王鐵兵,王 鵬,蔣建軍,王 芳
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)
玉米(Zeamays)是具有糧、經(jīng)、果、飼、能等多種用途的重要農(nóng)作物之一,就種植面積而言已經(jīng)是中國(guó)第一大作物,其總產(chǎn)的增加對(duì)全國(guó)糧食增產(chǎn)貢獻(xiàn)率位居各大糧食作物之首,可見(jiàn)其增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)關(guān)系到國(guó)計(jì)民生。但隨著氣候變暖、耕作制度改變和單一品種大面積種植,病蟲(chóng)害發(fā)生流行嚴(yán)重影響了玉米的穩(wěn)產(chǎn)[1]。
瘤黑粉病(Ustilagomaydis)是玉米大田生產(chǎn)的病害之一,世界上100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生,它是一種由真菌引起的侵害幼嫩組織的局部性病害,發(fā)病極為普遍[2]。有研究表明,在18世紀(jì)時(shí)人們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致植物發(fā)病的直接原因?yàn)榛铙w真菌玉米黑粉菌[3]。被黑粉菌侵染的玉米組織受其代謝產(chǎn)物刺激而產(chǎn)生大小不一、形狀各異的菌瘤,初生菌瘤多為白色或者淡黃色并由表皮組織形成的薄膜所包被,后期所形成的黑粉瘤消耗大量的養(yǎng)分,導(dǎo)致植株空稈不結(jié)實(shí),造成嚴(yán)重減產(chǎn)[4-5]。在美國(guó),瘤黑粉病導(dǎo)致玉米每年減產(chǎn)1%至5%,并且流行年份不低于10%;在德國(guó),田間自然發(fā)病率1%至3%,1976年發(fā)病率甚至超過(guò)了50%,使玉米產(chǎn)量損失嚴(yán)重[6-7]。在中國(guó),由于推廣的玉米品種中缺少抗瘤黑粉病的品種,加上連年連作,秸稈還田,土壤中黑粉菌的厚垣孢子大量積累,致使玉米瘤黑粉病在東北、華北和黃準(zhǔn)海等玉米主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[8]。2000年中國(guó)內(nèi)蒙古曾經(jīng)發(fā)生過(guò)該病害,當(dāng)時(shí)田間發(fā)病率約20%,部分地塊甚至絕收;2012年在東北和華北等玉米主產(chǎn)區(qū),大約有7.2×105hm2玉米感染瘤黑粉病[3,9]。玉米被黑粉菌侵染發(fā)病后,一般沒(méi)有有效的挽救措施,而積極培育和不斷挖掘開(kāi)創(chuàng)抗病品種才是重中之重。種植抗病品種是防治該病害最經(jīng)濟(jì)最有效的途徑,據(jù)報(bào)道,國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)瘤黑粉病進(jìn)行了研究與分析,楊克澤等[10]利用藥劑對(duì)種子進(jìn)行包衣防瘤黑粉病處理,發(fā)現(xiàn)28%滅菌唑和24%噻呋酰胺具有良好的防治效果;姜曉穎等[11]對(duì)中國(guó)東北地區(qū)21個(gè)主要玉米自交系進(jìn)行瘤黑粉病抗性評(píng)價(jià),發(fā)掘出‘沈139’等9個(gè)高抗自交系;嚴(yán)理等[12]對(duì)不同用途的22個(gè)玉米品種進(jìn)行瘤黑粉病抗性鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)糯玉米全為抗性,其次是飼用玉米抗性較好,甜玉米抗性最弱;白金鎧等[13]研究發(fā)現(xiàn)抗瘤黑粉病的自交系較多,雜交種中則較少;Lubberstedt等[14]采用RFLP標(biāo)記法對(duì)玉米進(jìn)行瘤黑粉病進(jìn)行QTLs分析,檢測(cè)到5~10個(gè)QTLs;Ding等[15]利用‘綜3’和‘87-1’構(gòu)建的重組自交系發(fā)現(xiàn),抗瘤黑粉病基因與環(huán)境互作效應(yīng)明顯。目前,雖然篩選出了一些抗病的種質(zhì)資源,但是這些種質(zhì)資源的遺傳背景尚未得到進(jìn)一步分析。SSR具有豐富的多態(tài)性、良好的穩(wěn)定性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于玉米、水稻、小麥等農(nóng)作物的種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析,遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究[16]。因此,本研究對(duì)30份玉米種質(zhì)資源進(jìn)行瘤黑粉病的抗性鑒定,并對(duì)其遺傳背景進(jìn)行SSR分析,以期篩選出抗瘤黑粉病的育種材料,為玉米抗瘤黑粉病基因發(fā)掘與種質(zhì)改良工作提供基礎(chǔ)。
‘KYS旱17-9’‘C0343’和‘KYN01’等32份玉米自交系為材料,均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)平?jīng)鲇衩子N站自選提供(表1)。
表1 供試玉米自交系名稱Table 1 Maize inbred lines
試驗(yàn)于2018年在甘肅省定西市安定區(qū)鳳翔鎮(zhèn)進(jìn)行(E 104°62′,N 35°58′),該地區(qū)光能豐富,雨熱同季(主要集中在6、7、8月),無(wú)霜期 140 d左右,年平均日照時(shí)數(shù)2 500 h,2018年降雨量479 mm,其中6、7月份的降雨量197.9 mm;2019年降雨量(1-11月)477 mm,其中6、7月份的降雨量183.4 mm。前茬為馬鈴薯。
試驗(yàn)小區(qū)采取隨機(jī)分布,每份材料種植2行,每行留苗25株,重復(fù)3次,對(duì)照為‘齊319’(高抗)和‘掖478’(高感),2019年重復(fù)鑒定。
引物來(lái)源于Maize GDB網(wǎng)站(http://www.maizegdb.org)公布的SSR引物信息情況,選擇分布在玉米10條染色上不同bin的69對(duì)SSR標(biāo)記,由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。
表2 SSR引物名稱與序列Table 2 Name and SSR sequence
(續(xù)表2 Continued table 2)
秋季從病株上以圖1-B為標(biāo)準(zhǔn)采集瘤黑粉病菌,陰晾風(fēng)干后放于紙盒內(nèi)保存。采用張春民等[17]的注射法接種,使用時(shí)將冬孢子充分碾碎,過(guò)40目篩后收集均一菌粉,每25 g菌粉加水1 L,充分?jǐn)嚢韬?00目篩網(wǎng)過(guò)濾,并對(duì)濾液加水補(bǔ)足至1 L,備用(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
接種時(shí)期在玉米植株6葉1心期,用注射器吸取制備好的菌液注射到玉米植株的中下部,每株注入菌液1 mL,見(jiàn)心葉冒液即可,對(duì)照組在相同部位注射等量的蒸餾水。
1.5.1 調(diào)查內(nèi)容與抗性等級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 接種第10天和第20天進(jìn)行田間發(fā)病情況調(diào)查。調(diào)查項(xiàng)目包括:每系總株數(shù)、發(fā)病株數(shù)、發(fā)病率(以第20天的調(diào)查發(fā)病率結(jié)果進(jìn)行抗性等級(jí)評(píng)價(jià))。玉米瘤黑粉病抗性鑒定依據(jù)《玉米抗病蟲(chóng)性鑒定技術(shù)規(guī)范》(國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行評(píng)價(jià)[18],其具體劃分為1-9級(jí):1級(jí)為高抗(HR),病株率為0~ 1.0%;3級(jí)為抗病(R),病株率為1.1%~ 10.0%;5級(jí)為中抗(MR),病株率為10.1%~ 20.0%;7級(jí)為感(S),病株率為20.1%~40.0%;9級(jí)為高感(HS),病株率為40.1%~100%。
1.5.2 DNA的提取與PCR擴(kuò)增 在玉米3葉1心時(shí)取玉米葉片貯藏在-80 ℃冰箱中備用,采用CTAB法提取DNA[19];SSR分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系為:(1)2×TaqPCR Master Mix 5 μL;(2)上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL;(3)模板DNA(50 ng/μL)2 μL;(4)滅菌超純水2 μL,總體積為10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)95 ℃預(yù)變性 5 min;(2)94 ℃變性30 s,50~59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸40 s;(3)步驟“(2)”進(jìn)行35個(gè)循環(huán);(4) 72 ℃延伸10 min。用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。
圖1 玉米瘤黑粉典型照片F(xiàn)ig.1 Typical photo of Ustilago maydis
圖2 SSR引物umc1555和nc130凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of SSR primers umc1555 and nc130
由表3可知,對(duì)6葉1心期的玉米幼苗在接種黑粉菌后的第10天,都表現(xiàn)出瘤黑粉病的癥狀。30份材料的發(fā)病率情況不同,發(fā)病率為 3.33%~53.33%, ‘鋒967-2硬長(zhǎng)’的發(fā)病率最低,為3.33%;‘XZX674-2半’發(fā)病率最高,為 53.33%。在接種后的第20天,所有材料都發(fā)病,并進(jìn)入發(fā)病增速期,發(fā)病率為10.00%~ 86.67%,‘鋒967-2硬長(zhǎng)’的發(fā)病率最低,為 10.00%,‘10玉1172-1’發(fā)病率最高,達(dá)86.67%。在接種后的第20天,發(fā)病率≥50%的有13份材料,占供試材料的40.63%,此后發(fā)病率沒(méi)有增長(zhǎng)。
表3 不同玉米材料發(fā)病率情況Table 3 Incidence of different maize varieties
在接種后的第20天,通過(guò)30份玉米種質(zhì)資源對(duì)瘤黑粉的田間抗性鑒定發(fā)現(xiàn),不同玉米種質(zhì)對(duì)玉米瘤黑粉病具有不同程度的抗性(表4),其中‘鋒967-2硬長(zhǎng)’表現(xiàn)為抗瘤黑粉病,占供試 材料的3.33%; ‘XZX5221-1’‘Q6196-6-1-1’‘10ZX-1418張’‘FN296-2’‘FN119-5’和‘10玉39’表現(xiàn)為中抗瘤黑粉病,占20.00%;‘KYN01’‘Q529-1-2長(zhǎng)’‘XFN無(wú)名13-3’‘Q6193-3-14’‘FN95-1馬’‘FN25-2硬’‘Q6193-3-1-2’‘Q416-1-21’和‘10HN17’表現(xiàn)為感瘤黑粉病,占 23.33%;‘KYS旱17-9’‘C0343’‘FN張’‘XZX513’‘10ZX123’‘10H101445’‘10玉1172-1’‘FNA30-1半’‘Q518-22S’‘26193-3-1-2’‘10ZX869-11’‘1048-2硬長(zhǎng)’‘XZX674-2半’和‘10HN1383-11硬’表現(xiàn)為高感瘤黑粉病,占 46.67%。其中,‘鋒967-2硬長(zhǎng)’的抗性最高,‘10玉1172-1’的抗性最弱。
表4 不同品系玉米的發(fā)病株率與抗性等級(jí)Table 4 Incidence and resistance levels of different strains of maize
篩選出具有多態(tài)性且擴(kuò)增條帶良好的69對(duì)SSR引物,對(duì)32份玉米種質(zhì)資源擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表5)。共檢測(cè)到272個(gè)等位基因,等位變異幅度為3~6,平均每個(gè)標(biāo)記3.64個(gè),引物phi109275和umc1555檢測(cè)到的變異最多為6個(gè),引物phi227562、phi046和phi072等檢測(cè)到的變異位點(diǎn)最少為3個(gè)。多態(tài)性信息量為0.435~0.846,平均0.764,其中引物 umc1196最大,為0.846;引物umc1545最小,為0.245。
表5 69對(duì)SSR引物多樣性統(tǒng)計(jì)Table 5 Diversity statistics of 69 SSR markers
由圖3可知,對(duì)30份玉米種質(zhì)資源與‘齊319’和‘掖478’進(jìn)行遺傳聚類分析可知,32份種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.615~1.000。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.643時(shí),將32份玉米種質(zhì)資源分為 4類,第Ⅰ類19份材料,其中包括1份高抗材料‘齊319’,1份抗病材料‘鋒967-2硬長(zhǎng)’‘XZX5221-1’‘Q6196-6-1-1’和‘10ZX-1418張’等6份中抗材料;第Ⅱ類有7份材料,其中有6份感病材料和1份高感病材料‘掖478’;第Ⅲ類和第Ⅳ類各含有3份材料,均為高感材料。
育種材料的抗病性鑒定,對(duì)育種效率的提高和種質(zhì)資源的利用具有重要意義,因此國(guó)內(nèi)外的玉米育種專家十分重視種質(zhì)資源的收集,不斷挖掘新的抗病材料,以滿足玉米抗瘤黑粉病育種的需求,從而為培育出更有針對(duì)性的新品種,防止病害的廣泛流行奠定基礎(chǔ)[21]。本研究采用多年的鑒定方法,所鑒定出的抗性種質(zhì)對(duì)應(yīng)用于育種生產(chǎn)有更高價(jià)值。研究篩選鑒定出7份抗瘤黑粉病的種質(zhì)材料,其中‘鋒967-2硬長(zhǎng)’的抗性最好,達(dá)到抗病水平;鑒定得到的7份抗性材料可為抗病基因定位、克隆等更進(jìn)一步的研究提供基礎(chǔ)材料,并為抗瘤黑粉病品種的培育提供可選擇抗源,從而拓寬抗瘤黑粉病種質(zhì)資源的遺傳背景。例如可以配制‘鋒967-2硬長(zhǎng)’ב10玉1172-1’的雜交組合,利用雜種優(yōu)勢(shì)選育出抗病品種,且隨著抗性的進(jìn)一步穩(wěn)定與提高,可以作為一個(gè)比較好的抗瘤黑粉病的品種。此次鑒定表明,感病材料所占比例明顯高于抗病材料,這與嚴(yán)理等[12]對(duì)玉米品種對(duì)瘤黑粉病抗性的鑒定結(jié)果一致。要得到高抗種質(zhì),除大范圍收集與篩選高抗種質(zhì)外,還可通過(guò)種質(zhì)創(chuàng)新或改良,解決現(xiàn)有種質(zhì)資源中抗病種質(zhì)匱乏的限制,打破抗源單一遺傳背景的現(xiàn)狀,以實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米瘤黑粉病的有效控制。目前,中國(guó)玉米種質(zhì)資源雖然豐富,但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)瘤黑粉病完全免疫的材料。因此發(fā)掘新的抗瘤黑粉病的種質(zhì)材料,并對(duì)這些種質(zhì)材料的抗病性等進(jìn)行明確劃分顯得尤為重要[19]。
種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究是種質(zhì)資源利用的必要前提,豐富的遺傳資源是玉米育種的基礎(chǔ),確定種質(zhì)資源的遺傳多樣性程度和親緣關(guān)系遠(yuǎn)近是育種的關(guān)鍵,遺傳的同源性越低,遺傳基礎(chǔ)越寬,對(duì)雜交育種越有利,使玉米育種材料選育和推廣更有針對(duì)性。SSR標(biāo)記具有信息量豐富、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),已成為遺傳育種和資源分類研究中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記[22-24],這對(duì)指導(dǎo)合理劃分優(yōu)勢(shì)群體,建立相應(yīng)的雜交育種模式,提高玉米抗瘤黑粉病育種效率具有重要意義。張思奇等[25]對(duì)59份玉米種質(zhì)進(jìn)行穗腐菌的抗性評(píng)價(jià),并利用6對(duì)SSR將59份玉米種質(zhì)劃分為8個(gè)組群,第1類群體中含有的4份種質(zhì),均為抗病;陳永坤等[26]對(duì)64份玉米自交系進(jìn)行粗縮病的抗性鑒定,采用70對(duì)SSR引物對(duì)64份玉米自交系進(jìn)行聚類分析,將供試自交系劃分為 6個(gè)群體,其中第1和第4類群中含有的抗病自交系較多;王艷梅等[27]對(duì)中國(guó)40份玉米自交系進(jìn)行絲黑穗病的抗性鑒定,采用57對(duì)SSR引物對(duì)40份自交系進(jìn)行聚類分析,將40份自交系分為5類,抗病材料主要集中在第5類群。對(duì)于玉米瘤黑粉病抗性鑒定的種質(zhì)進(jìn)行聚類分析的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,本試驗(yàn)利用69對(duì) SSR引物對(duì)2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種和30份材料進(jìn)行聚類分析,將32份玉米種質(zhì)資源在遺傳相似系數(shù)為0.643時(shí)分為 4類,說(shuō)明這些材料有比較豐富的遺傳變異,對(duì)抗病育種的選擇和利用提供有效的參考信息。但抗瘤黑粉病的種質(zhì)材料全部集中在第Ⅰ類,這些抗性材料遺傳基礎(chǔ)狹窄,距離差異小。這主要是因?yàn)槠贩N選育過(guò)程中所用親本使用過(guò)度,育種材料的遺傳差異很小,親緣關(guān)系較近,導(dǎo)致了大田生產(chǎn)中所用的抗瘤黑粉病品種的遺傳背景狹窄[16],對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力和對(duì)病害的抵抗力下降。所以在抗病育種過(guò)程中,要深入挖掘種質(zhì)資源的親緣關(guān)系,減少使用親緣關(guān)系較近的材料作為親本,應(yīng)該利用不同遺傳背景的材料作為親本,以增強(qiáng)品種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力,提高其對(duì)病害的抵抗力。
利用SSR分子標(biāo)記研究玉米種質(zhì)資源的遺傳多樣性,可對(duì)育種方法提供參考信息,為提高育種歷程提供可靠的分子依據(jù)。胡德分等[28]采用61對(duì)SSR引物在84份玉米材料中擴(kuò)增出622個(gè)等位基因位點(diǎn),平均每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因位點(diǎn)為10.23個(gè),多態(tài)性信息含量平均為0.779;陳波[29]以30份特異玉米地方品種和 2份玉米骨干自交系為材料,用83對(duì)SSR引物共檢測(cè)出475個(gè)等位基因,平均每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因位點(diǎn)為10.1個(gè),多態(tài)性信息含量平均為 0.626;趙旭等[30]用70對(duì)SSR引物在96份玉米材料和6個(gè)國(guó)內(nèi)通用的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種中擴(kuò)增出213個(gè)等位基因位點(diǎn),平均每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因位點(diǎn)為3.610個(gè),多態(tài)性信息含量平均為0.670。本試驗(yàn)采用69對(duì)SSR引物對(duì)32份種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增,一共分析篩選出272個(gè)等位基因,平均每個(gè)標(biāo)記3.64個(gè),多態(tài)性信息量為0.435~0.846,平均 0.764,相比以上研究,本研究所檢測(cè)到的多態(tài)性信息量較為豐富,表明本試驗(yàn)所用的種質(zhì)材料遺傳多樣性較高,可為抗瘤黑粉病的品種選育等研究提供參考。