自制Sephadex-G50微柱凝膠卡在布魯菌血清凝集試驗中的應(yīng)用價值

李 艷， 耿慧娟， 邱思遠， 王向華， 王 浩

（保定市人民醫(yī)院檢驗科，河北 保定 071000）

布魯菌病是由布魯菌（Brucella）感染引起的人畜共患性疾病[1]，一般通過患病動物傳播并感染給人類，主要集中在地中海地區(qū)、亞洲地區(qū)和發(fā)展中國家流行。目前，這些地方的布魯菌病仍然是一個涉及人類健康的、較嚴重的地方病[2-3]。我國目前仍以簡單而廉價的試管凝集試驗作為明確診斷布魯菌病最重要的確證試驗之一[4]，然而試管凝集試驗操作繁瑣、試驗時間長、結(jié)果判讀困難且存在主觀差異[5]。微柱凝膠技術(shù)是紅細胞血型血清學(xué)檢測新方法，具有操作簡便、試驗時間短、結(jié)果判讀清晰客觀、易于標準化和自動化等優(yōu)點[6]。本研究創(chuàng)新性地將微柱凝膠技術(shù)應(yīng)用于布魯菌病的血清凝集試驗中，取得了較好的效果。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集保定市人民醫(yī)院布魯菌病門診以發(fā)熱、乏力、關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀的布魯菌病疑似患者血清樣本160份，陽性質(zhì)控血清和陰性質(zhì)控血清購自西班牙Linear公司。

1.2 主要儀器及試劑

布魯菌染色菌懸液（西班牙Linear公司）、多道電子加樣槍（美國Thermo Scientific公司），LB-3000型血型血清學(xué)多用離心機（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司），12 mm×100 mm規(guī)格小試管、U型塑料微孔板（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司），0.85% NaCl溶液（石家莊四藥有限公司）。

1.3 自制3種微柱凝膠卡

分別稱取3種不同類型（G50-Superfine、G50-Fine、G50-Medium，特性區(qū)別見表1）Sephadex-G50凝膠（美國GE公司）干粉各1 g，放入20 mL無菌0.85% NaCl溶液中充分混勻，室溫泡發(fā)24 h（泡發(fā)好的交聯(lián)葡聚糖凝膠顆粒為近圓球形，可以自然沉淀到0.85% NaCl溶液底部）。利用輸血科使用過的微柱凝膠抗篩卡（北京樂普公司），將內(nèi)容物用流水去除，將微柱凝膠抗篩卡洗凈、晾干后備用。采用微量加樣槍吸取上述3種泡發(fā)好的、不同規(guī)格的凝膠顆?；鞈乙杭尤肟瞻孜⒅磻?yīng)卡中（每管25 μL），然后將微柱凝膠卡放入專用血型血清學(xué)離心機中，700×g離心3 min，去除凝膠混懸液中含有的氣泡后，貼好標簽備用。

表1 不同類型Sephadex-G50凝膠干粉的特性

1.4 試驗方法及判定標準

1.4.1 試管凝集試驗 按試劑說明書進行操作，以0.85% NaCl溶液作為稀釋液，在小試管中將160份實驗血清以1∶25～1∶800倍比稀釋，然后向每個小試管中滴加50 μL布魯菌染色菌懸液，使菌懸液的最終稀釋度為1∶20倍，充分混勻后37 ℃孵育24 h后，肉眼檢查凝集情況，并判定結(jié)果。

1.4.2 微柱凝集試驗 用0.85% NaCl溶液將布魯菌染色菌懸液原液稀釋10倍制備工作菌懸液。用0.85% NaCl溶液在U型微孔板中將實驗血清按1∶12.5～1∶400進行2倍比稀釋，每孔液體量為50 μL。將50 μL工作菌懸液加入各孔稀釋血清中，并充分混勻，于37 ℃溫箱孵育20 min后，將其加入自制的微柱凝膠卡，然后立即使用血型血清學(xué)離心機700×g離心20 min。當(dāng)抗原抗體反應(yīng)時，細菌會發(fā)生凝集，在一定的離心力作用下，凝集的藍色細菌顆粒不能通過凝膠間隙，被截留在凝膠表層或分散在凝膠當(dāng)中；而未凝集的藍色細菌在離心力的作用下，可通過凝膠間隙沉積于凝膠管的底部。

1.4.3 結(jié)果判定 參考文獻[6-7]進行結(jié)果的判讀。如果血清中不存在特異性抗體，藍色布魯菌抗原會沉淀到微柱凝膠卡底部，判斷為陰性；當(dāng)血清中存在特異性抗體時，藍色抗原和抗體可形成復(fù)合物，離心后仍保留在凝膠上方，判定為陽性。見圖1。

圖1 微柱凝集試驗結(jié)果示意圖

1.5 質(zhì)量控制

為驗證系統(tǒng)的有效性，并判讀結(jié)果，每批次試驗均同時檢測陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

以試管凝集試驗的結(jié)果為金標準，采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算微柱凝集試驗的敏感性、特異性、假陰性率、假陽性率、約登指數(shù)及符合率，一致性檢驗采用Kappa檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3種自制微柱凝膠卡試驗結(jié)果

3種自制微柱凝膠卡中，B卡（G50-Fine）試驗結(jié)果最好，各項評價指標均達到非常滿意的程度；A卡（G50-Super fine）特異性為81.72%、假陽性率為18.28%，結(jié)果較差；C卡（G50-Medium）的敏感性為46.27%、假陰性率為53.73%、Kappa值為0.50，結(jié)果非常不理想。見表2。

表2 3種自制微柱凝膠卡血清凝集試驗結(jié)果評價

2.2 3種自制微柱凝膠卡與試管凝集試驗結(jié)果比較

與試管凝集試驗結(jié)果比較，A卡有60份（37.5%）結(jié)果分布在箭頭線上，100份結(jié)果分布在箭頭線上方；B卡有146份（91.25%）結(jié)果分布在箭頭線上，1份結(jié)果分布在箭頭線上方，13份結(jié)果分布在箭頭線下方；C卡有62份（38.75%）結(jié)果分布在箭頭線上，98份結(jié)果分布在箭頭線下方；B卡的試驗結(jié)果與試管凝集試驗結(jié)果的相關(guān)性最好。見圖2。

圖2 3種自制微柱凝膠卡和試管凝集試驗血清凝集滴度測定結(jié)果比較

3 討論

葡聚糖凝膠是一種由葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的球形凝膠。1959年，美國法瑪西亞公司就開始制造葡聚糖凝膠，主要利用其分子篩作用，通過凝膠過濾及離子交換色譜分析，進行多肽分離、脫鹽、清洗生物提取液、相對分子質(zhì)量測定等[8]。1990年，LAPIERRE等[9]介紹了一種采用葡聚糖凝膠檢測紅細胞抗原抗體反應(yīng)的新技術(shù)，目前這種微柱凝膠免疫檢測技術(shù)主要在紅細胞血型血清學(xué)檢測中常規(guī)使用。從微柱凝膠免疫檢測技術(shù)的原理、本質(zhì)、特點、優(yōu)點及其在臨床免疫實驗診斷很多方面的需要來看，微柱凝膠免疫檢測技術(shù)不僅能用于紅細胞血型抗原抗體檢測，還可應(yīng)用于細菌、病毒等致病微生物的抗原抗體檢測。

本研究團隊前期在使用商品化血型血清學(xué)微柱凝膠卡（北京樂普公司）的研究基礎(chǔ)上，采用不同型號的進口葡聚糖凝膠干粉研制專用于布魯菌血清凝集試驗的微柱凝膠卡。將3種進口凝膠干粉制備的不同微柱凝膠卡（A卡、B卡和C卡）與金標準試管凝集試驗結(jié)果進行同期比對，結(jié)果表明：（1）采用G50-Fine干粉制備的A卡，試驗敏感性高達100%，假陰性率為0，采用A卡進行凝集試驗?zāi)鼙ＷC將所有真陽性標本檢測出來；但A卡的不足在于特異性只有81.72%，即其檢出的陽性結(jié)果有18.28%為假陽性；此外，A卡還有62.5%的試驗結(jié)果與試管凝集試驗的凝集滴度比對結(jié)果不理想，超過了試管凝集試驗1～3個2倍稀釋度。（2）采用G50-Medium制備的C卡雖然特異性達100%，能夠?qū)⒄骊幮越Y(jié)果全部檢測出來，但是其敏感性僅為46.27%，假陰性率為53.73%、約登指數(shù)為0.46、Kappa值為0.5，均不理想，此外還有61.25%的試驗結(jié)果的凝集滴度低于金標準1～3個2倍稀釋度。（3）采用G50-Fine干粉制備的B卡敏感性達到95.52%，假陰性率僅為4.48%，稍遜于A卡，遠優(yōu)于C卡；且其特異性達94.62%，假陽性率為5.38%，稍遜于C卡，遠優(yōu)于A卡；也就是說，B卡既具備A卡的高敏感性，同時也具備C卡的高特異性，可靠性評價分值在3種卡中最高，且B卡所得的試驗結(jié)果中有91.25%的滴度和試管凝集試驗的滴度一致。綜合上述結(jié)果來看，我們認為在和試管凝集試驗的比對中，不論是陰性結(jié)果，還是陽性結(jié)果，在凝集滴度方面，B卡的試驗結(jié)果都是3種卡中最優(yōu)秀的。

單純就本研究達到的最佳檢測效能來說，在試驗過程中我們還可以采取聯(lián)合檢測的策略：可以先將所有樣本用A卡檢出其中的陽性標本，然后再將檢出的陽性標本用C卡來排除陰性，這樣剩余的陽性標本則是假陽性率和假陰性率均為0的試驗結(jié)果，然后所有被排除的樣本再用B卡檢測其陰性、陽性。但在臨床實驗室中，由于標本量大、試驗人員少、檢測成本高等因素，使其實現(xiàn)起來較為困難。

3種自制凝膠卡試驗結(jié)果的差異主要是由于3種原料干粉泡發(fā)后形成的球形凝膠的直徑不同造成的，球形凝膠的直徑與球形凝膠間形成的間隙大小呈正相關(guān)，凝膠直徑越大，間隙就越大，凝膠直徑越小，間隙就越小[10]。3種原料干粉中G50-Superfine泡發(fā)后直徑最小（20～50 μm），則其球形凝膠間形成的間隙最小；G50-Medium泡發(fā)后直徑（50～150 μm）在3種凝膠中最大，則其凝膠間隙也最大；G50-Fine泡發(fā)后直徑（20～80 μm）介于另2種凝膠的之間，則間隙G50-Super fine＜間隙G50-Fine＜間隙G50-Medium。

微柱凝膠免疫檢測技術(shù)應(yīng)用在布魯菌血清凝集試驗的核心原理是利用球形凝膠形成的間隙，合理地把布魯菌抗原與其特異性抗體結(jié)合形成的凝集顆粒截留在凝膠的表層。本研究結(jié)果表明，以G50-Fine干粉制備的凝膠間隙大小最適合做凝集顆粒的截留，因此B卡的實驗結(jié)果和金標準相比最好；A卡的凝膠間隙相對偏小，造成一些較小的凝集顆粒也被截留，因此其假陽性率提高到了18.28%；C卡凝膠間隙太大，和布魯菌血清凝集試驗形成的顆粒大小不匹配，無法截留形成的凝集顆粒，因此評價指標都不理想。

以G50-Fine干粉制備的B卡雖然取得了令人滿意的結(jié)果，但其在截留試管凝集試驗為1∶25～1∶100凝集滴度的血清樣本時，其結(jié)果的相關(guān)性和金標準比較相對較差，這主要是由于當(dāng)血清中特異性抗體滴度較低時，抗原抗體反應(yīng)中比例失調(diào)過大，抗原抗體結(jié)合形成的凝集顆粒相對較小[11]，造成凝膠間隙無法截留這部分凝集顆粒。這是本研究中沒有解決的問題，下一步我們擬用添加表面活性劑的緩沖溶液來取代本研究中采用的0.85% NaCl溶液，作為凝膠的泡發(fā)溶液，以降低凝膠的表面張力，同時提高凝膠溶液的浮力，來提高微柱凝膠卡對低凝集滴度血清的檢測能力。

總之，以G50-Fine凝膠干粉制備的微柱凝膠卡非常適用于布魯菌血清凝集試驗，具有試驗結(jié)果易于判定、準確可靠、試驗用時較短等優(yōu)點，在臨床中具有很好的應(yīng)用價值。