水稻籽粒低鎘蛋白LCD互作蛋白的篩選與鑒定

郝小花 戴佳利 暨文勁 黃丹 李東屏 田連福

（1.湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院，常德 415000；2.湖南師范大學作物生命科學學院 作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室，長沙 410081）

由于工業(yè)化的發(fā)展和化肥的施用，耕地普遍存在鎘（Cd）污染問題。水稻屬于易吸收和積累Cd的作物，在Cd污染稻田中種植水稻會導致大米Cd超標的風險。全世界約有一半的人口以稻米為主食，長期食用Cd超標的大米，對人體健康產(chǎn)生不利影響。培育籽粒Cd低積累的水稻品種是防止大米Cd超標的有效辦法之一。

近年來，隨著分子生物學、測序技術和生物信息學技術的發(fā)展，有關植物在重金屬解毒和重金屬耐受方面的研究取得較大進展。植物進化出各種機制來維持必需金屬離子的生理濃度［1-3］，同時最大限度地減少植物體內(nèi)過多重金屬離子對植物細胞造成的損害，從而賦予植株對重金屬脅迫的耐受性。當植物暴露于達到毒害作用的重金屬濃度時，首先通過限制重金屬離子進入外質(zhì)體、將它們與細胞壁或細胞滲出物結合、降低根細胞對重金屬離子的吸收，或通過抑制長距離運輸把重金屬阻隔在地下組織中［4-6］。其次，已進入細胞的重金屬離子，可以通過一系列的存儲和解毒策略緩解，包括離子運輸、螯合或隔離到液泡中［7］。最后，植物還可以通過激活氧化應激防御機制和與應激相關的蛋白質(zhì)和信號分子等激活不同的防御或抵抗途徑來進行防御，如熱休克蛋白、激素和活性氧等［8-9］。水稻中已經(jīng)鑒定出一些與Cd轉運、解毒等相關的基因，包括OsNRAMP1［10］、OsNRAMP2［11］、OsNRAMP3［12］、OsNRAMP5［13］、OsNRAMP6［14］、OsHMA2［15］、OsHMA3［16］、OsHMA9［17］、OsIRT1［18］、OsIRT2［19］、OsZIP1［20］、LCD［21］、OsLCT1［22］、OsPCR1［23］、O s C C X 2［24］、O s A B C G 4 3［25］、O s C A L 1［26］、OsPCS1［27］、OsPCS2［28］、OsPCS15［29］、OsMTP1［30］等，它們在水稻中，參與Cd的解毒、吸收、運輸和分配。

水稻LCD是一個沒有同源基因的單基因。該基因突變導致水稻籽粒中Cd含量大幅降低［21］。lcd突變體在植物早期發(fā)育過程中，無論是在平板中還是在水培液中都表現(xiàn)出對Cd的耐受性。Cd含量測定表明，突變體植株的地上部分的Cd含量比野生型顯著降低。在Cd污染的土壤中進行田間培養(yǎng)，突變體葉片的Cd含量與野生型差異不顯著，但籽粒中Cd含量顯著降低。lcd突變體與野生型植株的生物量和種子產(chǎn)量無顯著差異。LCD定位于細胞質(zhì)和細胞核中，主要在根系的維管組織和葉片的韌皮部伴胞細胞中表達［31］，可能參與調(diào)控Cd的長距離運輸。敲除該基因可以限制Cd向地上部，尤其是籽粒的運輸，從而降低籽粒中Cd的含量。蛋白結構分析顯示，OsLCD蛋白沒有富含半胱氨酸，不具有重金屬解毒功能，同時也不包含跨膜結構域，沒有轉運功能，推測LCD蛋白可能通過與其他蛋白相互作用來調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)Cd的積累和運輸。

酵母雙雜交（Yeast two hybrid）是一種有效的篩選和鑒定蛋白相互作用的分子生物技術［31-33］，在解析蛋白作用的分子機制研究中有廣泛的應用。傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)僅限于核蛋白的互作分析，不能進行膜蛋白互作的研究。Stagljar等［34］發(fā)展了基于分裂泛素（Split-ubiquitin）的酵母雙雜交系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性。DUALmembrane系統(tǒng)是基于分裂泛素介導的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，可以進行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白間的互作研究。DUALmembrane膜體系酵母雙雜交文庫系統(tǒng)已應用在水稻條紋葉枯病毒的傳播機制的研究和擬南芥纖維素合成相關蛋白互作的研究中［35-36］。

水稻LCD影響籽粒Cd累積，但其作用的分子機制尚不清晰。本研究擬通過酵母雙雜交技術篩選和鑒定與LCD互作的蛋白（調(diào)控蛋白或轉運蛋白），為闡明LCD參與的Cd離子轉運、積累的分子機制奠定基礎，為挖掘遺傳新資源、培育低鎘水稻新品種提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種為粳稻日本晴（Oryza sativa ssp.japonica cv.Nipponbare）；引物、培養(yǎng)基、常規(guī)化學試劑等訂購于上海生工生物工程有限公司，RNA提取試劑Trizol、反轉錄酶、X-α-gal、AbA、高保真酶、限制性內(nèi)切酶等購自Invitrogen公司。

膜體系酵母雙雜交系統(tǒng)為Biotech公司DUALmembrane system，酵母菌株為NMY51，文庫載體為pPR3-N，誘餌載體為pBT3-N，陽性對照載體為pOst-Nub1。

核體系酵母雙雜交系統(tǒng)為Clontech公司Yeast Two-Hybrid System，酵母菌株為AH109，文庫載體為pADKT7，誘餌載體為pGBKT7，陽性對照載體為pGBKT7-53和pGADT7-T，陰性對照載體為pGBKT7-Lam。

以日本晴生長一周的根、地上部分，分蘗期的根、葉，開花期的根、葉、節(jié)、節(jié)間、花均量混勻為材料，分別構建DUALmembrane系統(tǒng)和Yeast Two-Hybrid系統(tǒng)cDNA文庫，文庫構建由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。

質(zhì)粒擴繁在大腸桿菌Top10中進行。

1.2 方法

1.2.1 水稻LCD誘餌載體的構建 根據(jù)水稻LCD序列設計特異性引物，以cDNA文庫為模板，擴增LCD編碼區(qū)序列，經(jīng)純化后，與T載體pMD18-T連接，轉化，并提取陽性菌落的質(zhì)粒。依據(jù)LCD的序列和誘餌載體（pBT3-N、pGBKT7）的多克隆位點，選擇合適的酶切位點設計構建誘餌載體的引物（表1）。對pMD18-T-LCD和誘餌載體進行酶切、純化，用T4連接酶連接過夜，轉化，篩選陽性克隆，提取陽性質(zhì)粒進行酶切、測序驗證獲得正確的誘餌載體。

表1 構建誘餌載體的引物序列

1.2.2 重組載體轉化酵母細胞 將酵母菌種（NMY51、AH109）在YPDA平板上劃線，30℃倒置培養(yǎng)3 d左右，挑取單克隆酵母于50 mLYPDA培養(yǎng)基中，30℃，230-250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；測定OD546=0.6-0.8；2 500 r/min離心5 min收集菌體；每個反應管加1.5 μg誘餌質(zhì)粒，300 μL PEG/LiOAc master Mix（50%PEG 2.4 mL、1 mol/L LiOAc 360 μL和Single-stranded carrier DNA 250 μL），輕輕渦旋混勻，100 μL重懸細胞，渦旋1 min至各組分充分混勻；42℃水浴孵育45 min；500×g 離心5 min，棄上清，用150 μL NaCl（0.9%）溶液重懸菌體；涂不同的營養(yǎng)缺陷平板，30℃倒置培養(yǎng)3-5 d。

1.2.3 文庫載體插入片段的擴增和測序 應用文庫載體的通用引物（表2），對篩選出的陽性酵母中水稻cDNA文庫載體（pPR3-N、pGADT7）的插入片段進行菌落PCR擴增。PCR擴增體系為10×buffer 2 μL、dNTP各0.2 mmol/L、上下游引物各1 μL（10 μmol/L）、Taq 0.5 μL，補充ddH2O至20 μL。PCR產(chǎn)物純化后送到上海生工生物公司測序。得到的序列在NCBI中用BLAST程序比對查找同源序列并確認基因。

表2 擴增文庫載體插入片段的引物序列

2 結果

2.1 DUALmembrane酵母雙雜交系統(tǒng)（膜系統(tǒng)）篩選與LCD互作的蛋白

2.1.1 誘餌蛋白LCD自激活及膜系統(tǒng)酵母篩庫體系檢測 根據(jù)膜系統(tǒng)酵母雙雜交的載體選擇原則，選擇pBT3-N作為誘餌蛋白表達載體進行篩庫，誘餌蛋白載體為pBT3-N-LCD。按照表3載體組合檢測誘餌蛋白載體pBT3-N-LCD的自激活。結果（圖1）表明，轉化1的酵母菌可以在SD-Leu平板上正常生長，說明pBT3-N-LCD表達的融合蛋白對NMY51酵母細胞的生長無毒性；轉化組合2在SD-Lue-Trp、SD-Lue-Trp-His和SD-Lue-Trp-His-Ade平板上均可以生長，說明pBT3-N-LCD和pOst-Nub1表達的融合蛋白可以相互結合并激活下游報告基因的表達，表明篩庫系統(tǒng)可以正常工作；轉化組合3在SD-Lue-Trp平板上可以正常生長，在SD-Lue-Trp-His平板上少量生長，在SD-Lue-Trp-His-Ade平板上完全不能生長（圖1），說明pBT3-N-LCD和pPR3-N表達的融合蛋白不存在自激活作用。根據(jù)酵母生長結果，選擇SD-Lue-Trp-His-Ade平板作為后續(xù)篩選互作蛋白的篩選條件。

2.1.2 膜系統(tǒng)條件下LCD互作的陽性酵母克隆篩選 將水稻膜系統(tǒng)文庫質(zhì)粒和pBT3-N-LCD質(zhì)粒共轉化酵母NMY51，共標記得到354個陽性克隆。將354個菌落劃線至SD-Lue-Trp-His-Ade+X-α-gal+AbA平板上，發(fā)現(xiàn)共有284個菌落呈藍色，說明pBT3-N-LCD與284個蛋白可能存在互作，并激活下游報告基因的表達，不能生長和不能變藍的菌落視為假陽性，予以舍棄。將第二輪篩選出來的生長良好并呈現(xiàn)藍色的酵母克隆，再次在SD-Lue-Trp-His-Ade+X-α-gal+AbA平板上篩選（圖2），仍然生長良好并呈現(xiàn)藍色的酵母菌落有228個。通過二、三輪的劃線篩選，最終篩選出228個潛在的陽性菌落。

表3 DUALmembrane系統(tǒng)誘餌蛋白LCD自激活體系

圖1 誘餌蛋白LCD在酵母NMY51中的自激活檢測

圖2 LCD互作的陽性酵母顯色篩選

2.1.3 膜系統(tǒng)條件下LCD互作的陽性酵母克隆插入片段的獲得與鑒定通過對228個陽性克隆菌落（依次編號為1-228）擴增，得到198個文庫質(zhì)粒pPR3-N中的插入cDNA片段。將198個PCR片段進行測序，去除重復序列，共得到120個測序結果。將測序結果BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gow/BLAST/）進行基因相似性比較，查找同源基因。進一步去除同源基因中讀碼框與pPR3-N插入片段讀碼框不一致的基因，最終共得到22個UniGene（表4）。通過功能預測分析發(fā)現(xiàn)，2、11、12、13、19、20與植物耐逆和物質(zhì)轉運相關；1、3、4、7與植物發(fā)育響應有關；14、15、16、17、18與細胞的生理代謝有關等。其中11號OsMTP1已有報道，與水稻Cd的積累和耐受性有關。

2.1.4 LCD與膜系統(tǒng)篩選出的22個候選蛋白的互作驗證將篩選到的22個基因克隆，構建重組載體pPR3-N-1-22，并按照表5的轉化組合進行自激活檢測發(fā)現(xiàn)，22個基因中編號15（LOC_Os01g38970）不僅可以在SD-Lue-Trp平板上生長，而且可以在SD-Lue-Trp-His-Ade平板上生長，說明LOC_Os01g38970在酵母中存在自激活現(xiàn)象，考慮其互作可能是假陽性，予以舍棄。選擇其余的21個基因進行互作驗證。

將pBT3-N-LCD分別與pPR3-N-1-22（15除外）共同轉化酵母NMY51，進行一對一互作初步驗證。結果發(fā)現(xiàn)，16不能在SD-Leu-Trp-His-Ade上生長，其余20個均可在SD-Leu-Trp-His-Ade平板上長出大量白色酵母菌落，說明這20個蛋白在酵母中與LCD存在互作，16舍棄。進一步將20個在SDLeu-Trp-His-Ade平板上長出的白色酵母菌落轉移至SD-Leu-Trp-His-Ade+X-α-gal+AbA平板上（圖3），發(fā)現(xiàn)共16個酵母菌斑可以很好的生長并呈現(xiàn)藍色，說明這16個蛋白與誘餌蛋白LCD之間存在互作，8、17、18、22不能生長或變藍予以舍棄。最終得到與LCD的互作蛋白為LOC_Os01g67250、LOC_Os10g34614、LOC_Os07g39900、LOC_Os08g01780、LOC_Os02g35560、LOC_Os06g45120、LOC_Os03g38020、LOC_Os08g42050、LOC_Os12g32380、LOC_Os05g03780、LOC_Os07g44180、LOC_Os09g30418、LOC_Os01g69220、LOC_Os06g08170、LOC_Os11g25980和LOC_Os08g44280，共16個。

表4 候選蛋白的功能分析

表5 膜系統(tǒng)篩選出的候選互作蛋白的自激活檢測

2.2 核系統(tǒng)酵母雙雜交篩選與LCD互作的蛋白

2.2.1 核系統(tǒng)條件下誘餌蛋白自激活檢測 將重組質(zhì)粒pGBKT7-LCD轉化酵母AH109，并以轉化空載體pGBKT7的AH109作為對照，涂布在SDTrp和SD-Trp-His平板上。結果（圖4）表明，轉化pGBKT7和pGBKT7-LCD的酵母都能在SD-Trp的平板上正常生長，說明pGBKT7-LCD表達的融合蛋白對AH109酵母細胞的生長無毒性。且轉化pGBKT7和pGBKT7-LCD的酵母都不能在SD-Trp-His平板上生長。同時，將pGBKT7-LCD和pGADT7共轉化酵母AH109，涂布于SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His平板上，結果表明，酵母可以在SD-Trp-Leu平板上生長，但不能在SD-Trp-Leu-His平板上生長。綜合轉化試驗結果，說明pGBKT7-LCD表達的融合蛋白不具有激活報告基因（His）的作用，可用于后續(xù)篩庫。

圖3 LCD與候選蛋白在膜系統(tǒng)酵母中的互作驗證

圖4 核系統(tǒng)條件下誘餌蛋白LCD在酵母AH109中的自激活檢測

2.2.2 pGADT7-prey和pGBKT7-LCD的共轉化和互作蛋白篩選將pGADT7-prey和pGBKT7-LCD共轉化酵母AH109，涂布于SD-Trp-Leu-His-Ade平板上，共標記51個陽性克隆。將51個菌落劃線至SD-Leu-Trp-His-Ade+X-α-gal平板上（圖5）發(fā)現(xiàn)，共有43個菌落呈藍色，說明LCD與43個蛋白在酵母中互作，不能生長和不能變藍的菌落視為沒有互作，予以舍棄。

2.2.3 陽性AH109酵母菌中pGADT7插入片段的獲得和分析通過對2次篩選出的43個陽性菌落擴增，得到38個文庫質(zhì)粒pGADT7中插入的cDNA片段，5個菌落經(jīng)多次擴增都不能擴增出片段，予以舍棄。將擴增出的38個PCR片段進行測序，去除重復序列，共得到25序列，將得到的25個測序結果利用NCBI在線比對工具BLAST（http：//www，ncbi.nlm.nih.gow/BLAST/）逐一進行基因相似性比較，查找同源基因，去除同源基因讀碼框與pGADT7插入片段的讀碼框不一致的序列，最終共得到7個UniGene（表6），編號為1-7。其中，5、6、7與植物抗逆和物質(zhì)的運輸有關；2、3、4與細胞生理代謝相關。

圖5 核系統(tǒng)條件下LCD互作的陽性酵母顯色篩選

表6 核體系下篩選的LCD候選互作蛋白

2.2.4 AH109酵母中LCD與互作蛋白的驗證 克隆篩選到的7個基因CDS全長序列，構建重組質(zhì)粒pGADT7-1-7，并按照2.1的方法進行自激活檢測。發(fā)現(xiàn)1、4基因存在自激活現(xiàn)象，予以舍棄，2、3、5、6和7不存在自激活現(xiàn)象，可以進一步進行互作驗證。

將pGBKT7-LCD分別與pGADT7-2、pGADT7-3、pGADT7-5、pGADT7-6、pGADT7-7共同轉化酵母AH109，發(fā)現(xiàn)2、3、5、6、7均可以在SD-Leu-Trp-His-Ade長出白色酵母菌落，說明2、3、5、6、7與LCD在酵母中存在互作。進一步將在SD-Leu-Trp-His-Ade營養(yǎng)缺陷板上長出的白色酵母菌落轉移至SD-Leu-Trp-His-Ade+X-α-gal板，發(fā)現(xiàn)5個編號的轉化菌株均能生長并呈現(xiàn)藍色（圖6）。因此，最終篩選得到的互作蛋白為LOC_Os03g15570、LOC_Os12g08760、LOC_Os 12g18110、LOC_Os 05g45950和LOC_Os 02g33820。

圖6 LCD與候選蛋白在AH109酵母中的互作驗證

3 討論

近年來，已經(jīng)有20多個介導水稻Cd積累的相關基因被鑒定，除LCD之外，大多數(shù)基因都直接參與Cd的吸收與轉運過程，主要是一些轉運Fe、Mn、Zn、Ca等離子的運輸?shù)鞍?，如Nramp5介導水稻Mn/Cd的吸收［37］；OsHMA3在根部細胞的液泡膜上，把Zn/Cd轉運到液泡中解毒，維持水稻中Zn的穩(wěn)態(tài)［16，38］；OsCCX2在水稻節(jié)部調(diào)節(jié)Ca/Cd的分配［24］。除了運輸?shù)鞍祝恍└缓腚装彼岬牡鞍谆蚨嚯?，能螯合Cd和解Cd等重金屬毒害，如植物螯合肽（PC）及其谷胱甘肽（GSH）等前體、金屬硫蛋白（MT）等。這些蛋白和多肽的合成和轉運，對水稻對Cd的分配以及Cd毒害耐性有重要影響，如OsLCT1很可能能轉運PC的前體，調(diào)控水稻GSH穩(wěn)態(tài)，在As/Cd解毒中起重要作用［22］。防衛(wèi)素蛋白如CAL1等也富含半胱氨酸，能螯合胞質(zhì)中的Cd并分泌到木薄壁細胞外，促進Cd通過導管從根部到葉片的長距離運輸［26］。此外，還有一些調(diào)控基因如轉錄因子、miRNA等，在調(diào)控水稻吸收、運輸、分配Cd的過程中起作用，最終影響Cd在水稻不同部位的分配和積累［39］。而LCD定位于細胞核和細胞質(zhì)中，既不是離子運輸?shù)鞍祝膊皇歉缓腚装彼岬牡鞍?，也沒有典型的結構域，推測LCD可能通過與其他蛋白互作，調(diào)控某個（或某些）Cd轉運蛋白的轉運活性，但目前對其介導Cd轉運的機制還不清晰。

本研究以水稻一周的根、地上部分，分蘗期的根、葉，開花期的根、葉、節(jié)、節(jié)間、花均量混勻為材料，分別構建DUALmembrane系統(tǒng)和Yeast Two-Hybrid系統(tǒng)cDNA文庫，并以LCD為誘餌，初步篩選到了21個與其互作的重要蛋白，分別屬于轉運蛋白、逆境響應相關蛋白、生長發(fā)育相關蛋白、蛋白激酶、生理代謝相關等及一些未知功能蛋白。與LCD互作的轉運蛋白中，有MTP、MFS（Metal facilitator superfamily）等轉運蛋白家族的成員，如LOC_Os05g03780、LOC_Os06g08170、LOC_Os08g42050等，推測水稻受到Cd毒害之后，LCD可能通過與相關轉運蛋白相互作用，調(diào)控轉運蛋白的轉運活性，從而影響Cd在水稻中的分配和積累。其中，LOC_Os05g03780（OsMTP1）已經(jīng)被報道參與Cd的運輸。OsMTP1屬于陽離子擴散促進劑（CDF）蛋白家族，廣泛存在于細菌、真菌、植物和動物體內(nèi)。在酵母或煙草中異源表達OsMTP1能夠增強Cd積累和對Cd的耐受性。dsRNAi水稻轉基因幼苗對重金屬敏感性改變，同時成熟水稻不同器官中金屬的積累量也發(fā)生了變化［30，40］。最近，一個MFS成員OsCd1已被鑒定，參與水稻Cd吸收與籽粒Cd積累［40］。LCD互作蛋白中，LOC_Os06g08170是一個MFS新成員，其是否參與水稻的Cd吸收與轉運有待進一步的研究。

蛋白激酶、熱激蛋白、ABA相關蛋白等在植物生物與非生物逆境脅迫反應中都起著重要的作用，如Cd能通過誘導活性氧（ROS）的產(chǎn)生，激活2個玉米蛋白激酶（ZmMPK3和ZmMPK6），來響應Cd脅迫［41］。早前也有研究發(fā)現(xiàn)水稻的這兩個蛋白激酶（OsMPK3和OsMPK6）受Cd誘導激活，且該激活需要鈣依賴的蛋白激酶（CDPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3kinase）的參與，增強植物的耐Cd能力［42］。另外的研究發(fā)現(xiàn)，異源表達一個水稻熱激蛋白（OsMSR3），能夠增加擬南芥耐Cd、Cu毒害的能力［43-44］。與LCD互作的蛋白中，也有蛋白激酶（LOC_Os03g38020和LOC_Os03g15570）、熱激蛋白（LOC_Os09g30418）等，其與LCD相互作用的具體機制還需進行深入研究。

由于酵母雙雜存在一定的局限性，本研究獲得的互作蛋白還是一個初步結果，下一步還需采用其他方法，對初篩出的21個蛋白作進一步互作分析，如利用雙分子熒光互補、免疫共沉淀等方法對LCD和21個候選蛋白之間的互作進行鑒定。此外，還需要構建基因敲除突變體等遺傳材料，對候選互作蛋白在Cd積累中的遺傳功能開展研究，多方面探討LCD參與的Cd離子轉運、積累機制。

4 結論

利用水稻膜系統(tǒng)和核系統(tǒng)酵母雙雜交cDNA文庫，篩選和鑒定了21個與LCD相互作用的蛋白，參與植物對逆境響應、離子轉運等途徑，推測LCD與其中某些蛋白共同作用調(diào)節(jié)水稻Cd積累。