黃連素體外抗川崎病兒童血小板聚集作用的探討

劉云鋒， 鄭 浩， 車 迪， 皮 蕾， 付蘭燕， 顧曉瓊

（1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗科，廣東 廣州 510623；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心標(biāo)本庫，廣東 廣州 510623）

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種以全身中、小動脈炎癥性病變?yōu)橹饕卣鞯募毙园l(fā)熱性疾病，可累及冠狀動脈引起冠狀動脈擴(kuò)張和動脈瘤，流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，近年來亞洲地區(qū)KD的發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。KD主要的病理特征為血液高黏、高聚、高凝，血小板（platelet，PLT）大量聚集并引起血栓栓塞[3]，是我國小兒后天性心臟病的主要原因之一。目前臨床上常以阿司匹林作為該病抗PLT聚集的藥物，但有研究結(jié)果顯示，部分患者會出現(xiàn)藥物抵抗、并發(fā)冠狀動脈損傷及黏膜損傷或消化道出血等不良癥狀[4]。近年來，黃連素（berberine，BB）作為中國傳統(tǒng)中藥，其抗PLT聚集的功能引起了人們的重視。BB能降低二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、膠原和花生四烯酸誘導(dǎo)的PLT血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的釋放，能明顯地抑制PLT激活因子（platelet activating factor，PAF）途徑[5]，從而抑制PLT聚集。除此之外，有臨床研究結(jié)果表明，BB能改善同樣具有血液高黏、高聚等血液流變學(xué)改變的2型糖尿病，降低其血漿黏度、減少紅細(xì)胞和PLT聚集[6]。然而，BB是否能改善KD患者PLT聚集情況，尚未見文獻(xiàn)報道。本研究通過體外實驗，觀察BB能否降低KD患兒PLT聚集率，為BB用于KD的抗栓治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年8月—2019年8月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心心血管科確診的71例KD患兒作為KD組，其中男45例、女26例，年齡（2.81±1.22）歲；另選取同期在兒童保健科就診的71名健康兒童作為對照組，其中男49例、女22例，年齡（2.48±1.31）歲。2組研究對象年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。KD患兒均采用2004年美國心臟協(xié)會制定的診斷指南[7]確診，所有患兒均排除腺病毒感染、EB病毒感染、藥物過敏綜合征、Stevens-Johnson綜合癥、猩紅熱等發(fā)熱性疾病。對照組兒童均排除既往KD病史、感染性疾病、心血管疾病、阿司匹林過敏癥、PLT減少癥等。

1.2 方法

采集所有研究對象全血并用乙二胺四乙酸抗凝，110×g離心5 min，分離上層富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）。取500 μL PRP并加入等量0.9%氯化鈉溶液后混勻，110×g離心5 min，洗滌1次后棄去上清，加入500 μL 0.9%氯化鈉溶液重懸并調(diào)節(jié)PLT濃度為（100～300）×109/L。加入0.025 mol/L氯化鈣15 μL混勻，靜置30 min待測。運行PLT聚集儀（美國Helena Laboratories公司），取靜置后的待測標(biāo)本分成2份，每份各200 μL。使用0.9%氯化鈉溶液對儀器進(jìn)行空白校準(zhǔn)。校準(zhǔn)完成后其中1份加入二甲基亞砜25 μL，另一份加入5 mg/mL BB 25 μL，37 ℃溫浴3 min后，迅速加入5 μmol/L ADP（美國Helena Laboratories公司）25 μL開始測定，使用PLT聚集儀繪制PLT聚集曲線并獲得最大聚集率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。呈偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗。樣本間計數(shù)資料比較采用配對t檢驗分析。年齡、性別等計量資料的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗條件選擇

對不同離心速度（90、110、130×g）和不同離心時間（5、8、10、15 min）進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，110×g離心5 min所得PRP的PLT濃度最高。見表1。

2.2 BB濃度選擇

選擇10例健康體檢者標(biāo)本，分別加入二甲基亞砜及不同濃度BB（0、2.5、5.0、10.0 mg/mL）各25 μL后測定PLT最大聚集率。結(jié)果顯示，當(dāng)BB濃度為0、2.5、5.0、10.0 mg/mL時，PLT最大聚集率分別為32.1（27.0～37.8）%、21.6（15.3～23.4）%、11.2（9.0～18.3）%、 10.7（8.1.0～17.4）%，因此選取5 mg/mL為BB最適實驗濃度。

2.3 BB對PLT聚集率的影響

KD組和對照組的PLT最大聚集率均下降，2組樣本添加BB前、后PLT聚集率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 添加BB前、后PLT聚集率比較 %，±s

表2 添加BB前、后PLT聚集率比較 %，±s

注：與添加BB前PLT聚集率比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) 加BB前 加BB后 t值 P值對照組 71 26.25±3.32 10.32±2.11* 9.523 ＜0.05 KD組 71 18.32±2.51 6.23±1.59*10.987 ＜0.05

3 討論

KD是一種以全身小動脈炎為病理改變的疾病，多發(fā)于嬰幼兒及兒童，絕大多數(shù)患者經(jīng)過丙種球蛋白治療后可逐漸轉(zhuǎn)歸，預(yù)后良好。但15%～30%的患者可侵犯冠狀動脈，嚴(yán)重者可并發(fā)冠狀動脈瘤破裂、心肌梗死等，是兒童后天性心臟病的主要原因[7]。KD患者由于免疫功能異常，在炎性因子作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激，內(nèi)皮下的膠原組織暴露，誘導(dǎo)血液中的PLT及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞黏附于暴露的膠原纖維上；同時PLT發(fā)生形態(tài)變化，貯存于致密顆粒內(nèi)的ADP及5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）被釋放，進(jìn)一步促使PLT聚集。由于血液長期處于高凝高聚狀態(tài)，容易形成血栓引起冠狀動脈嚴(yán)重狹窄和閉塞，甚至?xí)纬晒跔顒用}瘤，危害兒童健康。

阿司匹林是目前最主要的治療K D的抗栓藥物，主要通過抑制P LT環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）乙酰化，阻止花生四烯酸（arachidonic acid，AA）轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎丨h(huán)內(nèi)過氧化物，阻斷TXA2生成[8]，從而達(dá)到抗PLT聚集的目的。但阿司匹林治療存在個體差異，少數(shù)個體使用阿司匹林后低反應(yīng)或無反應(yīng)，也有報道稱長期大劑量服用阿司匹林，以及在服用阿司匹林藥物時感染水痘或流感病毒的患兒發(fā)生瑞氏綜合征的風(fēng)險較其他兒童高[9]。由于阿司匹林抗栓治療存在局限性，所以臨床上需要有其他藥物協(xié)助阿司匹林一同改善KD患兒PLT聚集情況。

BB是從毛茛科黃連植物根狀莖中提取的一種植物生物堿，以前主要用于治療腸道炎癥伴發(fā)熱。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，BB具有明顯的抗腫瘤及抗2型糖尿病的作用[6]。另有研究結(jié)果顯示，BB是一種具有抑制凝血酶誘導(dǎo)PLT活性的直接凝血酶抑制劑[10]。BB主要通過降低TXA2、提高環(huán)磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）含量來調(diào)節(jié)PLT聚集的第二信使Ca2+，使Ca2+從致密小管載出減少，抑制PLT釋放功能。cAMP含量增高能夠抑制磷酯酶A的活化，從而通過抑制PAF途徑[5]，達(dá)到抗PLT聚集的目的。有研究結(jié)果表明，BB聯(lián)合其他常規(guī)藥物能更有效地抑制PLT聚集[11]。

本研究通過體外實驗，比較加入BB前、后KD組和對照組PRP PLT聚集率的變化，初步探討B(tài)B是否具有抗KD患兒PLT聚集的作用。實驗結(jié)果表明，使用110×g離心5 min制備PRP，體外加入5 mg/mL BB溶液進(jìn)行預(yù)處理為最適反應(yīng)條件。本研究結(jié)果顯示，對照組和KD組PRP體外經(jīng)BB溶液處理后，PLT聚集率均比處理前有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而且經(jīng)BB處理后KD組PLT聚集率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明BB在體外能有效發(fā)揮抗PLT聚集作用。本研究中KD組基礎(chǔ)PLT聚集率為（18.32±2.51）%，比正常組PLT聚集率[（26.25±3.32）%]低，這可能是由于本實驗使用的KD患兒標(biāo)本均是在患兒確診并使用阿司匹林抗栓治療后收集的，導(dǎo)致KD組基礎(chǔ)PLT聚集率比對照組低。然而即便如此，加入BB后，對照組與KD組PLT聚集率仍明顯降低，由此推測，BB和阿司匹林可能在抗栓治療上有協(xié)同作用。

由于本研究樣本量小，未能進(jìn)行深入研究，也未進(jìn)行相關(guān)動物實驗驗證，希望今后進(jìn)一步驗證BB在KD患兒抗栓治療中的作用，降低KD患兒血栓形成風(fēng)險提供參考。