16個(gè)天南星科魔芋屬植物葉表皮細(xì)胞形態(tài)特征及其系統(tǒng)學(xué)意義

趙青華，楊朝柱，王 孟，覃 宇，胡永忠，降巧龍，潘婭妮

(1.恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北省魔芋種子種苗工程技術(shù)中心，湖北 恩施 445000；3.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心鄂西綜合試驗(yàn)站，湖北 恩施 445000)

魔芋為天南星科魔芋屬多年生草本植物，起源于古熱帶，經(jīng)漫長(zhǎng)的地理變遷和隔離形成了多個(gè)生態(tài)類型[1].全球已知的魔芋屬植物超過(guò)了200種，集中分布在東南亞、大洋洲和非洲[2-5].我國(guó)魔芋屬植物約24種，半數(shù)以上分布在滇南熱帶地區(qū)，其中6種為中國(guó)特有種[6-11].長(zhǎng)期的生態(tài)隔離和生殖隔離導(dǎo)致魔芋屬植物地域交流和基因交流障礙，在種水平上形成的地方居群，其植株大小、葉柄及花柄色澤斑紋、花序構(gòu)成、球莖形狀及肉色等性狀表現(xiàn)出高度的多態(tài)性，僅從形態(tài)學(xué)難以準(zhǔn)確的進(jìn)行鑒定和分類，必須借助于其他性狀[12-13].國(guó)內(nèi)外在解剖學(xué)、孢粉學(xué)、細(xì)胞學(xué)、植物化學(xué)、分子生物學(xué)等方面做了大量的研究，為魔芋屬植物的進(jìn)化、分類和鑒定提供了豐富的依據(jù)[2，12，14-22].

當(dāng)前，魔芋作為一種具有重要開(kāi)發(fā)前景的膳食纖維源植物，發(fā)展速度快，人工大面積種植種類混雜，單純依靠外觀形態(tài)鑒定難以獲得準(zhǔn)確結(jié)果，往往導(dǎo)致同種異名和異種同名現(xiàn)象，這對(duì)生產(chǎn)不利.葉片是植物與外界環(huán)境進(jìn)行能量、氣體和水分交換的關(guān)鍵部位，其形態(tài)特征受到基因和環(huán)境的控制，是長(zhǎng)期適應(yīng)原生環(huán)境的結(jié)果[23-26].葉表皮細(xì)胞微形態(tài)特征尤其是氣孔類型在植物分類、系統(tǒng)進(jìn)化以及原產(chǎn)地鑒別上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[27-33]，而魔芋屬植物這方面研究匱乏，僅在少數(shù)幾個(gè)種如南蛇棒(A.dunnii)、白魔芋(A.albus)、花魔芋(A.konjac)、甜魔芋(原文翻譯為A.dunnii，應(yīng)為A.paeoniifolius‘Yellow’)[7]、珠芽魔芋(A.bulbifer)有零星報(bào)道而缺乏系統(tǒng)性比較研究，在亞種和變種水平未查閱到相關(guān)報(bào)道[34-35].因此，對(duì)保存于恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院魔芋種質(zhì)資源圃的16個(gè)魔芋屬植物葉表皮細(xì)胞微形態(tài)進(jìn)行研究，并對(duì)13個(gè)具有多態(tài)性的性狀進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，以期為魔芋屬植物的鑒定、演化及分類提供新證據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

16個(gè)魔芋種(圖1和表1)，其中花魔芋地方種2個(gè)(恩施花魔芋，麗江花魔芋)，遠(yuǎn)緣雜交種1個(gè)(鄂魔芋1號(hào)).2020年種植于湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科研究院高新示范園(alt.=410 m)，遮蔭度約50%，常規(guī)管理.

1.2 葉表皮細(xì)胞觀察

葉表皮細(xì)胞采用印跡法觀察[36].待魔芋完全展葉后，取三裂葉頂部小葉，蒸餾水洗凈，濾紙吸干，避開(kāi)葉眿，用毛刷迅速蘸取少量透明指甲油(BNC，Korean)由內(nèi)向外涂抹，大小約0.5 cm×1 cm，不可來(lái)回或重復(fù)涂抹.觀察上表皮時(shí)涂抹在小葉中部，觀察下表皮時(shí)從葉尖到基部選取上、中、下三個(gè)部位.3～5 min后，用鑷子撕下薄膜，置于載玻片上，壓平后光學(xué)顯微鏡(浙江舜宇光學(xué))20倍物鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，CCD拍照.

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Image-Pro Plus 6.0計(jì)數(shù)葉表皮細(xì)胞數(shù)、氣孔數(shù)量，測(cè)量氣孔大小，計(jì)算氣孔指數(shù)(stomata index，SI)和氣孔密度(stomata density，SD).SI=Ns/(Ne+Ns)×100%，SD=Ns/A.其中，Ns表示氣孔數(shù)，Ne表示表皮細(xì)胞數(shù)，A代表面積(mm2).表皮及氣孔的性狀參照楊等[37]文獻(xiàn)描述.利用SPSS軟件對(duì)13個(gè)具有多態(tài)性的性狀進(jìn)行聚類分析，采用平方歐式距離，標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，定性描述賦值，如垂周壁式樣1為平直，1.5為平直-弓形，2為弓形，3為淺波，4為深波；上表皮氣孔0為無(wú)，1為有；氣孔分布特點(diǎn)各部位差異不顯著為均勻，差異顯著為遞增或遞減.

2 結(jié)果與分析

2.1 氣孔器性狀

16個(gè)魔芋種氣孔主要分布在下表皮，僅滇魔芋、甜魔芋、優(yōu)樂(lè)魔芋和東亞魔芋上表皮觀察到氣孔(圖1-8a，10a-12a).氣孔平列型，由2個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞和2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞組成，副衛(wèi)細(xì)胞表面具條紋，與長(zhǎng)軸近垂直，保衛(wèi)細(xì)胞腎形(圖1).氣孔開(kāi)口長(zhǎng)橢圓形，大小為(24.88～43.62 μm)×(5.80～16.64 μm)，勐海魔芋長(zhǎng)軸最小(24.88 μm)，西盟魔芋短軸最小(5.80 μm)，彌勒魔芋氣孔最大(43.62 μm×16.64 μm).氣孔密度(SD)41.67～159.15個(gè)/mm2，鄂魔芋1號(hào)最小，西盟魔芋最大.氣孔指數(shù)(SI)9.47%～19.05%，鄂魔芋1號(hào)最小(9.47%)，西盟魔芋最大(19.05%)，彌勒魔芋次之(17.91%)，甜魔芋第三(16.28%).氣孔在葉片下表面分布表現(xiàn)不同，9個(gè)種從葉尖至基部遞增，7個(gè)均勻分布(表1).滇魔芋的上表皮和西盟魔芋下表皮均發(fā)現(xiàn)了相連氣孔器(圖2).

a:上表皮；b:下表皮.1：恩施花魔芋(A.konjac cv.Enshi)；2：鄂魔芋1號(hào)(F1(花魔芋×白魔芋)(A.konjac×A.albus.cv.emoyu No.1)；3：白魔芋(A.albus)；4：麗江花魔芋(A.konjac cv.Lijiang)；5：A.asterostigmatus；6：西盟魔芋(A.krausei)；7：勐海魔芋(A.kachinensis)；8：優(yōu)樂(lè)魔芋(A.yuloensis)；9：東京魔芋(A.tonkinensis)；10：甜魔芋(A.paeoniifolius ‘Yellow’)；11：滇魔芋(A.yunnanensis)；12：東亞魔芋(A.kiusianus)；13：疣柄魔芋(A.paeoniifolius)；14：彌勒魔芋(A.muelleri)；15：謝君魔芋(A.xiei)；16：珠芽魔芋(A.bulbifer)圖1 光學(xué)顯微鏡下16種魔芋葉表皮形狀Fig.1 Morphology of epidermis in 16 Amorphophallus species observed by optical microscope

表1 16個(gè)魔芋氣孔特征Tab.1 Traits of stomata in 16 Amorphophallus species

左圖：滇魔芋上表皮氣孔.右圖：西盟魔芋下表皮氣孔.NS：相連氣孔圖2 滇魔芋與西盟魔芋相連氣孔Fig.2 Neighbor joint stomata in upper epidermis of A.yunnanensis and lower epidermis of A.krausei

2.2 表皮細(xì)胞特征

16個(gè)魔芋上表皮和下表皮垂周壁式樣表現(xiàn)出多態(tài)性，其中上表皮5種類型，分別為平直、弓形、淺波、深波及復(fù)合型平直-弓形，下表皮3種類型，淺波、深波和弓形(表2).表皮細(xì)胞形狀有多邊形和不規(guī)則2種類型，勐海魔芋、優(yōu)樂(lè)魔芋、疣柄魔芋上下表皮細(xì)胞形狀相似，東京魔芋幾乎相同(圖1-7a，7b，8a，8b，13a，13b)，甜魔芋(圖1-10a，10b)、東亞魔芋(圖1-12a，12b)、彌勒魔芋(圖1-14a，14b)、謝君魔芋(圖1-15a，15b)上表皮細(xì)胞典型多邊形，與下表皮細(xì)胞形狀差異明顯.恩施花魔芋、鄂魔芋1號(hào)(F1(花魔芋×白魔芋)、白魔芋、A.asterostigmatus、西盟魔芋、滇魔芋、珠芽魔芋上表皮細(xì)胞密布明顯的條形紋飾.雜交種鄂魔芋1號(hào)垂周壁式樣和上表皮形狀明顯介于恩施花魔芋和白魔芋之間(表2，圖1-1a、2a、3a)，與麗江花魔芋差別明顯(圖1-4a)，可見(jiàn)垂周壁式樣和表皮細(xì)胞形狀受基因控制.

表2 16個(gè)魔芋葉表皮細(xì)胞特征Tab.2 Traits of leaf epidermis in 16 Amorphophallus species

圖3 16個(gè)魔芋屬植物聚類分析Fig.3 Cluster analysis of 16 Amorphophallus species basing on the polymorphic traits of leaf epidermis

2.3 聚類分析

對(duì)魔芋上下表皮細(xì)胞垂周壁式樣，形狀，氣孔密度、指數(shù)、大小、分布特點(diǎn)等13個(gè)具有多態(tài)性的性狀進(jìn)行聚類分析.在組間距離17水平上(虛線)，16個(gè)種聚類成4個(gè)群(圖3).

類群I：該群數(shù)量最多，包括麗江花魔芋、A.asterostigmatus、勐海魔芋、東京魔芋、恩施花魔芋、鄂魔芋1號(hào)、白魔芋、彌勒魔芋、謝君魔芋、疣柄魔芋、珠芽魔芋11個(gè)種，氣孔密度41.67～95.10個(gè)/mm2,氣孔指數(shù)9.47%～13.09%，均小于其他類群.雜交種鄂魔芋1號(hào)與親本組間距小，彌勒魔芋和謝君魔芋兩個(gè)珠芽類型魔芋聚類一塊，表明聚類可靠性較好.

類群II：包括甜魔芋和東亞魔芋2個(gè)種，氣孔密度和氣孔指數(shù)較大，上表皮細(xì)胞多邊形，垂周壁式樣平直，下表皮光滑.

類群III：僅攸樂(lè)魔芋1個(gè)種，該種裂葉分支處具內(nèi)生珠芽，上下表皮形狀相似，垂周壁式樣相同，無(wú)條形紋飾，上表皮具氣孔.

類群IV：僅西盟魔芋1個(gè)種，氣孔密度(159.15個(gè)/mm2)和氣孔指數(shù)(19.05%)最大，上表皮垂周壁淺波，下表皮深波，具相連氣孔.

3 結(jié)論與討論

人類對(duì)魔芋的認(rèn)知是一個(gè)長(zhǎng)期、漸進(jìn)的過(guò)程.特別是近30年來(lái)，魔芋葡甘露聚糖作為食品級(jí)膳食纖維新資源，在全球范圍類逐步形成了一個(gè)從種植、加工到制品的產(chǎn)業(yè)鏈，日本、中國(guó)、中南半島和馬來(lái)群島均有大面積種植.商業(yè)開(kāi)發(fā)對(duì)魔芋資源產(chǎn)生了深刻的影響，一是打破了魔芋原生地域界限，如原產(chǎn)中南半島和馬來(lái)群島的彌勒魔芋引種至中國(guó)云南及廣西熱帶地區(qū)，原產(chǎn)與川滇交界的金沙河谷狹小區(qū)域的白魔芋在湖北、重慶和貴州均有種植；二是人工定向改良加速了種間基因的交流，創(chuàng)造出新的物種[38]；三是新的魔芋屬植物被發(fā)掘和鑒定[5-7，11].面對(duì)這種復(fù)雜的局面，豐富的鑒定手段必不可少.

長(zhǎng)期以來(lái)，葉片表皮細(xì)胞性狀表達(dá)由基因和環(huán)境決定，在屬、種水平上的分類、進(jìn)化和鑒別中受到了廣泛的關(guān)注[27-33].在本研究中鄂魔芋1號(hào)為花魔芋和白魔芋雜交后代，其上表皮垂周壁式樣平直-弓形，綜合了雙親性狀，表明垂周壁更多受遺傳控制，可鑒別該性狀差異明顯的雙親雜交后代.花魔芋兩個(gè)地方種群麗江花魔芋和恩施花魔芋上表皮出現(xiàn)了明顯的分化，前者表皮細(xì)胞光滑，垂周壁式樣淺波，且葉表面具蠟質(zhì)，后者表皮細(xì)胞密布條紋，垂周壁式樣平直，無(wú)蠟質(zhì)，這與生境有關(guān)，麗江花魔芋生長(zhǎng)在高原，光照和紫外線強(qiáng)烈，需要通過(guò)表皮結(jié)構(gòu)改變來(lái)反射光線.筆者在考察中發(fā)現(xiàn)，麗江花魔芋在云南曲靖、楚雄、保山、麗江，四川攀枝花和甘孜均有分布，因此，可推斷花魔芋自云南至少有2條進(jìn)化路線，一條是朝西北高原發(fā)展形成了高原濕潤(rùn)氣候生態(tài)型，另一條是向東北發(fā)展形成了低海拔濕潤(rùn)氣候生態(tài)型.氣孔是葉表皮微形態(tài)重要的性狀之一，其調(diào)控是植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫有效策略.從氣孔類型來(lái)看，16個(gè)魔芋屬植物氣孔均為平列型，開(kāi)口長(zhǎng)橢圓形，由2個(gè)腎形保衛(wèi)細(xì)胞和2個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成，副衛(wèi)細(xì)胞密布條形紋飾.氣孔大小、氣孔指數(shù)和氣孔密度種間變化差異大，這與他人研究結(jié)果一致[34-35].西盟魔芋和甜魔芋在云南普洱地區(qū)自然分布較多，氣孔密度和氣孔指數(shù)高，與其生長(zhǎng)的干熱環(huán)境有關(guān).葉面具外生珠芽的彌勒魔芋、珠芽魔芋氣孔大，二者均為3倍體(2n=39)[12，21].謝君魔芋具有珠芽，分布在云南德宏州一帶，俗稱紅魔芋，對(duì)其倍性研究結(jié)果存在爭(zhēng)議[39-40]，本研究從氣孔大小來(lái)看支持其為多倍體，但筆者2018年用謝君魔芋作為父本，與二倍體花魔芋(2n=26)雜交獲得了實(shí)生籽，而用彌勒魔芋花粉與二倍體魔芋雜交至今未獲得成功，雜交結(jié)果支持其為二倍體.這種結(jié)果的原因可能是謝君魔芋是一個(gè)混倍性群體.氣孔在葉表皮分布于植物的生長(zhǎng)習(xí)性有關(guān)，陽(yáng)生植物氣孔在下表皮，蔭生植物上下表皮均有氣孔[25].魔芋屬半蔭生植物，其氣孔主要分布在下表皮，但滇魔芋、甜魔芋、優(yōu)樂(lè)魔芋和東亞魔芋上表皮出現(xiàn)少量氣孔，可能更耐隱蔽環(huán)境.滇魔芋和西盟魔芋中觀察到相鄰氣孔，這與氣孔發(fā)生不相鄰原則矛盾[41-42]，是由于種植環(huán)境引起的異常還是種的屬性？有待于進(jìn)一步研究.垂周壁式樣的進(jìn)化順序?yàn)槠街?、弓形、淺波至深波，彎曲弧度受光照影響[43]，從上表皮細(xì)胞垂周壁式樣來(lái)看，恩施花魔芋、甜魔芋、東亞魔芋、彌勒魔芋、謝君魔芋和珠芽魔芋更原始，勐海魔芋、攸樂(lè)魔芋和東京魔芋進(jìn)化程度高，其余為衍生類型，與Gao Y等[18]利用cpDNA單倍型研究結(jié)果較為一致.

16個(gè)魔芋分為4個(gè)類群，其中甜魔芋和疣柄魔芋分屬不同的類群，Yin J等[7]和Gao Y等[18]認(rèn)為，甜魔芋從疣柄魔芋進(jìn)化而來(lái)的一個(gè)栽培種，此外，3個(gè)外生珠芽的魔芋(彌勒魔芋、謝君魔芋和珠芽魔芋)形態(tài)學(xué)非常接近，與葉表皮性狀聚類有差異.同時(shí)，雜交衍生種鄂魔芋1號(hào)與其親本花魔芋和白魔芋以及謝君魔芋和彌勒魔差距較小，表明葉表皮性狀聚類分析在一定程度上能反映進(jìn)化關(guān)系.

由此可見(jiàn)，魔芋葉表皮在氣孔密度、大小和氣孔指數(shù)、氣孔分布特點(diǎn)，上下表皮細(xì)胞形狀、垂周壁式樣等性狀方面存在差異，這些性狀差異更多地受到基因型的決定，反映了物種進(jìn)化關(guān)系和原生環(huán)境差異.因此，魔芋屬植物葉表皮細(xì)胞微形態(tài)特征對(duì)于在種及以下水平上的分類、鑒定以及進(jìn)化關(guān)系等研究具有一定的參考價(jià)值.