檢測(cè)多天線AAG的Lectin-ELISA方法建立及初步應(yīng)用評(píng)價(jià)

關(guān)雯倩， 高致遠(yuǎn)， 馮惠娟， 洪 松， 何羽童， 何 璐， 高春芳

（上海東方肝膽外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200438）

α1-酸性糖蛋白（alpha 1-acid glycoprotein，AAG）是由肝細(xì)胞合成、分泌的一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白[1]，等電點(diǎn)為2.8～3.8，糖含量高達(dá)42%[2]。人血清AAG分子是一條具有183個(gè)氨基酸的多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量為41 000～43 000，含有5個(gè)N-linked糖基化位點(diǎn)（Asn-15、Asn-38、Asn-54、Asn-75、Asn-85），每個(gè)糖基化位點(diǎn)均可能表達(dá)具有不同分枝數(shù)的糖鏈結(jié)構(gòu)[3]，多天線糖鏈結(jié)構(gòu)主要是指有3條或3條以上分枝的糖鏈。血清中糖蛋白的含糖量多在20%以下，AAG的含糖量在所有糖蛋白中處于較高水平，且唾液酸含量高達(dá)15%，并以α2-3或α2-6的方式與半乳糖連接[4]。唾液酸帶負(fù)電荷，這也是AAG等電點(diǎn)較低的原因。由于AAG具有抗中性粒細(xì)胞和抗補(bǔ)體活性，因此被認(rèn)為是一種天然的抗炎蛋白和免疫調(diào)節(jié)劑[5]。AAG還具有維持毛細(xì)血管通透性的功能，可提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的陰離子選擇性[6]。此外，AAG還具有抑制血小板聚集等功能[7]。AAG的多種生物學(xué)活性都依賴于其糖基化修飾，如抑制淋巴細(xì)胞增殖的功能依賴于其糖鏈分枝水平[8]；AAG經(jīng)去唾液酸處理后，其抑制血小板聚集的功能加強(qiáng)[9]；AAG可通過(guò)N-linked糖鏈結(jié)合1型人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus 1，HIV-1），抑制病毒包膜蛋白結(jié)合CD4+單核細(xì)胞[10]。AAG糖基化改變并不僅限于急性炎癥條件下，在其他病理生理?xiàng)l件下也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，如妊娠、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、酒精性肝硬化、肝炎等[11-14]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，糖基化位點(diǎn)和糖鏈結(jié)構(gòu)均可能出現(xiàn)異常改變，通過(guò)對(duì)比正常人和疾病患者的糖基化狀況，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)能用于臨床的新腫瘤標(biāo)志物。在卵巢癌、胰腺癌等腫瘤中，AAG的糖基化改變已有相關(guān)報(bào)道[15]。在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中，異常巖藻糖基化的AAG增加也有相關(guān)報(bào)道[16]。糖鏈分枝數(shù)增加也是腫瘤中常見的異常糖基化形式。目前，關(guān)于HCC中AAG的多天線糖鏈改變情況尚缺乏相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。為闡明HCC患者血清多天線AAG的變化情況，本研究擬構(gòu)建一種凝集素-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（lectin enzyme-linked immunosorbent assay，Lectin-ELISA）檢測(cè)體系，初步評(píng)價(jià)多天線AAG對(duì)HCC患者的診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年—2018年的患者457例，包括HCC 220例[HCC組，其中男193例、女27例，年齡（50.3±8.22）歲]、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）74例[ICC組，其中男64例、女10例，年齡（55.72±10.18）歲]、肝硬化（liver cirrhosis，LC）120例[LC組，其中男106例、女14例，年齡（51.45±11.07）歲]、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）43例[CHB組，其中男40例、女3例，年齡（51.02±10.31）歲]，其中220例HCC患者、74例ICC患者和32例LC患者的血清樣本收集于上海東方肝膽外科醫(yī)院，79例LC患者和4例CHB患者的血清樣本收集于海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院，8例LC患者的血清樣本收集于中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第962醫(yī)院；8例CHB患者的血清樣本收集于沈陽(yáng)軍區(qū)總院；27例CHB患者的血清樣本收集于濟(jì)南傳染病院；4例CHB的血清樣本收集于臺(tái)州市第一人民醫(yī)院；1例LC的血清樣本收集于福州孟超肝膽醫(yī)院。根據(jù)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)，盡可能全面地收集所有患者的一般資料、 臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及病理診斷結(jié)果。HCC患者病理診斷結(jié)果包括：腫瘤的大小、腫瘤數(shù)目、衛(wèi)星結(jié)節(jié)、大血管癌栓、腫瘤包膜、分化程度、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）、肝硬化情況等。每例患者臨床血常規(guī)、肝功能、腫瘤標(biāo)志物、凝血系統(tǒng)功能檢查、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）標(biāo)志物等臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)與血清樣本同期收集。選取同期上海東方肝膽外科醫(yī)院體檢健康者80名（正常對(duì)照組），其中男70名、女10名，年齡（51.46±8.34）歲。各組間性別、年齡均相互匹配。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 入選和排除標(biāo)準(zhǔn)

HCC均為經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等感染；（2）患繼發(fā)性肝癌、其他器官惡性腫瘤、嚴(yán)重感染及其他器官嚴(yán)重疾病等。HCC分期依據(jù)TNM標(biāo)準(zhǔn)[美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版]。T1期：?jiǎn)蝹€(gè)腫瘤＜2 cm或＞2 cm但無(wú)血管浸潤(rùn)；T2期：?jiǎn)蝹€(gè)腫瘤＞2 cm，伴有血管浸潤(rùn)，或多發(fā)性腫瘤且均＜5 cm；T3期：多發(fā)性腫瘤，其中至少1個(gè)＞5 cm；T4期：任意大小的單個(gè)或多個(gè)腫瘤侵犯門靜脈或肝靜脈，或腫瘤直接侵犯膽囊以外的臨近器官或腹膜臟層。

ICC均經(jīng)術(shù)后病理明確診斷。LC均經(jīng)過(guò)臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查確診的HBV相關(guān)LC患者，排除自身免疫性肝病、酒精性肝病，藥物性肝病及其他原因引起的慢性肝病、Wilson病、腎功能不全、血液病等。CHB均為乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性持續(xù)6個(gè)月以上的患者。

1.3 血清樣本采集

采用促凝管采集所有對(duì)象靜脈血3～4 mL，室溫靜置30 min，1 500×g離心10 min，吸取血清置于專用的Eppendorf管中，300～500 μL/管，-80 ℃保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)

肝功能指標(biāo)均采用Modular P800全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測(cè)。相關(guān)指標(biāo)參考區(qū)間分別為總蛋白（total protein，TP）65～85 g/L，白蛋白（albumin，Alb）40～55 g/L，總膽紅素（total bilirubin，TB）3.4～21.0 μmol/L，直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）＜6.84 μmol/L，總膽汁酸（total bile acid，TBA）＜12 μmol/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）9～50 U/L，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）15～40 U/L，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）10～60 U/L，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）45～125 U/L，唾液酸（sialic acid，SA）456～754 mg/L，白蛋白/球蛋白（albumin/globulin，A/G）比值1.5～2.5。

血常規(guī)指標(biāo)采用XE-2100D全自動(dòng)血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑檢測(cè)。相關(guān)指標(biāo)參考區(qū)間分別為白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)（3.5～9.5）×109/L，血小板（platelet，PLT）計(jì)數(shù)（125～ 350）×109/L，紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）計(jì)數(shù)男性（4.0～5.5）×109/L、女性（3.5～5.0）×109/L，血紅蛋白（hemoglobin，Hb）男性120～160 g/L、女性110～150 g/L。

腫瘤標(biāo)志物采用cobas e601電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測(cè)。相關(guān)指標(biāo)參考區(qū)間分別為甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）＜20 μg/L，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）＜10 μg/L，糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9＜39 U/mL。甲胎蛋白異質(zhì)體（alpha-fetoprotein variant，AFP-L3）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京熱景公司，參考區(qū)間為＜10%。

1.5 主要試劑和儀器

酶標(biāo)板購(gòu)自德國(guó)Greiner Bio One公司，AAG抗體（ab118809）購(gòu)自英國(guó)Abcom公司，Coating buffer（#421701）購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司，Biotinylated DSA（B-1185）、Carbofree coating buffer（SP-5040）購(gòu)自美國(guó)Vector公司，LowCross-buffer購(gòu)自德國(guó)Candor Bioscience公司，Peroxidase-conjugated avidin、Substrate Reagent Pack（DY999）購(gòu)自美國(guó)RD公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）（20×）、Tween-20購(gòu)自上海博光生物科技有限公司，Stop solution購(gòu)自上海西塘生物公司。移液器購(gòu)自美國(guó)Gilson公司，恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏儀器設(shè)備有限公司，Gen5酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek Instruments公司，BN-Ⅱ特定蛋白分析儀購(gòu)自德國(guó)西門子公司。

1.6 方法

1.6.1 Lectin-ELISA的建立 根據(jù)曼陀羅凝集素（Datura stramonium agglutinin，DSA）可特異性識(shí)別多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的原理[17]構(gòu)建檢測(cè)多天線AAG的Lectin-ELISA方法。采用AAG抗體包被酶標(biāo)板，捕獲血清樣本中的目的蛋白AAG，采用DSA特異性識(shí)別AAG的多天線糖鏈結(jié)構(gòu)，檢測(cè)DSA與多天線AAG結(jié)合物（DSA-AAG）的水平。經(jīng)證實(shí)，抗體分子上不含多天線結(jié)構(gòu)，不影響DSA對(duì)目的蛋白多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的識(shí)別和結(jié)合，因此無(wú)需對(duì)抗體分子上的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行封閉[18]。具體步驟：（1）用包被液將AAG抗體按比例稀釋后加入酶標(biāo)板，每孔加入100 μL，4 ℃過(guò)夜，每孔加入400 μL洗板液洗滌4次，最后1次洗滌后用吸水紙拍干；（2）每孔加入300 μL封閉液，37 ℃孵育1 h，洗滌4次后用吸水紙拍干；（3）用LowCross-buffer將血清樣本1∶100稀釋，每份樣本加入2個(gè)孔中（雙復(fù)孔），每孔加入100 μL，室溫孵育2.5 h，洗滌4次后用吸水紙拍干；（4）用PBS將biotinylated DSA按比例稀釋，每孔加入100 μL，室溫孵育1 h，洗滌4次后用吸水紙拍干；（5）用酶稀釋液將peroxidase-conjugated avidin按比例稀釋，每孔加入100 μL，室溫孵育45 min，洗滌4次后用吸水紙拍干；（6）每孔加入配制好的辣根過(guò)氧化物酶顯色底物100 μL，室溫避光孵育30 min；（7）每孔加入50 μL終止液，輕晃酶標(biāo)板混勻，10 min內(nèi)放入Gen5酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（A）值。

1.6.2 方法學(xué)評(píng)估 由于目前尚無(wú)多天線AAG標(biāo)準(zhǔn)品，因此以5名健康人混合血清替代標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)前期條件摸索，將混合血清以1∶5、1∶20、1∶80、1∶320、1∶1 280、1∶5 120、1∶20 480稀釋，采用建立的Lectin-ELISA進(jìn)行檢測(cè)，獲得濃度梯度曲線，以此評(píng)估該方法的線性。對(duì)高、中、低值樣本重復(fù)檢測(cè)5個(gè)批次，計(jì)算該方法的批間變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。以此評(píng)估該方法的重復(fù)性。采用Interference check A PLUS干擾檢測(cè)試劑盒（日本Sysmex公司）進(jìn)行干擾試驗(yàn)，干擾物質(zhì)包括游離膽紅素（free bilirubin，F(xiàn)Bil）、結(jié)合膽紅素（conjugated bilirubin，CBil）、溶血（Hb）和乳糜。按說(shuō)明書要求配制干擾樣本。具體步驟：在各干擾物質(zhì)中分別加入2 mL超純水，充分溶解，取1 mL與預(yù)先制備好的混合血清樣本9 mL充分混勻，作為樣本A。在空白對(duì)照中加入2 mL超純水，充分溶解，取1 mL與預(yù)先制備好的混合血清樣本9 mL充分混勻，作為樣本B。將樣本A與樣本B按0∶1、0.2∶0.8、0.4∶0.6、0.6∶0.4、0.8∶0.2、1∶0配制成不同稀釋比例的樣本，采用建立的Lectin-ELISA檢測(cè)，判斷各干擾物質(zhì)對(duì)該方法的影響。

1.6.3 Lectin-ELISA的初步臨床應(yīng)用 采用建立的Lectin-ELISA檢測(cè)所有對(duì)象的血清樣本。

1.6.4 血清AAG檢測(cè) 采用BN-Ⅱ特定蛋白分析儀及配套試劑檢測(cè)所有對(duì)象的血清AAG水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估各項(xiàng)目之間的相關(guān)性。采用Logistic回歸方法建立多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)模型。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估單項(xiàng)指標(biāo)及聯(lián)合檢測(cè)模型診斷HCC的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對(duì)照組一般資料的比較

HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對(duì)照組之間血清ALT、AST、TB、DBil、Alb、TP、AFP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），性別及年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 方法學(xué)評(píng)估

2.2.1 線性范圍 以混合血清替代標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，以A值為縱坐標(biāo)，以血清稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制濃度梯度曲線，線性回歸系數(shù)r2=0.976，見圖1。HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對(duì)照組血清以1∶100稀釋后DSAAAG水平均在此范圍內(nèi)。

圖1 血清DSA-AAG的濃度梯度曲線

表1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對(duì)照組一般資料的比較 ±s

表1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對(duì)照組一般資料的比較 ±s

組別 例數(shù) AST/（U/L） ALT/（U/L） GGT/（U/L） TB/（μmol/L）HCC組 220 29.00（20.00～42.00） 29.00（20.00～42.00） 56.00（34.00～104.5） 14.00（10.90～18.38）CHB組 43 223.00（88.00～519.00） 295.00（183.00～767.00） 114.00（63.00～165.00） 23.40（14.70～69.10）LC組 120 32.00（24.25～44.75） 27.00（18.00～40.25） 46.50（28.25～79.75） 23.85（15.00～40.15）ICC組 74 23.00（18.00～35.00） 24.50（16.00～34.25） 84.50（61.75～113.00） 14.35（10.70～18.43）正常對(duì)照組 80 20.00（16.00～25.75） 14.65（12.00～16.63）統(tǒng)計(jì)值 17.295 17.744 2.271 18.798 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.132 ＜0.001組別 DBil/（μmol/L） Alb/（g/L） TP/（g/L） AFP/（μg/L）HCC組 5.50（4.10～7.10） 42.01±3.74 69.62±8.28 61.00（4.70～1 210.00）CHB組 9.60（5.20～47.00） 37.69±4.24 69.09±6.26 8.31（3.71～45.47）LC組 10.20（6.00～20.00） 33.08±10.18 63.63±16.81 3.60（2.23～8.84）ICC組 5.15（3.85～6.80） 42.26±3.46 68.67±5.12 2.90（2.00～4.70）正常對(duì)照組 47.91±1.97 75.87±3.20 3.50（2.60～3.50）統(tǒng)計(jì)值 22.056 46.845 161.700 82.406 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2.2 批間CVLectin-ELISA檢測(cè)血清DSAAAG的批間最大CV為10.51%，滿足批間CV＜15%的要求。見表2。

表2 Lectin-ELISA的批間CV

2.2.3 干擾試驗(yàn) Lectin-ELISA檢測(cè)血清DSAAAG的A值隨干擾物濃度的變化僅出現(xiàn)輕微變化，符合臨床應(yīng)用要求。見圖2。

2.3 血清DSA-AAG和AAG水平

將ICC組、LC組、CHB組合并為疾病對(duì)照組，HCC組血清DSA-AAG水平顯著高于疾病對(duì)照組和正常對(duì)照組（P＜0.001），且疾病對(duì)照組高于正常對(duì)照組（P＜0.001）。HCC組、疾病對(duì)照組血清AAG水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.001），而HCC組與疾病對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖2 干擾物質(zhì)對(duì)Lectin-ELISA檢測(cè)DSA-AAG的干擾

表3 HCC組、疾病對(duì)照組和正常對(duì)照組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 x±s

將HCC組和ICC組合并為癌癥組，將LC組、CHB組和正常對(duì)照組合并為非癌癥組。癌癥組血清DSA-AAG和AAG水平均高于非癌癥組（P＜0.001）。見表4。

HCC組血清DSA-AAG水平高于ICC組（P＜0.001），血清AAG水平低于ICC組（P＜0.001）。見表5。

表4 癌癥組與非癌癥組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表4 癌癥組與非癌癥組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注：與非癌癥組比較，*P＜0.001

組別 DSA-AAG（A值） AAG/（g/L）癌癥組 0.46±0.08* 0.67±0.32*非癌癥組 0.43±0.10 0.52±0.28

表5 HCC組與ICC組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表5 HCC組與ICC組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注：與ICC組比較，*P＜0.001

組別 DSA-AAG（A值） AAG/（g/L）HCC組 0.47±0.07* 0.63±0.30*ICC組 0.43±0.10 0.79±0.35

2.4 HCC組DSA-AAG與臨床各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性

HCC組DSA-AAG與AFP呈負(fù)相關(guān)（r=0.147，P＜0.05），與TP、Alb、A/G比值、GGT、TB、DBil、ALT、AST、RBC計(jì)數(shù)、Hb、糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9均無(wú)相關(guān)性（r值分別為0.040、0.039、-0.017、0.052、-0.012、-0.031、0.061、0.059、-0.094、-0.056、0.001，P＞0.05）。

2.5 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較

將HCC按直徑分為小肝癌（直徑＜5 cm，106例）和大肝癌（直徑≥5cm，112例），大肝癌血清AAG水平高于小肝癌（P＜0.001），而血清DSA-AAG水平二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將HCC患者按TNM分期分為T1期（65例）、T2期（74例）和T3+T4期（79例），T3+T4期患者血清AAG水平顯著高于T1、T2期患者（P＜0.001），不同分期患者之間血清DSA-AAG水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6。

2.6 AFP陰性HCC患者與非癌癥者血清DSAAAG水平的比較

220例HCC中有90例（40.9%）患者血清AFP為陰性（＜20 ng/mL）。將肝硬化患者、CHB患者、正常對(duì)照者合并為非癌癥組。AFP陰性HCC組血清DSA-AAG和AAG水平均高于非癌癥組（P＜0.001、P＜0.05）。見表7。

表6 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較 ±s

表6 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較 ±s

項(xiàng)目 DSA-AAG（A值） AAG/（g/L）腫瘤大小/cm＜5 0.47±0.08 0.53±0.22≥5 0.47±0.07 0.73±0.33 TNM分期T1期 0.47±0.07 0.58±0.27 T2期 0.47±0.09 0.52±0.22 T3+T4期 0.47±0.06 0.78±0.33

表7 AFP陰性HCC組與非癌癥者血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表7 AFP陰性HCC組與非癌癥者血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注：與非癌癥組比較，*P＜0.05、**P＜0.001

組別 DSA-AAG（A值） AAG/（g/L）AFP陰性HCC組 0.48±0.09** 0.60±0.28*非癌癥組 0.43±0.10 0.52±0.29

2.7 DSA-AAG及AAG單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的效能

采用Logistic回歸分析建立DSA-AAG、A A G和A F P聯(lián)合檢測(cè)鑒別診斷H C C與非HCC的模型為L(zhǎng)ogitAAG1=6.578×DSA-AAG+1.445×AAG+0.013×AFP-3.258。ROC曲線分析結(jié)果顯示，DSA-AAG、AAG及AFP單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)模型LogitAAG1鑒別診斷HCC與非HCC的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.651、0.632、0.803和0.836，LogitAAG1的準(zhǔn)確性（74.9%）高于DSA-AAG（63.9%）和AAG（57.0%），與AFP（74.0%）相當(dāng)，敏感性最高的是DSA-AAG（85.4%），特異性最高的是AFP（84.8%）。見表8和圖3。

表8 DSA-AAG、AAG及AFP單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)模型LogitAAG1鑒別診斷HCC與非HCC的效能

采用Logistic回歸分析建立DSA-AAG、Alb和TB聯(lián)合檢測(cè)鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的模型為L(zhǎng)ogitAAG2=6.912×DSA-AAG-0.126×TB-0.193×Alb+6.417。ROC曲線分析結(jié)果顯示，DSA-AAG、AAG單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的AUC分別為0.669、0.607、0.929，LogitAAG2的診斷效能優(yōu)于DSA-AAG和AAG單項(xiàng)檢測(cè)。見表9和圖3。

表9 DSA-AAG、AAG單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的效能

圖3 各項(xiàng)指標(biāo)單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的ROC曲線

3 討論

糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，血清中有50%～70%的蛋白為糖基化修飾蛋白[19]。糖基化修飾在很多關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程中起重要作用，如細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、黏附以及分子運(yùn)輸和清除、受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用等，對(duì)維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及其生物學(xué)功能同樣起著重要作用，同時(shí)還直接參與疾病的病理生理過(guò)程[20]。肝臟是體內(nèi)除B細(xì)胞外最重要的糖基化修飾部位[21]。AAG是由肝細(xì)胞合成并分泌的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其糖基化改變與肝臟疾病具有密切關(guān)聯(lián)。DSA-AAG代表的是血清中能與DSA特異性結(jié)合的AAG，即含有多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的AAG。

目前，臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物大部分為糖蛋白，如AFP、CEA、前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）、CA19-9、CA125等。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，糖蛋白會(huì)出現(xiàn)異常糖基化修飾[22]，因此異常糖基化腫瘤標(biāo)志物也成為新的研究熱點(diǎn)。大多數(shù)經(jīng)異常糖基化修飾的蛋白質(zhì)位于細(xì)胞膜上或直接被分泌到血清中，血清中的聚糖結(jié)構(gòu)通常很穩(wěn)定，這使得將血清作為樣本檢測(cè)異常糖基化修飾蛋白成為可能。目前已有異常糖基化腫瘤標(biāo)志物成功地應(yīng)用于臨床：2005年，美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)核心巖藻糖基化的AFP，即甲胎蛋白異質(zhì)體用于臨床。我國(guó)原發(fā)性肝細(xì)胞癌診療規(guī)范（2017版）也指出：血清AFP及其異質(zhì)體是診斷肝癌的重要指標(biāo)和特異性最強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，常用于肝癌的普查、早期診斷、術(shù)后療效監(jiān)測(cè)和隨訪，且有助于鑒別腫瘤的來(lái)源[23]。因此，聚焦于異常糖基化改變?yōu)榘l(fā)現(xiàn)敏感性和特異性更高的腫瘤標(biāo)志物提供了一個(gè)新的思路。

然而，由于聚糖結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性，給異常糖基化蛋白質(zhì)的研究和臨床應(yīng)用帶來(lái)了一定的困難。隨著高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）、質(zhì)譜（mass spectrometry、MS）等技術(shù)的應(yīng)用，人們對(duì)聚糖結(jié)構(gòu)有了更全面的認(rèn)識(shí)[24]。在尋找異常糖基化腫瘤標(biāo)志物的過(guò)程中，凝集素發(fā)揮著重要的作用。凝集素是一類特殊的蛋白質(zhì)或糖蛋白，能識(shí)別特定糖鏈結(jié)構(gòu)并與之非共價(jià)、可逆地結(jié)合。許多凝集素，尤其是植物凝集素，成為糖復(fù)合物研究中的重要工具[22]。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）省去了分離和富集單個(gè)蛋白的繁瑣步驟，方法簡(jiǎn)便、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化，可實(shí)現(xiàn)大批量樣本的檢測(cè)。DSA能特異性識(shí)別多天線糖鏈結(jié)構(gòu)。通過(guò)基于DNA測(cè)序儀的熒光糖電泳技術(shù)對(duì)IgG的N-糖鏈結(jié)構(gòu)圖譜進(jìn)行研究，結(jié)果顯示IgG分子不含多天線糖鏈結(jié)構(gòu)[25]。因此將DSA與ELISA聯(lián)用建立的Lectin-ELISA方法可避免抗體分子自身糖鏈結(jié)構(gòu)對(duì)檢測(cè)的干擾，又具有常規(guī)ELISA的特點(diǎn)。

本研究構(gòu)建了檢測(cè)血清DSA-AAG的Lectin-ELISA，并對(duì)該方法的檢測(cè)性能進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。由于目前尚無(wú)關(guān)于正常人血清多天線糖鏈結(jié)構(gòu)AAG水平的相關(guān)報(bào)道，同時(shí)也缺乏相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)品，因此本研究以健康人混合血清替代標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)。為盡量減少檢測(cè)過(guò)程中非特異性結(jié)合對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的干擾，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本研究嘗試了多種血清稀釋液，結(jié)果顯示LowCrossbuffer對(duì)降低本底和非特異性干擾的效果比其他稀釋液更明顯，因此采用LowCross-buffer作為血清樣本稀釋液。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，計(jì)算時(shí)扣除本底，以此來(lái)減少非特異性結(jié)合的干擾。有研究結(jié)果顯示，HCC患者血清AAG巖藻糖基化和唾液酸水平升高[16，26]。本研究結(jié)果顯示，HCC患者血清DSA-AAG水平高于疾病對(duì)照組和正常對(duì)照組（P＜0.001），癌癥組血清DSA-AAG水平高于非癌癥組（P＜0.001）。因此，AAG多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的改變與肝癌的發(fā)生可能具有潛在聯(lián)系。HCC患者血清DSA-AAG水平高于ICC患者（P＜0.001），提示DSA-AAG的產(chǎn)生可能與腫瘤細(xì)胞的來(lái)源也具有一定的關(guān)系。MEHTA等[27]的研究結(jié)果顯示，肝癌組織中DSA結(jié)合的三、四天線結(jié)構(gòu)的糖鏈水平顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。本研究結(jié)果還顯示，不同腫瘤大小和分期的HCC患者之間血清DSA-AAG水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，DSAAAG可能與腫瘤的進(jìn)展、侵襲等生物學(xué)行為無(wú)關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，DSA-AAG、AAG和AFP的聯(lián)合檢測(cè)模型LogitAAG1對(duì)鑒別診斷HCC與非HCC具有較高的價(jià)值。本研究中AFP陰性的HCC患者占HCC患者的40.9%。目前，AFP陰性的HCC患者尚缺乏可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，AFP陰性HCC組血清DSAAAG水平顯著高于非癌癥組（P＜0.001），DSAAAG、Alb與TB的聯(lián)合檢測(cè)模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的AUC達(dá)0.929，這為AFP陰性HCC的鑒別診斷提供了一個(gè)較好的血清學(xué)診斷指標(biāo)。

本研究采用Lectin-ELISA檢測(cè)血清DSAAAG水平，結(jié)果顯示HCC患者血清DSA-AAG水平顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)室前期基于DNA測(cè)序儀的熒光糖電泳得到的HCC患者血清N-糖鏈結(jié)構(gòu)圖譜一致，圖譜中代表多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的峰值顯著升高[25]。HCC患者血清多天線糖蛋白水平升高可能與肝癌組織中合成多天線結(jié)構(gòu)相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶升高，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞分泌的蛋白糖鏈分枝增加有關(guān)[28]，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，DSA-AAG及聯(lián)合檢測(cè)模型對(duì)HCC以及AFP陰性HCC的鑒別診斷可能有一定價(jià)值。但現(xiàn)階段的研究缺乏獨(dú)立驗(yàn)證及跟蹤隨訪數(shù)據(jù)，因此尚不能評(píng)估以上指標(biāo)在治療前、后的變化情況及在預(yù)后判斷中的價(jià)值。此外，由于標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏，現(xiàn)階段暫時(shí)難以進(jìn)行Lectin-ELISA靈敏度及準(zhǔn)確性的相關(guān)研究，這也是Lectin-ELISA的局限所在，因此該方法還有很大的改善空間。后續(xù)將依托上海東方肝膽外科醫(yī)院多中心分子診斷合作平臺(tái)進(jìn)一步收集各期HCC患者術(shù)后的血清樣本，完善跟蹤隨訪數(shù)據(jù)，并進(jìn)行多中心驗(yàn)證，為后續(xù)的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。