獺兔 MITF不同可變剪接體對(duì)黑色素沉積的影響

盧婷婷，王曼曼，陳 實(shí)，申金鈺，周 彤，鮑國(guó)連，陳 陽(yáng),3，吳信生,3

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；3.農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

毛色是皮毛動(dòng)物的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，也是一種可利用的遺傳標(biāo)記，在人以及小鼠上已有研究[1-2]。獺兔，學(xué)名力克斯兔，因毛色眾多而著名，國(guó)內(nèi)引進(jìn)的主要有白色、青紫藍(lán)色、花色和海貍色等14種色型，深受消費(fèi)者喜愛。已知哺乳動(dòng)物的毛色主要決定于黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的真黑素和褐色素之間的轉(zhuǎn)換,而黑色素的形成是多種不同的基因以及環(huán)境因素共同決定的[3-4]。

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia associated transcription factor, MITF)在哺乳動(dòng)物皮毛的黑色素形成中發(fā)揮重要作用，其起源于一種放射性誘導(dǎo)的突變小鼠，后代小鼠表現(xiàn)為小眼畸形，早發(fā)性耳聾，皮毛和虹膜色素減退。根據(jù)有關(guān)小鼠等的文獻(xiàn)報(bào)道，編碼不同蛋白異構(gòu)體的MITF基因都由9個(gè)外顯子組成，2～9號(hào)外顯子序列是一致的，1號(hào)外顯子是不相同的[5]。MITF基因在黑色素細(xì)胞特異性表達(dá)中發(fā)揮了重要作用，并且參與多種細(xì)胞發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)[6-7]。但在兔上，MITF不同可變剪接體對(duì)黑色素沉積的影響如何？目前尚未見相關(guān)報(bào)道。此外，有研究表明MITF可直接調(diào)控毛色相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括TYR、TYRP-1和TYRP-2(DCT)等酪氨酸家族[8]。MITF可調(diào)控與黑素小體成熟及運(yùn)輸密切相關(guān)的基因表達(dá)，包括GPNMB、PMEL-17等[9-10]。其中，GPNMB作為細(xì)胞粘附分子、黑素體蛋白、細(xì)胞表面受體和可溶性配體發(fā)揮重要作用[11]。PMEL-17基因的正常表達(dá)是淀粉樣纖維形成的關(guān)鍵，其表達(dá)受MITF基因的調(diào)控[12-13]。因此，本研究選取TYR、GPNMB、PMEL-17基因，來分析MITF不同可變剪接體的下游信號(hào) 通路。

不同的剪接位點(diǎn)產(chǎn)生不同的可變剪接體，可能具有不同的基因功能和蛋白質(zhì)多樣性，基于此，本研究克隆MITF6種不同可變剪接體，通過檢測(cè)下游基因mRNA表達(dá)量和黑色素細(xì)胞中黑色素的沉積量來驗(yàn)證不同可變剪切體對(duì)黑色素沉積的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 試驗(yàn)選用購(gòu)于江蘇揚(yáng)州施橋兔場(chǎng)的2月齡獺兔，采集皮膚和脾臟組織于 -70 ℃保存。試驗(yàn)細(xì)胞選擇揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物遺傳資源評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的兔黑色素細(xì)胞系[14]。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。DNA Ligation Kit Ver.2.1、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD-18T vector、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、NheⅠ和SacⅡ購(gòu)自TaKaRa公司。FastQuant RT Kit、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQTMSYBR qPCR Mster Mix和Exfect 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自諾唯贊生物科技(南京)有限公司。Melanin購(gòu)自Sigma公司。Phosphate Buffered Saline購(gòu)自HyClone公司。胎牛血清、DMEM和M254培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1MITF不同可變剪接體CDS區(qū)擴(kuò)增 從家兔皮膚、脾臟和黑色素細(xì)胞中提取總RNA，以混合樣為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。根據(jù)NCBI上預(yù)測(cè)的兔MITF基因可變剪接體mRNA序列，使用primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見表1。50 μL的反應(yīng)體系為10 μL Buffer、18 μL滅菌水、1 μL cDNA、上游和下游引物各 2 μL、1 μL DNA 聚合酶，完全混勻后按照程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定后，選取陽(yáng)性質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)(南京)有限公司測(cè)序。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.2 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，Bootstrap分析重復(fù)數(shù)為 1 000。通過PSORT Ⅱ Prediction軟件( https://psort.hgc.jp/form2.html) 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。

1.2.3 pEGFP-N1-MITF 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將pEGFP-N1質(zhì)粒與構(gòu)建好的pMD19-T- MITF X1、X2、X5和X6質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Hind Ⅲ和SacⅡ雙酶切；pEGFP-N1質(zhì)粒與pMD19-T-MITF X3、X4質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Nhe1和SacⅡ雙酶切。酶切體系：限制性內(nèi)切酶各1 μL，10×Quick Cut Buffer 5 μL，DNA 12 μL，滅菌水31 μL。酶切程序?yàn)?7 ℃、15 min。通過電泳鑒定成功后，純化回收酶切后的目的條帶。將pEGFP-N1和MITFCDS雙酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行連接。反應(yīng)體系：MITFCDS產(chǎn)物加入4 μL，pEGFP-N1產(chǎn)物加入1 μL，SolutionⅠ加入5 μL。置于200 μL PCR管中混合均勻。反應(yīng)程序：16 ℃、30 min。制備pEGFP-MITF無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA并進(jìn)行純化。將MITF不同可變剪接體重組質(zhì)粒通過Exfect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入黑色素細(xì)胞中，置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后收取細(xì)胞。

表2 熒光定量引物Table 2 List of primer used in qRT-PCR

1.2.5 黑色素細(xì)胞含量測(cè)定 收集轉(zhuǎn)染24 h后的永生化黑色素細(xì)胞，加入1 mL 1 mol/L的NaOH溶解細(xì)胞，將全部溶液移入無(wú)菌的1.5 mL 離心管中，置于金屬浴中，80 ℃、1 h。使用酶標(biāo)儀在500 nm和650 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光值測(cè)定。波長(zhǎng)在500 nm處測(cè)得黑色素細(xì)胞中的總黑色素含量，在650 nm波長(zhǎng)處測(cè)得黑色素細(xì)胞中的真黑色素的含量。使用黑色素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。每組樣品重復(fù)3次，根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線最終算出細(xì)胞中的黑色素含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，并以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。試驗(yàn)組和對(duì)照組兩組數(shù)據(jù)之間進(jìn)行成對(duì)二樣本t檢驗(yàn)分析，P< 0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MITF不同可變剪接體基因結(jié)構(gòu)比較分析

根據(jù)NCBI預(yù)測(cè)的MITF可變剪接體序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)擴(kuò)增共發(fā)現(xiàn)MITF基因的6種可變剪接體，分別命名為MITF X1、MITF X2、MITF X3、MITF X4、MITF X5和MITF X6。由圖1可以看出，6種MITF剪接體主要存在4個(gè)可變剪接位點(diǎn)，分別在第1外顯子(1～40 bp)處、第2外顯子(56 bp)處、第2外顯子(221 bp)和第7外顯子(882～899 bp)處。MITFmRNA前體在開始形成mRNA成熟體的過程中，第1～10外顯子正常剪接，形成MITF X1。MITF X2在第7外顯子處，缺失18 bp，發(fā)生外顯子遺漏；MITF X3與MITF X1相比，在第1外顯子5′端處(40 bp)存在1個(gè)65 bp高變區(qū)，發(fā)生可變5′端剪接；MITF X4與MITF X1相比，在第1外顯子5′端處(40 bp)存在1個(gè)65 bp高變區(qū)，發(fā)生可變5′端剪接，在第7外顯子(882～899 bp)處存在18 bp的缺失區(qū)，發(fā)生外顯子遺漏；MITF X5與MITF X1相比，缺失第1外顯子，第2外顯子5′端處缺失56 bp，發(fā)生外顯子遺漏；MITF X6與MITF X1相比，缺第1外顯子，第2外顯子5′端處(221bp)存在1個(gè)29 bp高變區(qū)。

白色框表示缺失堿基，灰色框代表不同堿基，黑色框表示相同堿基

2.2 MITF系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將兔MITF基因與人、豬、羊、猩猩、羊駝、馬、犬、貓和雞的MITF基因序列輸入到MEGA 6.0軟件中，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。由圖2可知，構(gòu)建的進(jìn)化樹大體分成兩支，家禽雞作為獨(dú)立一支，剩余的10個(gè)物種構(gòu)成另一個(gè)獨(dú)立分支，家兔MITFX1～X6剪接體在其中的一個(gè)分支上，與人和猩猩的分子進(jìn)化距離最近，表明親緣關(guān)系最 接近。

圖2 不同物種 MITF基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed for MITF genes of different species

2.3 MITF不同可變剪接體的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

利用PSORT Ⅱ在線軟件對(duì)MITF蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示， MITF X1和MITF X2蛋白69.6%位于細(xì)胞核，13.0%位于細(xì)胞質(zhì)，8.7%位于線粒體； MITF X3和MITF X4蛋白69.6%位于細(xì)胞核，13.0%位于線粒體，8.7%位于細(xì)胞質(zhì)；MITF X5蛋白56.5%位于細(xì)胞核，21.7%位于細(xì)胞質(zhì)，17.4%位于線粒體； MITF X6蛋白65.2%位于細(xì)胞核，17.4%位于細(xì)胞質(zhì)，8.7%位于線粒體。MITF X1和 MITF X2蛋白亞細(xì)胞定位一致，主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，MITF X3和MITF X4蛋白亞細(xì)胞定位一致，主要定位在細(xì)胞核和線粒體， MITF X5和MITF X6蛋白主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。

將構(gòu)建的MITFX1～X6的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染永生化黑色素細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察 (圖3)，顯示基本與預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，主要表達(dá)在細(xì)胞核。

2.4 pEGFP-N1-MITF各可變剪接體真核表達(dá)載體構(gòu)建

將擴(kuò)增的MITF基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，并連接到pEGFP-N1表達(dá)載體，重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化，X1、X2、X5、X6提取后經(jīng)HindⅢ和SacⅡ雙酶切，X3、X4提取后經(jīng)NheⅠ和SacⅡ雙酶切，根據(jù)電泳鑒定得到pEGFP-N1載體片段和MITFCDS目的片段，片段大小一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖4)。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)下游基因mRNA表達(dá)量

利用熒光定量PCR檢測(cè)MITF不同可變剪接體對(duì)TYR、GPNMB、PMEL-17表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示MITF X1～X3對(duì)TYR、GPNMB均有顯著增加(P<0.05)，MITF X4顯著增加GPNMB表達(dá)量(P<0.05)，MITF X2顯著增加PMEL-17表達(dá)量(P<0.05)，其他MITF剪接體形式的過表達(dá)對(duì)下游基因影響不顯著(P>0.05)(圖5)。說明MITF不同剪接體形式對(duì)黑色素沉積信號(hào)通路下游基因的作用不同。

2.6 酶標(biāo)儀檢測(cè)黑色素含量變化

收集轉(zhuǎn)染后的黑色素細(xì)胞，堿裂解處理細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀測(cè)定黑色素細(xì)胞中總黑色素、真黑色素和褐黑色素的含量。黑色素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，MITF X1～X6剪接體顯著增加黑色素細(xì)胞中總黑色素和真黑色素含量(P<0.05)，均可影響黑色素細(xì)胞黑色素沉積(圖6)。

A.pEGFP-N1- MITF X1;B.pEGFP-N1- MITF X2;C.pEGFP-N1- MITF X3;D.pEGFP-N1- MITF X4; E.pEGFP-N1- MITF X5; F.pEGFP-N1- MITF X6;G.pEGFP-N1;1.熒光；2.明場(chǎng)

圖4 pEGFP-N1-MITF各剪接體雙酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Double restriction enzyme digestion of products of plasmids of different pEGFP-N1-MITF splicing

3 討論與結(jié)論

哺乳動(dòng)物毛色與黑色素密切相關(guān)，黑色素的產(chǎn)生和成熟是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程，受許多基因的影響，其中MITF基因?qū)谒丶?xì)胞作用和黑素合成具有重要調(diào)控作用[15-16]。目前，在人、小鼠、綿羊、羊駝、大鼠、倉(cāng)鼠、雞、鵪鶉和斑馬魚等動(dòng)物已成功克隆出MITF基因，這些序列同源性較高，特別是MITF的bHLHZip結(jié)構(gòu)區(qū)、2個(gè)活化區(qū)和MAPK靶序列(MITF的作用位點(diǎn))[17]。在本研究中，成功克隆兔MITF基因的6個(gè)可變剪接體，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，兔MITF基因與馬、綿羊和犬等哺乳動(dòng)物的進(jìn)化距離較近，其次與人、猩猩相近，與非哺乳動(dòng)物雞的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。說明MITF基因在生物進(jìn)化上具有保守性，同時(shí)也體現(xiàn)MITF基因在生物體上具有的重要的功能性和在不同物種的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。目前關(guān)于家兔MITF基因不同可變剪接體的研究較少，調(diào)控黑色素細(xì)胞以及黑色素的合成是何種可變剪接體在發(fā)揮作用仍不清楚。

A.TYR基因；B.GPNMB基因；C. PMEL-17基因；**表示P<0.01，差異極顯著；*表示P<0.05，差異顯著

**表示P<0.01，差異極顯著；*表示P<0.05，差異顯著

基于此，本試驗(yàn)根據(jù)NCBI預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)與已有文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)MITF編碼區(qū)特異性引物，采用RT-PCR結(jié)合TA克隆測(cè)序的方法，鑒定兔MITF基因的6種可變剪接體，分別命名為MITF X1、MITF X2、MITF X3、MITF X4、MITF X5和MITF X6(GenBank登錄號(hào)：MK801776、MK825547、MK85548、MK825549、MK825550 和MK825551)。利用軟件對(duì)MITF不同可變剪接體翻譯的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)不同可變剪接體的蛋白都主要位于細(xì)胞核，少量位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體，其中MITF X5蛋白位于細(xì)胞核的比例最小。通過構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到黑色素細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)MITF主要在細(xì)胞核中表達(dá)，與預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，這也與MITF轉(zhuǎn)錄因子的特性相符，主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

為了進(jìn)一步探究不同可變剪接體對(duì)黑色素沉積的作用，構(gòu)建不同可變剪接體的過表達(dá)載體。已知MITF參與色素沉著過程是直接作用于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，如MITF基因可激活酪氨酸酶基因家族(TYR、TYRP1和TYRP2)，通過與它們的啟動(dòng)子相結(jié)合來調(diào)控它們?cè)诤谏丶?xì)胞中特異性表達(dá)，同時(shí)能參與外界刺激對(duì)黑色素細(xì)胞中黑素生成的調(diào)控，進(jìn)而來參與黑色素生成的調(diào)控[18-19]。因此，本研究利用熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MITF X1～X3過表達(dá)顯著增加TYR、GPNMB的mRNA表達(dá)量，其他MITF剪接體的過表達(dá)對(duì)下游基因影響不顯著，提示不同剪接形式對(duì)黑色素沉積信號(hào)通路下路基因的作用并不相同；同時(shí)黑色素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，MITF X1～X6剪接體顯著增加了黑色素細(xì)胞中總黑色素和真黑色素含量，表明MITFN端的剪接變化并不影響黑色素沉積功能。

綜合而言，MITFN端的剪接變化并不影響黑色素沉積功能，但不同剪接體的下游信號(hào)通路存在差異。該結(jié)果有助于清晰兔MITF不同可變剪切體對(duì)黑色素沉積的影響，為我們更科學(xué)、更精準(zhǔn)地進(jìn)行獺兔的毛色選育提供了理論依據(jù)。