枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備及再生條件研究

閆思遠，楊富龍，杜 娟，李 金，任苗苗，李嘉泓，顧沛雯

(寧夏大學 農(nóng)學院，銀川 750021)

內(nèi)生真菌是指在其生活史中某一階段或全部階段生活于健康植物內(nèi)部,且被感染的宿主植物(至少是暫時)不表現(xiàn)出明顯病害癥狀的一類真菌[1]。研究發(fā)現(xiàn)藥用植物中含有豐富的內(nèi)生真菌資源，是發(fā)現(xiàn)新化合物和獲得生物活性代謝產(chǎn)物的重要來源[2]。2017年，魏碩等[3]從冬凌草中分離出1株草酸青霉菌PenicilliumoxalicumCurrie et Thom，通過HPLC-MS和MTT法測定，發(fā)現(xiàn)該菌可以產(chǎn)生冬凌草甲素，且對人乳腺癌細胞系MCF-7的細胞活性具有一定抑制作用。2017年，徐全智[4]從枸杞中分離出1株細極鏈格孢Alternariatenussima，可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和 β-1,3葡聚糖酶，且對枸杞炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides、番茄葉霉病菌Fulviafulva、辣椒炭疽病菌C.capsici等病原真菌具有良好的拮抗作用。2018年，孫牧笛等[5]從苦豆子中分離得到1株細極鏈格孢A.tenussima，其作為真菌誘導子可促進苦豆子組培苗中LDC基因的表達，從而提高宿主氧化苦參堿的含量。但是藥用植物內(nèi)生真菌通過發(fā)酵生產(chǎn)天然活性產(chǎn)物的時間較長[6]、產(chǎn)率較低[7]、分離純化難度較大[8]，成本較高[9]，目前基本上還停留在實驗室的研究階段，無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。此外，從藥用植物中篩選出的內(nèi)生真菌，部分性狀不太穩(wěn)定，在培養(yǎng)過程中容易喪失重要功能[10]，因此迫切需要對其進行全面的生物學研究和遺傳改造。

建立良好穩(wěn)定的原生質(zhì)體制備技術(shù)是進行分子遺傳學操作的關(guān)鍵步驟之一[11]。原生質(zhì)體誘變[12]、融合[13]、基因組重排[14]、遺傳轉(zhuǎn)化[15]、基因組編輯技術(shù)[16]等都必須以高濃度、高活力的原生質(zhì)體為前提，所以優(yōu)化原生質(zhì)體的制備和再生條件顯得尤為重要。

原生質(zhì)體是指完整細胞去掉細胞壁結(jié)構(gòu)后所形成的球狀單細胞，可以攝取外源大分子，細胞器，細菌和病毒，具有全能型[17]。酶解法是制備原生質(zhì)體最常使用的方法，菌齡、酶復配體系、酶解時間、穩(wěn)滲劑等因素均會對原生質(zhì)體的制備產(chǎn)生影響[18]。2013年，弭寶彬等[19]通過優(yōu)化菌齡、酶解體系、酶解時間、酶解溫度及轉(zhuǎn)速等條件，獲得了尖孢鐮刀菌辣椒?；虵usariumoxysporumf.sp.capsicum原生質(zhì)體制備的最佳條件。2015年，Ramamoorthy等[20]通過單因素試驗對擬輪枝鐮刀菌F.verticillioides原生質(zhì)體制備條件進行優(yōu)化，獲得最大原生質(zhì)體產(chǎn)量為4.2×106mL-1。2016年，賀薇等[21]通過優(yōu)化培養(yǎng)基、菌齡、β-巰基乙醇預(yù)處理、酶解體系、酶解時間等條件，獲得尖孢鐮刀菌唐菖蒲?；虵.oxysporumf.sp.gladioli原生質(zhì)體的最大產(chǎn)量為1.4×107mL-1，再生率為57.4%。

筆者前期從健康枸杞根部分離到1株鐮刀菌屬內(nèi)生真菌F.nematophilumNQ8GⅡ4，該菌株對枸杞炭疽病菌C.gloeosporioides、葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea和玉米大斑病菌Exserohilumturcicum等多種植物病原真菌具有較強的拮抗作用，同時還能產(chǎn)生具有較強抑菌活性的揮發(fā)性氣體，是1株值得深入研究的高活性功能菌株。為了進一步開展該菌株在原生質(zhì)體誘變、融合等方面的遺傳改造研究，本研究通過單因素試驗對影響枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵因素(菌齡、酶解時間、酶質(zhì)量濃度、穩(wěn)滲劑濃度)進行優(yōu)化，以期通過響應(yīng)面法獲得該菌株原生質(zhì)體制備的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株(CGMCC No.19721)由寧夏大學植物病理實驗室分離、鑒定并保存。載體PDL2(含gfp基因)由西北農(nóng)林科技大學胡小平教授惠贈。

1.1.2 試劑和儀器 潮霉素B(HygromycinB，HmB)購于德國Roche公司；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)購于北京索萊寶科技有限公司；Miracloth購于美國Calbiochem公司；崩潰酶(Driselase)，溶壁酶(Lyticase)購于美國Sigma 公司。

參照張世杰[22]的方法，配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)和Bottom Agar培養(yǎng)基。

Simpli Nano超微量分光光度計(GE Healthcare公司，美國)；Sigma 3K 15通用臺式冷凍離心機(Sigma公司，美國)；Mettler-toledo LE204E電子分析天平(Mettler-toledo公司，瑞士)。

1.2 方 法

1.2.1 原生質(zhì)體制備 參照韓小路[23]的方法，略作調(diào)整。將枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，打取10個直徑0.5 cm的菌餅，接種于100 mL的PDB培養(yǎng)基中， 25 ℃、175 r/min的條件下震蕩培養(yǎng)4 d。吸取2.5×107個孢子于100 mL YPD培養(yǎng)基中， 25 ℃、175 r/min震蕩培養(yǎng)12～20 h。使用無菌miracloth過濾，0.6～1.2 mol/L NaCl沖洗菌絲至白色，稱量0.05 g于1 mL 15～35 g/L崩潰 酶+10 g/L溶壁酶的酶解液中，30 ℃、90 r/min酶解0.5～3 h。使用無菌miracloth過濾至50 mL離心管中，4 ℃、2 500 r/min離心20 min。加入10 mL STC緩沖液重新懸浮，2 500 r/min離心20 min(重復1次)，加入1 mL STC溶液重懸浮，備用。每個處理設(shè)置3個重復。

1.2.2 原生質(zhì)體再生 參照彭軼楠等[24]的方法，略作調(diào)整。將制備好的枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體懸浮液稀釋3 000倍，吸取70 μL涂布于Bottom Agar培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察再生情況。以無菌水處理原生質(zhì)體為對照，每個處理設(shè)置3個重復。

再生率=(Bottom Agar培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)-無菌水處理后Bottom Agar培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù))/(原生質(zhì)體產(chǎn)量/3 000×原生質(zhì)體涂布體積)×100%，有效原生質(zhì)體量(mL-1)=原生質(zhì)體產(chǎn)量×再生率。

1.2.3 單因素試驗 按照“1.2.1”制備原生質(zhì)體的方法，分別考察菌齡(12、14、16、18和20 h)、酶解時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h)、酶質(zhì)量濃度(15、20、25、30和35 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶)、穩(wěn)滲劑濃度(0.6、0.7、0.8、1.0和1.2 mol/L NaCl)等條件對原生質(zhì)體產(chǎn)量、再生率、有效原生質(zhì)體量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化條件 根據(jù)單因素試驗的試驗結(jié)果，以酶解時間(A)、酶質(zhì)量濃度(B)和穩(wěn)滲劑濃度(C)為自變量，以原生質(zhì)體產(chǎn)量(Y1)、再生率(Y2)、有效原生質(zhì)體量(Y3)作為響應(yīng)值，利用Design Expert 12.0設(shè)計Box-Behnken試驗，共17個試驗點，其中中心點5個，用來估計試驗誤差[25]。具體試驗設(shè)計如表1所示。

1.3 統(tǒng)計分析

使用Design Expert 12.0軟件進行Box-Behnken試驗設(shè)計；SPSS 23進行數(shù)據(jù)分析。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌齡對枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備和再生的影響 由圖1可知，隨著菌齡的增大，NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當菌齡為16 h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最大，為6.94×107mL-1，再生率達到最大，為5.81%，有效原生質(zhì)體量達到最大，為40.31×105mL-1。因此選擇16 h菌齡菌絲作為原生質(zhì)體制備原料。

圖中不同大寫字母表示原生質(zhì)體產(chǎn)量各水平間差異達顯著水平(P<0.05)；不同小寫字母表示原生質(zhì)體再生率各水平間差異達顯著水平(P<0.05)，下同

2.1.2 酶質(zhì)量濃度對枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備和再生的影響 由圖2可知，隨著混合酶液中崩潰酶質(zhì)量濃度的增加，NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。使用30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最大，為 6.97×107mL-1，再生率達到最大，為5.77%，有效原生質(zhì)體量達到最大，為40.22×105mL-1。因此選擇25～35 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液作為酶解液。

圖2 酶質(zhì)量濃度與枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備及再生的關(guān)系Fig.2 Relationship between enzyme mass concentration with preparation and regeneration of NQ8GⅡ4 strain protoplasts

2.1.3 酶解時間對枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備和再生的影響 由圖3可知，酶解時間為2.5 h時，NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最大，為6.38×107mL-1；當酶解時間為1.5 h時，原生質(zhì)體再生率達到最大，為6.89%；綜合考慮，當酶解時間為2.5 h時，有效原生質(zhì)體量達到最大，為37.90×105mL-1。因此，選擇2～3 h作為較適酶解時間。

2.1.4 穩(wěn)滲劑濃度對枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備和再生的影響 由圖4可知，當穩(wěn)滲劑(NaCl)濃度為0.7 mol/L時，NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最大，為 6.56×107mL-1，再生率達到最大，為5.86%，有效原生質(zhì)體量達到最大，為38.44×105mL-1。因此，選擇0.6～0.8 mol/L NaCl作為較適穩(wěn)滲劑。

圖3 酶解時間與枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備及再生的關(guān)系Fig.3 Relationship between enzymolysis time with preparation and regeneration of NQ8GⅡ4 strain protoplasts

圖4 穩(wěn)滲劑濃度與枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備及再生的關(guān)系Fig.4 Relationship between osmotic pressure stabilizer concentration with preparation and regeneration of NQ8GⅡ4 strain protoplasts

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，以酶解時間(A)、酶質(zhì)量濃度(B)、穩(wěn)滲劑濃度(C)3個因素為自變量，以原生質(zhì)體產(chǎn)量(Y1)、再生率(Y2)、有效原生質(zhì)體量(Y3)為響應(yīng)值，考察因素及因素之間的相互關(guān)系對響應(yīng)值的影響，試驗結(jié)果見表2。

運用軟件Design Expert 12.0分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)，數(shù)學擬合方程及方差分析，并對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量、再生率和有效原生質(zhì)體量的二次多項式回歸方程模型。

Y1=6.640 0+0.153 8A+0.480 0B+ 1.380 0C-0.092 5AB+0.615 0AC+0.462 5BC-3.350 0A2- 2.560 0B2-2.150 0C2

(1)

Y2=5.820 0+0.2100A-0.027 5B- 0.565 0C+1.650 0AB-0.812 5AC-0.182 5BC- 0.010 0A2-0.722 5B2-4.480 0C2

(2)

Y3=38.840 0+0.3463A+0.881 2B+ 0.415 0C+0.740 0AB-0.057 5AC+0.167 5BC-17.730 0A2-17.67 0 0B2-20.520 0C2

(3)

模型(1)：一次項中，C為極顯著項 (P<0.01)，A、B均為不顯著項。各因子對原生質(zhì)體產(chǎn)量影響大小為C>B>A，說明穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)生的影響最大，其次為酶質(zhì)量濃度，酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)生的影響最小。二次項中，A2、B2、C2為極顯著項，說明酶解時間，酶質(zhì)量濃度和穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)生的影響是非線性的。交互項中，AB、AC、BC均為不顯著項，說明酶解時間、酶質(zhì)量濃度、穩(wěn)滲劑濃度之間的交互影響不明顯。

模型(2)：一次項中，C為顯著項(P<0.05)。各因子對原生質(zhì)體再生影響大小為穩(wěn)滲劑濃度>酶解時間>酶質(zhì)量濃度。二次項中，C2為極顯著項。交互項中，BC相關(guān)不顯著；AC相關(guān)顯著；AB達到極顯著水平，說明酶解時間與酶質(zhì)量濃度、酶解時間與穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體再生的影響具有交互作用而不是簡單的線性關(guān)系。

模型(3)：一次項中，A、B、C均為不顯著項。各因子對有效原生質(zhì)體量影響大小為酶質(zhì)量濃 度>穩(wěn)滲劑濃度>酶解時間。二次項中，A2、B2、C2為極顯著項。交互項中，AB、AC、BC均為不顯著項。

2.2.3 響應(yīng)面分析試驗因素的相互影響 響應(yīng)面圖中曲面的陡峭程度表示各因素對響應(yīng)值的影響程度[26]。等高線的形狀可反映出因素間交互效應(yīng)的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[27]。

由圖5可知，在酶解時間、酶質(zhì)量濃度、穩(wěn)滲劑濃度3個因素中，枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率主要受穩(wěn)滲劑濃度的影響(圖A1～B3)；有效原生質(zhì)體量主要受酶質(zhì)量濃度影響(圖C1～C3)。酶解時間與酶質(zhì)量濃度、酶解時間與穩(wěn)滲劑濃度的交互作用對原生質(zhì)體再生率的影響較為顯著。上述結(jié)果與表3結(jié)果一致。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Experimental design schemefor response surface methodology and results

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test and varianceanalysis of regression equation

圖5 各因素交互作用對枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量(A1～A3)、再生率(B1～B3)、有效原生質(zhì)體產(chǎn)量(C1～C3)影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graphs for effect of interaction of various factorson protoplast yield (A1～A3), regeneration rate (B1～B3), available protoplast volume (C1～C3) of NQ8GⅡ4 strain

2.2.4 驗證試驗 根據(jù)Design Expert 12.0軟件分析結(jié)果，得到枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株最佳原生質(zhì)體制備條件為，以0.713 mol/L NaCl為穩(wěn)滲劑，稱量0.05 g菌齡為16 h的菌絲于 1 mL 30.30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液中酶解2.5 h。在此條件下進行5次試驗，結(jié)果顯示優(yōu)化后NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體平均產(chǎn)量可以達到7.12×107mL-1，與預(yù)測值 6.81×107mL-1相差4.56%；再生率平均為 5.56%，與預(yù)測值5.67%相差1.98%；有效原生質(zhì)體量平均為39.59×105mL-1，與預(yù)測值 38.53×105mL-1相差2.75%。證明該模型是可靠的。優(yōu)化后產(chǎn)生的原生質(zhì)體大小均勻，球體圓潤，菌絲很少(圖6)，可以進行下一步試驗。

A.萌發(fā)16 h的枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株菌絲體；B.枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體；C.枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體再生

3 討 論

原生質(zhì)體制備與再生是兩個相互聯(lián)系的過程，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率是評價原生質(zhì)體制備質(zhì)量的評價指標[26]。獲得一定濃度、純度和活力的原生質(zhì)體是進行分子遺傳學操作的基礎(chǔ)和前提保障之一[28]。關(guān)于絲狀真菌原生質(zhì)體制備國內(nèi)外已有不少的研究報道，但是由于細胞壁結(jié)構(gòu)較為復雜，組成成分較為多樣，針對特定的絲狀真菌菌株，必須具體分析，綜合考慮，方能得到適合該菌株的原生質(zhì)體制備條件[29]。本研究通過單因素試驗，證明菌齡、酶質(zhì)量濃度、酶解時間、穩(wěn)滲劑濃度等條件對枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備和再生均有影響。單因素條件下NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體制備的最佳條件為：菌齡16 h的菌絲0.05 g于1 mL 30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液中反應(yīng)2.5 h；以0.7 mol/L NaCl作為穩(wěn)滲劑，原生質(zhì)體平均產(chǎn)量為6.71×107mL-1，再生率平均為5.85%，有效原生質(zhì)體量平均為39.29×105mL-1。其中，菌齡主要影響細胞壁的結(jié)構(gòu)、菌體代謝水平和菌體活力。菌齡過短，菌絲細胞壁太薄，產(chǎn)生的原生質(zhì)體易破碎，導致原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率都較低；當菌齡過長時，細胞壁增厚，不易酶解，導致原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率下降[18]。當酶質(zhì)量濃度較低時，酶解能力較弱，得不到大量的原生質(zhì)體；酶質(zhì)量濃度過高時，過量的酶會繼續(xù)降解原生質(zhì)體，導致原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率降低[30]。酶解時間短，菌絲不能充分酶解產(chǎn)生的大量原生質(zhì)體；而酶解時間過長，已形成的原生質(zhì)體被酶解，原生質(zhì)體上失去再生的細胞殘壁引物，導致原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率下降[31]。穩(wěn)滲劑不僅會維持原生質(zhì)體細胞膜的滲透壓保護原生質(zhì)體，對酶的活性也有促進作用。穩(wěn)滲劑濃度過高，不利于原生質(zhì)體產(chǎn)生，且會使生成的原生質(zhì)體失水皺縮；而當穩(wěn)滲劑濃度過低時，則會使原生質(zhì)體吸水膨脹，體積變大，易于破裂[32]。

本研究以單因素試驗確定的原生質(zhì)體制備的最適條件為基礎(chǔ)，進行響應(yīng)面多因素優(yōu)化試驗，確定酶解時間、酶質(zhì)量濃度、穩(wěn)滲劑濃度三因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量、再生率、有效原生質(zhì)體量的組合效應(yīng)；得出枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體最佳制備條件為：以0.713 mol/L NaCl為穩(wěn)滲劑，稱量0.05 g菌齡為16 h的菌絲于1 mL 30.30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液中酶解2.5 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量平均為7.12×107mL-1，再生率平均為5.56%，有效原生質(zhì)體量平均為39.59×105mL-1，與模型預(yù)測值 38.53×105mL-1擬合較好，相對于單因素試驗結(jié)果提升 0.76%。這是因為單因素分析中各因素的設(shè)定是固定梯度差，只能表現(xiàn)出最佳制備條件的趨勢，最佳制備條件不能反映，并且試驗處理僅為一個方向，各因素之間的相互作用不能體現(xiàn)出來，而響應(yīng)面分析不僅可以反映出各因素連續(xù)變化對于響應(yīng)值的作用，還可以反映出各因素之間的相互作用以及各因素相互作用下的理論最佳條件[33]。

4 結(jié) 論

建立良好穩(wěn)定的原生質(zhì)體制備技術(shù)是進行分子遺傳學操作的關(guān)鍵步驟之一。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)面法進一步優(yōu)化該菌株原生質(zhì)體的制備和再生條件，建立以枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株的原生質(zhì)體產(chǎn)量、再生率和有效原生質(zhì)體量為響應(yīng)值，以酶解時間、酶質(zhì)量濃度和穩(wěn)滲劑濃度為自變量的三元二次回歸方程。經(jīng)驗證，模型合理可靠，能夠準確反映NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體最佳制備條件為：以 0.713 mol/L NaCl為穩(wěn)滲劑，菌齡16 h的菌絲 0.05 g于1 mL 30.30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液中酶解2.5 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量平均為7.12×107mL-1，再生率平均為5.56%，有效原生質(zhì)體量平均為39.59×105mL-1。本研究結(jié)果為枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4菌株遺傳改造和后續(xù)的分子遺傳學研究奠定基礎(chǔ)。