I）、20 μL的ADP反應(yīng)緩沖液（溶液II）和10 μL的ADP反應(yīng)液（溶液III），共50 μL的反應(yīng)體系；室溫反應(yīng)30 min左右后，檢測其熒光強(qiáng)度（λex=540 nm/λem=590 nm），并根據(jù)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活；標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將ADP標(biāo)準(zhǔn)存儲液用激酶反應(yīng)緩沖液梯度稀釋至0.05、1、2、5、10、20和30 μmol/L，并作為激酶反應(yīng)溶液添加至反應(yīng)體系。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

以ASFV SY18株來源密碼子優(yōu)化后的K196R和A240L基因序列為模板，分別使用引物組K196RF/R和A240L-F/R對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小分別為600 bp和750 bp左右的基因片段（圖1）。使用BamH I和Hind III酶同時對目的片段pET28a、pET28a-SUMO和pET28a-MBP載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行測序驗證（測序結(jié)果未顯示）。

2.2 目的蛋白的表達(dá)

重組載體驗證正確后分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵考察。結(jié)果，K196R和A240L蛋白單獨表達(dá)時均大部分以包涵體形式存在于沉淀中，上清中無明顯表達(dá)（圖2）。通過表達(dá)條件篩選，K196R蛋白在添加SUMO標(biāo)簽條件下可實現(xiàn)較好的可溶性表達(dá)，蛋白大小為40 kD左右（圖2）；而A240L蛋白添加MBP標(biāo)簽表達(dá)上清中目的蛋白表達(dá)水平較高，蛋白大小為67 kD左右（圖2）。

圖1 K196R和A240L編碼基因的PCR擴(kuò)增

圖2 目的蛋白表達(dá)的SDS-PAGE檢測

2.3 目的蛋白的純化

表達(dá)的SUMO-K196R和MBP-A240L蛋白，利用親和層析進(jìn)行純化，SDS-PAGE結(jié)果（圖3）顯示，洗脫所得目的蛋白具有較高的純度。使用TEV酶對洗脫蛋白進(jìn)行酶切處理，酶切產(chǎn)物上樣后收取流穿，進(jìn)行SDS-PAGE檢測；結(jié)果酶切處理后融合標(biāo)簽與K196R和A240L蛋白能夠完全分離，標(biāo)簽去除后所得K196R和A240L蛋白純度較高，大小分別為22 kD和27 kD左右（圖3）。

圖3 目的蛋白純化與酶切的SDS-PAGE檢測

2.4 K196R和A240L蛋白的Western blot鑒定

K196R和A240L蛋白純化后進(jìn)行western blot鑒定，結(jié)果如圖4中所示。純化后的K196R蛋白可鑒定出大小為22 kD左右的特異性條帶，與SDS-PAGE結(jié)果一致；而純化后的A240L蛋白鑒定出的特異性條帶大小為27 kD左右，同樣與其SDS-PAGE結(jié)果一致；該結(jié)果表明，純化所得K196R和A240L蛋白，均能夠與ASF陽性血清產(chǎn)生較好的特異性反應(yīng)。

圖4 K196R和A240L蛋白的Western blot鑒定

2.5 體外酶活力檢測

純化所得K196R和A240L蛋白利用酶活檢測試劑盒進(jìn)行體外酶活力分析，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活力值，結(jié)果如圖5所示。其中，K196R蛋白酶體外酶活力為（36.4±2.9）U/mg，而A240L蛋白酶體外酶活力為（47.9±3.6）U/mg；該結(jié)果顯示與陰性對照組（Negative control）相比，純化后的K196R和A240L蛋白均具有一定的體外酶催化活性。

圖5 K196R和A240L蛋白酶活力檢測結(jié)果

3 討論

ASFV基因組大小為170-194 kb，主要由3部分組成：末端為37 nt部分堿基互補(bǔ)配對的發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)，由串聯(lián)重復(fù)序列和多基因家族（Multigene families，MGF）構(gòu)成的可變區(qū)以及中間部分的穩(wěn)定區(qū)，而可變區(qū)基因的變化是造成ASFV株間差異的主要因素［12］。A240L蛋白為ASFV早期感染后表達(dá)的一種胸苷酸激酶，屬于360多基因家族成員，具有較為保守的ATP及核苷酸結(jié)合功能域［13］；ASFV的基因組學(xué)分析表明，A240L蛋白可能參與病毒DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄相關(guān)的生物過程［14-15］。K196R蛋白是ASFV編碼的一種胸苷激酶（Thymidine Kinase，TK），該蛋白于ASFV感染早期表達(dá)，且能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，具有較好的免疫原性［16-17］。

關(guān)于K196R和A240L蛋白在ASFV復(fù)制及感染過程中的作用，已有相關(guān)研究對其進(jìn)行了闡述，然而目前尚無對這兩種蛋白進(jìn)行表達(dá)和鑒定的報道。本研究通過添加融合標(biāo)簽，實現(xiàn)了ASFV SY18株編碼的K196R和A240L蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)；Western blot結(jié)果顯示這兩種蛋白均能夠與ASF陽性參考血清發(fā)生較好的特異性反應(yīng)，說明ASFV感染宿主后產(chǎn)生了針對這兩種蛋白的特異性抗體，且所產(chǎn)生的抗體可以很好的識別利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的抗原蛋白。此外，本研究利用ASF臨床分離血清樣本對表達(dá)的蛋白進(jìn)行驗證，結(jié)果與ASF陽性參考血清無差異（數(shù)據(jù)未顯示），證明K196R和A240L蛋白可作為潛在的候選抗原蛋白用于ASFV相關(guān)診斷試劑的研究。

在疫苗研究方面，研究發(fā)現(xiàn)ASFV Malawi毒株缺失TK（K196R）后其毒力顯著降低，且能夠針對其親本毒株提供較好的攻毒保護(hù)［18］。因此，K196R蛋白能夠與ASFV陽性血清發(fā)生較好特異性反應(yīng)的結(jié)果，在一定程度上說明該蛋白存在用于鑒別疫苗免疫及野毒感染的潛在可能性。此外，基因IX型的Ken06.Bus毒株與基因X型的Ken05/Tk1株相比，其360多基因家族多個基因的保守區(qū)均發(fā)生了截短，包括8L、A240L、O174L、C84L和I267L等［19］；表明A240L蛋白在ASFV基因分型及流行病學(xué)研究方面同樣具有一定的應(yīng)用價值。

本研究還對K196R和A240L蛋白的特性進(jìn)行了初步探究，酶活檢測試驗結(jié)果表明這兩個蛋白均具有一定的體外酶催化活性。近來，以ASFV復(fù)制相關(guān)酶為靶點的靶向藥物研究為ASFV的防控提供了新的思路［20］。因此，與ASFV復(fù)制相關(guān)的K196R和A240L蛋白酶可能對其靶向藥物的研究開發(fā)也具有一定的價值。綜上所述，本研究通過與促溶標(biāo)簽融合表達(dá)的方式實現(xiàn)了K196R和A240L蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，并對其反應(yīng)性和活性進(jìn)行了初步考察，為ASFV的臨床診斷及蛋白的相關(guān)功能研究提供了一定的依據(jù)。

4 結(jié)論

ASFV K196R和A240L蛋白的編碼序列密碼子優(yōu)化后，通過添加促溶標(biāo)簽，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)；標(biāo)簽去除后K196R和A240L蛋白均可被ASF陽性血清特異性識別，且具有一定的體外酶催化活性。