王孟珂,張楊凡,車慶輝,王仁梓,關(guān)長飛,楊 勇
(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院,陜西楊凌 712100)
柿,屬于柿樹科木本植物[1-3],全世界柿屬植物約有250種,有2500年以上的栽培歷史[4-5],主要分布于熱帶和亞熱帶,其中作為主產(chǎn)區(qū)栽培最多的尤以中國、日本和韓國[6-8]。近年來,以中國長江為界,年產(chǎn)量排名前10的省份南北各占50%。柿起源于中國,為中國特色傳統(tǒng)果種,種質(zhì)資源十分豐富[9],由于近些年受一些真菌病害侵染,柿產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響。其中炭疽病是危害柿樹的一種重要真菌病害,易造成枝葉枯死,果實(shí)腐爛變軟,甚至導(dǎo)致整株死亡,嚴(yán)重威脅柿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10-13]。炭疽菌是侵染多種作物的一類重要的植物病原真菌[14],且侵染范圍廣,可侵染草莓、葡萄、西瓜、辣椒、茶樹等[15-19]重要經(jīng)濟(jì)作物,從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
柿炭疽病一般從5月底開始出現(xiàn),6月至7月上旬發(fā)病最為嚴(yán)重,然后一直持續(xù)到11月中旬的落果期[20]。柿炭疽病在中國主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,且不同柿樹品種之間感病程度也有差異,其中陜西的‘富平尖柿’、廣西的‘恭城月神柿’以及從日本引進(jìn)的‘次郎甜柿’等[21-23]發(fā)病嚴(yán)重,而廣州的‘雞心黃’和‘陽豐’甜柿發(fā)病較少。常見柿炭疽病在枝條、葉片與果實(shí)上均有發(fā)生,其中葉脈及當(dāng)年生枝條更易侵染。目前的研究主要集中在炭疽病的發(fā)生、病原菌的分離以及綜合防治[24-26]等初步研究,然而,柿種質(zhì)資源炭疽病抗性鑒定及發(fā)病規(guī)律缺少系統(tǒng)研究。
本研究將針對(duì)國家柿種質(zhì)資源圃內(nèi)部分資源進(jìn)行調(diào)查分類,總結(jié)炭疽病在柿各部位的發(fā)病規(guī)律,通過接種試驗(yàn),篩選出抗病品種以及感病品種,并進(jìn)行病原菌鑒定,為柿炭疽病的防治和分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
試驗(yàn)以西北農(nóng)林科技大學(xué)國家柿種質(zhì)資源圃的柿資源為材料,通過連續(xù)2 a的病斑觀察,總結(jié)炭疽病發(fā)病規(guī)律。炭疽病侵染選用當(dāng)年生枝條作為試驗(yàn)材料,田間侵染從5月底至9月中旬。
1.2.1 田間抗性種質(zhì)調(diào)查 試驗(yàn)于2017-2018年在國家柿種質(zhì)資源圃內(nèi)進(jìn)行,隨機(jī)挑選資源圃內(nèi)保存的約81份資源進(jìn)行炭疽病抗性調(diào)查以及圃內(nèi)約837份資源的病株和病果的田間調(diào)查,觀察炭疽病發(fā)病性狀并總結(jié)發(fā)病規(guī)律。
1.2.2 炭疽病病原菌的分離與鑒定 病原菌的分離采用組織分離法并純化病原菌,組織選用病健交界處。
PDA培養(yǎng)基的制備:200 g土豆去皮切碎,加1 L蒸餾水加熱煮沸,沸騰30 min,用紗布過濾,再次加入蒸餾水補(bǔ)足至1 L,然后加入20.0 g葡萄糖和20.0 g瓊脂,玻璃棒攪拌均勻,加熱至全部融化,最后趁熱用紗布過濾,分裝到三角瓶和培養(yǎng)皿中后滅菌。具體方法參考方中達(dá)[27]、楊佳文等[28]方法略作如下修改:①對(duì)采取的帶病樣本進(jìn)行表面的沖洗,流水下沖洗2~3 min;②將大塊組織切割成1~3 cm大小的長度,70%酒精消毒5~10 s左右;③在超凈工作臺(tái)中用無菌解剖刀切成5 mm×5 mm的小組織塊,再次用70%酒精浸泡30 s,進(jìn)行消毒處理;④用4%次氯酸鈉浸泡5~10 min;⑤最后用無菌水沖洗多次,用滅菌的過濾紙吸干水分,接種在PDA培養(yǎng)基,25 ℃倒置培養(yǎng)。
病原菌的鑒定[29-31]:將分離的病原菌提取DNA,然后用ITS和GAPDH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測序,引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成(表1)。25 μL PCR反應(yīng)體系:2×Reaction Mix 12.5 μL、Golden DNA Polymerase 0.2 μL、模板DNA 1 μL、10 μmol/L上下游引物各 1 μL、ddH2O 9.3 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s(各引物退火溫度見表1),72 ℃延伸1 min,共38個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后,送往奧科(北京)科技有限公司測序。
表1 引物序列及其退火溫度Table 1 Primer sequence and annealing temperature
1.2.3 田間炭疽病原菌接種 田間采集帶分生孢子的枝條,用無菌水刮洗配制成孢子懸浮液,血球計(jì)數(shù)板觀察,調(diào)節(jié)最終孢子液濃度至1×106個(gè)孢子/mL,田間接種柿新發(fā)枝條,每個(gè)處理3~5個(gè)枝條,接種后進(jìn)行套袋保濕,分別于0 d、1 d、 3 d、5 d、7 d、10 d、15 d進(jìn)行采樣,帶回實(shí)驗(yàn)室拍照,液氮速凍置于-80 ℃冰箱保存,備用。柿果選用感病品種‘富平尖柿’進(jìn)行接種,套袋保濕觀察其癥狀變化并進(jìn)行拍照。
1.2.4 室內(nèi)炭疽病原菌嫩梢接種 田間采集當(dāng)年生嫩梢,于室內(nèi)分別做好標(biāo)記,1×106個(gè) 孢子/mL的濃度進(jìn)行侵染,每個(gè)處理3~5個(gè)枝條,并給予合適的溫濕度,于接種后3 d、4 d、5 d、6 d、 7 d觀察其癥狀變化。
1.3.1 種質(zhì)資源抗性鑒定 統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)按病枝或病果總數(shù)占全樹的百分比計(jì)算,將植株的抗病性分為5級(jí),分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:高抗(HR),發(fā)病率在20%以下;中抗(MR),發(fā)病率在20%~49%;感病(S),發(fā)病率在50%~74%;中感(MS),發(fā)病率在75%~89%;高感(HS),發(fā)病率在90%以上。
1.3.2 病株資源分類 按帶病斑枝條數(shù)占全樹比例進(jìn)行分級(jí),從而篩選出主要的抗病和感病資源。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:無(0級(jí)),5 a內(nèi)各級(jí)枝條均未發(fā)現(xiàn)病斑;輕(1級(jí)),帶病斑枝條數(shù)占全樹比例為30% 以下;中(2級(jí)),帶病斑枝條數(shù)占全樹比例為30%~60%;重(3級(jí)),帶病斑枝條數(shù)占全樹比例為60%以上。
1.3.3 病果資源分類 按帶病斑果實(shí)數(shù)占全樹比例進(jìn)行分級(jí),對(duì)抗病和感病資源進(jìn)行補(bǔ)充。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:無(0級(jí)),5 a內(nèi)所保留果實(shí)均未發(fā)現(xiàn)病斑;輕(1級(jí)),帶病斑果實(shí)數(shù)占全樹比例為30%以下;中(2級(jí)),帶病斑果實(shí)數(shù)占全樹比例為30%~60%;重(3級(jí)),帶病斑果實(shí)數(shù)占全樹比例為60%以上。
利用Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算處理,Photoshop CS6軟件對(duì)圖片進(jìn)行美化處理,MegAlign工具構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹等。
2.1.1 國內(nèi)常見品種炭疽病抗性調(diào)查 在陜西主要發(fā)病區(qū),于2017年4月到2018年10月連續(xù)從資源圃內(nèi)隨機(jī)挑選81種柿種質(zhì)進(jìn)行田間感病調(diào)查(表2)。參考分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同抗性種質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)劃分,結(jié)果顯示中抗品種所占比例較大,如完全甜柿(PCNA)‘上西早生’(日本)和‘羅田甜柿’(中國)等,而高抗品種比例較少,常見甜柿品種‘陽豐’‘禪寺丸’等和完全澀柿(PCA)。
表2 國內(nèi)常見品種炭疽病抗性調(diào)查Table 2 Survey of resistance of common anthracnose in China
2.1.2 病株及病果的總調(diào)查 于4月中下旬至11月下旬,通過對(duì)國家柿種質(zhì)資源圃內(nèi)約837份資源在成熟期和落葉期進(jìn)行表型觀察,記錄病株數(shù)和病果數(shù)。發(fā)現(xiàn)病株和病果感病程度中,中級(jí)(2)和重級(jí)(3)所占比例相似,5 a內(nèi)各級(jí)未出現(xiàn)病斑的枝條數(shù)量居多。在4月份的展葉期,對(duì)資源圃內(nèi)柿樹各級(jí)枝條進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查。在11月下旬的落葉期,進(jìn)一步進(jìn)行果實(shí)病斑的調(diào)查,對(duì)抗病和感病資源的篩選進(jìn)行補(bǔ)充(表3、表4)。
2.1.3 炭疽病發(fā)病性狀及規(guī)律 炭疽病菌主要侵害柿樹當(dāng)年生嫩梢、柿葉、柿蒂以及柿果,炭疽病原菌主要以菌絲在枝條病斑內(nèi)越冬,也可在病果、葉痕和冬芽中過冬。2 a生枝帶病菌率最多,隨枝齡的增加病菌活性逐漸降低。翌年初夏,生出分生孢子,隨風(fēng)傳播,借雨露萌發(fā)入侵。此病菌喜高溫高濕,濕度大時(shí),很容易產(chǎn)生分生孢子團(tuán),這些孢子是引起再侵染的主要病源。
侵害枝梢:病原菌入侵嫩枝后,首先出現(xiàn)小黑點(diǎn),隨后病斑逐漸擴(kuò)大呈梭形,進(jìn)而繼續(xù)擴(kuò)大凹陷,并且隨著樹齡的增加,木質(zhì)化程度加深,病斑凹陷處逐漸變大變黑,嚴(yán)重時(shí)會(huì)使其斷裂。且多年生枝干上的病斑會(huì)隨著樹齡的增加,病斑凹陷逐漸擴(kuò)大加重,出現(xiàn)裂皮(圖1)。
侵害柿葉:葉片發(fā)病主要危害葉柄以及葉脈,病斑多發(fā)生在近芽口處的葉柄上以及葉背的葉脈上,葉脈發(fā)病處以中脈居多。病原菌侵染后,病斑會(huì)沿著葉柄處向葉脈延伸,并造成葉片感染,葉片染病處呈黑褐色焦枯狀,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致枯萎落葉??諝鉂穸却髸r(shí)會(huì)在病斑處產(chǎn)生粉紅色的分生孢子(圖2)。
侵害柿蒂:染病初期,柿蒂尖會(huì)先出現(xiàn)黑色小斑點(diǎn),進(jìn)而病斑逐漸擴(kuò)大,并向柿蒂中心擴(kuò)散,嚴(yán)重時(shí)造成柿蒂皺縮變黑,繼而引起柿蒂和柿果的分離,造成軟果脫落(圖3)。
侵害柿果:感染初期,果實(shí)表面出現(xiàn)針點(diǎn)狀病斑,隨著時(shí)間的延長,病斑呈橢圓形向周圍延伸,并伴隨病斑處凹陷,而且雨水和露水形成的病斑不同。雨露形成病斑的區(qū)別:雨水原因形成的病斑是整片的區(qū)域凹陷變黑變軟,露水原因形成的病斑呈水漬般,染病區(qū)域凹陷變黑變軟。在空氣比較潮濕時(shí),病斑中心處會(huì)涌現(xiàn)大量的粉紅色孢子(圖4)。
采用組織分離法進(jìn)行炭疽病病原菌的分離,觀察培養(yǎng)皿內(nèi)菌落的生長狀況,起初從組織的病健交界處長出絮狀絨毛,后來呈同心圓慢慢擴(kuò)散,背面灰色或灰褐色,經(jīng)ITS初步鑒定為炭疽病原菌(圖5)。通過NCBI Blast同源對(duì)比,其中有高粱(Q9ZU06.1)、草莓(AAP40268.1)、蒲桃(EQB49331.1)、咖啡果(FJ972602)、芒果(ALP31535.1)、鱷梨(AND76909.1)。
表3 資源圃內(nèi)病株總調(diào)查Table 3 Survey of diseased plants in resources nursery
表4 資源圃內(nèi)病果總調(diào)查Table 4 Survey of disease fruit in resources nursery
結(jié)果顯示,此病原菌分離物與炭疽菌同源性高達(dá)95%以上。采用MegAlign工具進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,結(jié)果顯示,此病原菌分離物與與浙江無核柿(AY787483,AY791890)和次郎甜柿(JQ957543)處在進(jìn)化樹的同一分支上(圖6)。
A.當(dāng)年生嫩梢; B.多年生枝干
A.葉柄處; B.葉脈處; C.葉片侵染初期; D.葉片侵染后期
病原菌接種柿枝葉:從篩選出來的感病和抗病資源中選擇感病品種‘富平尖柿’和抗病品種‘雞心黃’,對(duì)這兩種供試材料進(jìn)行田間炭疽病接種試驗(yàn),套袋保濕,每個(gè)處理3~5個(gè)嫩梢,分別于始日、第1天、第3天、第5天、第7天和第10天采樣,發(fā)現(xiàn)感病品種‘富平尖柿’第3天開始出現(xiàn)病斑,隨著時(shí)間的推移,病斑逐漸擴(kuò)大,葉片逐漸減少,在第10天時(shí),枝梢的葉片掉落嚴(yán)重,并伴隨枯萎的跡象。而抗病尖柿‘雞心黃’在第5天時(shí)才開始出現(xiàn)病斑,且病斑擴(kuò)散速度較慢,落葉情況不明顯(圖7)。
A.柿蒂侵染初期; B.柿蒂侵染后期
A.柿果侵染初期; B.柿果侵染后期
A.正面菌落形態(tài); B.反面菌落形態(tài); C.分生孢子
圖6 炭疽病原菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of ITS gene sequence of anthrax pathogen
病原菌接種柿果實(shí):田間選用感病品種‘富平尖柿’進(jìn)行果實(shí)的表面病原菌接種,在黑色記號(hào)筆標(biāo)記處接種配制好的炭疽病原菌孢子液,然后套袋保濕,隨著時(shí)間的延長,先出現(xiàn)黑褐色小斑點(diǎn),隨后病斑逐漸擴(kuò)大,最終導(dǎo)致非正常落果(圖8)。
室內(nèi)接種經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在選用的供試材料中,用記號(hào)筆做好標(biāo)記,在標(biāo)記處進(jìn)行孢子液的侵染,分別于接種后3 d、4 d、5 d、6 d和7 d觀察,發(fā)現(xiàn)感病品種‘富平尖柿’接種后隨著時(shí)間的增加,病斑逐漸擴(kuò)大凹陷,并開始產(chǎn)生粉紅色的分生孢子。而抗病尖柿‘雞心黃’在接種后,隨著時(shí)間的推移,標(biāo)記處表型并無太大變化(圖9)。
A.富平尖柿; B.雞心黃
A.果實(shí)接種前期; B.果實(shí)接種后期
A.富平尖柿; B.雞心黃
柿炭疽病是陜西等主產(chǎn)區(qū)的一種重要真菌病害,柿子作為中國主栽品種,近年來各地種植面積也逐年增多,而炭疽病的爆發(fā)則大大影響柿產(chǎn)量,危害柿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 本研究對(duì)國家柿種質(zhì)資源圃保存的現(xiàn)有資源隨機(jī)進(jìn)行抽樣調(diào)查,并按照柿果實(shí)脫澀與種子形成的關(guān)系[32],分成完全甜柿(PCNA)、不完全甜柿(PVNA)、完全澀柿(PCA)、不完全澀柿(PVA),根據(jù)侵染病原菌后的表型,把他們分成5個(gè)等級(jí):高抗(HR)、中抗(MR)、感病(S)、中感(MS)和高感(HS)。同時(shí)基于2017-2019的田間調(diào)查,對(duì)柿資源病株及病果按感病程度分4個(gè)級(jí)別:無、輕、中、重,初步篩選出關(guān)于柿炭疽病的抗性品種和感性品種。并通過田間炭疽病調(diào)查總結(jié)出炭疽病發(fā)病規(guī)律:炭疽病原菌主要侵害柿樹當(dāng)年生嫩梢、柿葉、柿蒂以及柿果,通過菌絲體和分生孢子在發(fā)病部位上越冬,其中2 a生枝帶病菌率最多,隨枝齡的增加病菌活性逐漸降低。炭疽病原菌喜高溫高濕,進(jìn)入春季后,溫度逐漸升高,分生孢子等通過風(fēng)雨或昆蟲媒介進(jìn)行傳播,從組織的傷口或表層侵入,濕度大時(shí),更容易產(chǎn)生分生孢子團(tuán),這些孢子是引起再侵染的主要病源。本試驗(yàn)對(duì)篩選出的抗性品種‘雞心黃’和感病品種‘富平尖柿’分別進(jìn)行枝葉噴灑和嫩梢涂刷,接種炭疽病原菌。結(jié)果表明,‘雞心黃’發(fā)病率極低,對(duì)炭疽病病原菌有較好的抗性;‘富平尖柿’普遍感染炭疽病,對(duì)發(fā)病植株觀察發(fā)現(xiàn),病原菌主要從嫩梢表皮和半木質(zhì)化枝的皮孔入侵,而完全木質(zhì)化的枝條卻很難感病。炭疽病原菌隨風(fēng)傳播,借雨露萌發(fā)入侵,并可進(jìn)行多次侵染。病原菌侵染結(jié)果顯示,5月底至7月上旬發(fā)病率最高,8月中旬至9月中旬次之。7月中旬到8月上旬侵染率最低,推測高溫可能抑制其病原菌的生長。綜上,本試驗(yàn)在致病性研究中,從分子角度對(duì)炭疽病原菌進(jìn)行病原菌的分離,通過形態(tài)學(xué)鑒定并結(jié)合柯赫式法則進(jìn)行ITS序列分析,證明柿炭疽病為炭疽病菌。試驗(yàn)對(duì)柿種質(zhì)資源圃進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查分類,總結(jié)柿炭疽病發(fā)病規(guī)律,并分析不同品種的感病機(jī)理,為柿炭疽病防治及抗病機(jī)理研究提供依據(jù)。