LC-MS/MS同位素內(nèi)標法測定雞肉中氯霉素和金剛烷胺的殘留量

胡 容，單長海

(恩施州公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000)

氯霉素屬抑菌性廣譜抗生素，用于治療由傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、流感桿菌、布氏桿菌、肺炎球菌等引起的感染，對造血系統(tǒng)有嚴重不良反應，可能發(fā)生不可逆性骨髓抑制.氯霉素可透過胎盤屏障，對早產(chǎn)兒和足月產(chǎn)新生兒均可能引起毒性反應，發(fā)生“灰嬰綜合征”[1].氯霉素常被用于畜禽動物及水產(chǎn)品的疾病治療和預防，但會造成動物源性食品中的藥物殘留[2].我國原農(nóng)業(yè)部第235號公告中已將氯霉素列為不得檢出藥物.因此，氯霉素在畜牧產(chǎn)品中的殘留對人類健康有很大風險.金剛烷胺屬于三環(huán)氨類藥物，對流感病毒有抑制作用，廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，用來防止禽流感等疾病，但是，食用金剛烷胺類藥后會產(chǎn)生嘔吐以及神經(jīng)紊亂癥狀等相對明顯的副作用，而且其在體內(nèi)降解代謝的量極微.若長期食用殘留量高或被此類藥物污染的食品，會在人體內(nèi)富集，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響[3].原農(nóng)業(yè)部公告第560號令中明確規(guī)定嚴禁在肉雞生產(chǎn)中使用金剛烷胺.

目前，國家及各地市規(guī)定的監(jiān)督檢驗中，動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量檢驗方法主要采用GB/T 22338-2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量的測定》[4]，金剛烷胺主要采用GB 31660.5-2019《食品國家安全標準 動物源性食品中金剛烷胺殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[5].在現(xiàn)有的研究報道中，檢測動物源性食品中氯霉素類殘留量[6-8]和金剛烷胺殘留量[9-10]的方法較多，這些方法的不足之處在于檢測目標過于單一，均為獨立的前處理過程，同時測定氯霉素和金剛烷胺的前處理方法還未見報道，但是在動物源性食品的監(jiān)督檢驗中，雞肉樣品一般都需要檢測氯霉素和金剛烷胺兩種化合物.因此，研究同時測定氯霉素和金剛烷胺兩種化合物的前處理方法，對節(jié)省人力物力和檢測時間具有緊迫意義.

對雞肉樣品中氯霉素和金剛烷胺兩種化合物進行分析，采用乙腈作溶劑，并創(chuàng)造性的采用超聲提取，經(jīng)驗證，提取效果好于傳統(tǒng)的提取方式；采用冷凍離心、PSA和C18凈化，LC-MS/MS同位素內(nèi)標技術(shù)分析.本方法采用相同的前處理方法，分別用正模式和負模式進行儀器分析，在很大程度上節(jié)省人力和減少試劑耗材的消耗，方法穩(wěn)定性好，回收率高，可滿足雞肉樣品中氯霉素和金剛烷胺的分析.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 TSQ Quantis液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Fisher)；ST 40R離心機(Thermo Fisher)；Vac Elut SPS 24半自動固相萃取儀(安捷倫)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；氮氣吹干儀(德翔)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海昕儀)；MiLLi-Q純水系統(tǒng)(美國MiLLipore公司)；Quintix 224-1cn電子分析天平(賽多利斯)；旋渦混合儀(北京方正公司).

1.1.2 主要試劑與樣品 氯霉素標準品(純度99.6%，ANPEL)；氯霉素-D5(純度99.6%，ANPEL)；甲醇中鹽酸金剛烷胺溶液標準物質(zhì)(1 000 mg/L，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心)；甲醇中鹽酸金剛烷胺-D15溶液標準物質(zhì)(10 mg/L，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心)；甲醇(等級LC-MS，CNW)；乙腈、丙酮、正己烷(等級LC，CNW)；乙酸鈉、乙酸銨(等級AR，國藥集團化學試劑有限公司)；QuEChERS試劑(600 mg MgSO4,100 mg PSA,40 mg C18，CNW，SBE-CA8454-25).

雞肉中金剛烷胺質(zhì)控樣(20.2 μg/kg，ANPEL)，雞肉中氯霉素質(zhì)控樣(30.6 μg/kg，ANPEL)；雞肉樣品購于市場.

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取氯霉素50 mg(精確至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，得質(zhì)量濃度為500 mg/L的儲備液；準確稱取氯霉素-D510 mg(精確至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，得質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備液.臨用時，氯霉素-D5使用液配制成質(zhì)量濃度為100 μg/L，氯霉素用基質(zhì)溶液配置，質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、100.0 μg/L.金剛烷胺-D15(10 mg/L)臨用時直接使用，金剛烷胺(1 000 mg/L)臨用時用基質(zhì)溶液配置配，質(zhì)量濃度分別為2.0、4.0、10.0、20.0、100.0、200.0 μg/L.

1.2.2 樣品處理 稱取試樣5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL玻璃比色管中，加入100 μL氯霉素-D5(100 mg/L)工作溶液、100 μL金剛烷胺-D15(10 mg/L)和30 mL乙腈，加入2 g NaCl，旋渦混合30 s，超聲提取10 min，轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃冷凍離心，6 000 r/min離心5 min.將上清液移入150 mL分液漏斗中，加入15 mL乙腈飽和的正己烷，振蕩5 min，靜置分層，轉(zhuǎn)移乙腈層至100 mL棕色心形瓶中.殘渣中再加入30 mL乙腈，旋渦混合30 s，超聲提取10 min，轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃冷凍離心，6 000 r/min離心5 min.取上清液轉(zhuǎn)移至同一分液漏斗，振蕩5 min，靜置分層，轉(zhuǎn)移至同一棕色心形瓶中.向心形瓶中加入5 mL正丙醇，用氮氣吹干，濃縮到10 mL左右時，加入QuEChERS試劑(100 mg PSA，40 mg C18)，旋渦混合2 min，10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入干凈離心管，氮氣吹干，用1 mL水定容，定容液經(jīng)過0.22 μm濾膜至進樣瓶，待測定.

1.2.3 儀器檢測條件

1)色譜條件

色譜柱為Agilent SB C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，柱溫30 ℃，進樣量1 μL.氯霉素檢測流動相為甲醇-0.1%乙酸銨水溶液，流速0.3 mL/min，梯度洗脫程序見表1.金剛烷胺檢測流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min，梯度洗脫程序見表2.

表1 氯霉素檢測梯度洗脫程序

表2 金剛烷胺檢測梯度洗脫程序

表3 定性離子對、定量離子對、碰撞能量和保留時間Tab.3 Qualitative ion pair,quantitative ion pair,collision energy and retention time

2)質(zhì)譜條件

氯霉素檢測質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；負離子掃描模式；多重反應監(jiān)測(SRM)；電噴霧電壓(2 500 V)；霧化氣壓(0.276 MPa)；氣簾氣壓(0.172 MPa)；輔助氣流速(0.206 MPa)；離子源溫度(350 ℃).金剛烷胺檢測質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描模式；多重反應監(jiān)測(SRM)；電噴霧電壓(3 500 V)；霧化氣壓(0.276 MPa)；氣簾氣壓(0.172 MPa)；輔助氣流速(0.206 MPa)；離子源溫度(350 ℃).

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

金剛烷胺和金剛烷胺-D15分子中含有氨基，在正離子模式下易形成[M+H]+準分子離子，氯霉素和氯霉素-D5在負離子模式下易形成[M-H]-準分子離子，在分析質(zhì)譜條件時，配置標準溶液為1 mg/L，采用直接進樣法，DEFINE SCAN模式掃描，OPTIMIZATION模式優(yōu)化碰撞能量，質(zhì)譜條件見表3，提取離子流色譜圖見圖1.

(a) 氯霉素 (b) 氯霉素-D5

(c) 金剛烷胺 (d) 金剛烷胺-D15圖1 氯霉素、氯霉素-D5、金剛烷胺和金剛烷胺-D15提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of chloramphenico,chloramphenico-D5,amantadine and amantidine-D15

2.2 前處理條件的確定

提取溶劑的選擇對提取的效果比較重要，以能夠充分提取目標物和雜質(zhì)的去除度為目標，試驗采用雞肉粉中氯霉素質(zhì)控樣和雞肉粉中金剛烷胺的質(zhì)控樣為試驗樣品，選取乙酸乙酯和乙腈作為溶劑.結(jié)果顯示，兩種溶劑都能很好地提取目標物，但是乙酸乙酯提取雜質(zhì)明顯高于乙腈提取的雜質(zhì)，因此，選取乙腈作為提取溶劑最佳.

表4 不同提取方式下氯霉素和金剛烷胺回收率Tab.4 Recovery rates of chloramphenicol and amantadine under different extraction methods

表5 超聲提取不同次數(shù)下的氯霉素和金剛烷胺回收率Tab.5 Recovery rates of chloramphenicol and amantadine in different extraction times by ultrasound

表6 氯霉素、金剛烷胺標準曲線和決定系數(shù)Tab.6 Standard curves and determining factor of chloramphenicol and amantadine

表7 氯霉素和金剛烷胺測定的回收率和精密度Tab.7 Recovery and precision of chloramphenicol and amantadine

稱取質(zhì)控樣5 g(精確到0.001 g)，加入乙腈30 mL，旋渦混合后，采用80 r/min震搖5、10、15、20 min和超聲法超聲5、10、15、20 min兩種方式進行比較，超聲法提取15 min，氯霉素回收率可達91.6%，金剛烷胺回收率可達89.6%，因此，超聲法提取15 min為最佳提取方式.采用超聲法提取15 min提取1、2、3次進行比較，提取2次基本能夠提取完全，氯霉素回收率可達95.6%，金剛烷胺回收率可達93.9%，因此，最佳的提取方式為超聲15 min提取2次.不同提取方式下氯霉素和金剛烷胺回收率結(jié)果見表4，不同提取次數(shù)氯霉素和金剛烷胺回收率結(jié)果見表5.

考慮到雞肉樣品基質(zhì)影響較復雜，乙腈提取時加入2 g NaCl，起到抑制雜質(zhì)溶解的作用，離心時采用4 ℃冷凍離心，降低雜質(zhì)的溶解度，樣品離心后合并兩次提取液的上清液于雞心瓶中，向心形瓶中加入5 mL正丙醇，用氮氣吹干儀氮吹，濃縮到10 mL時，加入100 mg PSA，40 mg C18，旋渦混合2 min，10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入干凈離心管氮氣吹干，用1 mL水定容，定容液過0.22 μm濾膜至進樣瓶，待測定.

2.3 方法學驗證

2.3.1 校準曲線 按照1.2.1的方法進行曲線分析，以目標物定量離子和相應內(nèi)標物峰面積之比為橫坐標，目標物質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制標準曲線.氯霉素在0.5～100.0 ng/mL范圍內(nèi)，金剛烷胺在0.5～100.0 ng/mL范圍內(nèi)，標準曲線良好，結(jié)果見表6.

2.3.2 檢出限、回收率、精密度 檢出限的測定采用低濃度加標法，本研究采用空白雞肉樣品添加氯霉素質(zhì)量濃度0.05 μg/kg，金剛烷胺添加質(zhì)量濃度為0.5 μg/kg，按照樣品處理方式平行測定10次，采用經(jīng)典公式MDL=S×t(n-1，1-a=0.99)計算檢出限(LOD)[11]，按照約3倍檢出限計算定量限(LOQ).經(jīng)過計算，氯霉素和金剛烷胺的檢出限(LOD)分別為0.03 μg/kg、0.3 μg/kg，氯霉素和金剛烷胺的定量限(LOQ)分別為0.1 μg/kg、1.0 μg/kg.

回收實驗采用空白基質(zhì)樣品加標法，按照1倍定量限、10倍定量限、50倍定量限的水平添加標準物質(zhì)，添加內(nèi)標物質(zhì)氯霉素-D5質(zhì)量濃度為0.1 mg/L、金剛烷胺-D15為2 mg/L，添加量為100 μL，按照2.2的方法平行測定3次，精密度實驗平行測定7次，檢測結(jié)果見表7.從表7可以看出，兩種物質(zhì)回收率范圍在75.4%～95.8%之間，精密度范圍在1.6%～6.2%之間，滿足獸藥殘留定量分析要求.

2.3.3 方法應用 對在市場上抽取的10批次雞肉樣品，利用本方法進行分析，其中有1批次檢出金剛烷胺(2.1 μg/kg)，其余批次均未檢出金剛烷胺和氯霉素.采用GB /T 22338-2008進行氯霉素分析，均未檢出；采用GB 31660.5-2019對金剛烷胺進行分析，其中有1批次檢出金剛烷胺(1.8 μg/kg).說明建立LC-MS/MS同位素內(nèi)標法測定雞肉中氯霉素和金剛烷胺殘留量的方法準確可靠.

3 結(jié)論

通過優(yōu)化儀器條件和前處理方法，并經(jīng)過方法學驗證，建立了超聲提取LC-MS/MS同位素內(nèi)標法測定雞肉中氯霉素和金剛烷胺的殘留量的方法.其檢出限優(yōu)于國家標準GB /T 22338-2008(氯霉素為0.1 μg/kg)和GB 31660.5-2019(金剛烷胺為1 μg/kg)，準確度和精密度驗證結(jié)果符合GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[12]，而且能夠應用于雞肉產(chǎn)品的氯霉素和金剛烷胺藥物殘留的同時檢測，應用前景良好.