關(guān)節(jié)康片調(diào)控白細(xì)胞介素6表達(dá)促進(jìn)膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)的機(jī)制及相關(guān)生物標(biāo)志物的測(cè)定

曹厚然， 馮文俊， 陳昭， 曾意榮

（1.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510095）

膝關(guān)節(jié)損傷的修復(fù)通常根據(jù)患者傷情采取不同的方法[1-4]，其中包括藥物保守治療、修復(fù)性治療以及重建治療等。但修復(fù)性治療和恢復(fù)性訓(xùn)練一定程度上可影響患者的日常工作生活，手術(shù)治療包括膝關(guān)節(jié)鏡檢或全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)后，存在膝關(guān)節(jié)炎加重及假體周?chē)腥镜娘L(fēng)險(xiǎn)，需使用抗生素控制感染，甚至需行二次翻修手術(shù)，進(jìn)一步增加了患者的負(fù)擔(dān)[5-7]。

膝關(guān)節(jié)損傷屬于中醫(yī)學(xué) “筋傷”“骨痹” 的范疇。中醫(yī)治療膝關(guān)節(jié)損傷，可依據(jù)辨證分型，重視整體觀念，調(diào)節(jié)全身氣血運(yùn)行，緩解局部血液循環(huán)，扶助正氣，祛除外邪，達(dá)到身體的陰陽(yáng)平衡，促進(jìn)損傷的修復(fù)[8-10]。關(guān)節(jié)康片是本院骨科常用的院內(nèi)制劑，既往臨床觀察與實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該制劑對(duì)包括膝關(guān)節(jié)損傷、膝骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的骨傷具有較好的促進(jìn)恢復(fù)作用[11-16]。然而，目前對(duì)于該恢復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法較為簡(jiǎn)單，尚缺乏科學(xué)、系統(tǒng)、深入和可準(zhǔn)確量化的評(píng)價(jià)方法。既往文獻(xiàn)報(bào)道膝關(guān)節(jié)發(fā)生損傷時(shí)，損傷部位和血液中白細(xì)胞介素6（IL-6）水平發(fā)生顯著變化[10，17-19]，故我們推測(cè)觀察關(guān)節(jié)康片干預(yù)后機(jī)體IL-6 的變化情況，能夠從分子生物學(xué)水平闡釋該制劑的功效機(jī)制。認(rèn)為該靶標(biāo)除可作為腫瘤標(biāo)記物外，也對(duì)機(jī)體多種異常狀態(tài)和炎癥反應(yīng)起到準(zhǔn)確的標(biāo)示作用，換言之，當(dāng)膝關(guān)節(jié)損傷這種異常狀態(tài)存在的情況下，IL-6 水平可能也會(huì)產(chǎn)生顯著變化，研究這種變化，對(duì)明確相關(guān)治療機(jī)制具有重要的科學(xué)意義[20-22]。同時(shí)，IL-6水平發(fā)生改變時(shí)，血液和體液內(nèi)存在的多種炎癥因子水平也會(huì)發(fā)生顯著變化，這些炎癥因子則可作為指標(biāo)性成分，用于建立關(guān)節(jié)康片促進(jìn)膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)功效評(píng)價(jià)的標(biāo)志物?；诖思僬f(shuō)，進(jìn)行如下研究：

1 材料

1.1動(dòng)物SPF 級(jí)昆明種小鼠30 只，雌雄各半，體質(zhì)量（20 ± 2）g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：440072000066136。于廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2015-0059。

1.2藥物、試劑與儀器關(guān)節(jié)康片，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制備，每片0.25 g。酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）活性篩選所用試劑盒購(gòu)自美國(guó)DPC 公司；LXB4（純度98%，批號(hào)：ZC-22879）、PGE1（純度98%，批號(hào)：ZC-20827）、（±）12-HETE（純度98%， 批號(hào)： ZC-22942）、±5（6）DiHET（純度98%，批號(hào)：ZC-23000）、PGE2（純度98%，批號(hào)：ZC-21245）等對(duì)照品購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；胡椒堿對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：110775-201706）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；ELISA 分析、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法分析和樣品處理所用二甲基亞砜（DMSO）、乙腈、甲醇、甲酸等試劑均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck 公司。Thermo-TSQ Quantum 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）儀，配備ESI 離子源、Accela 高壓泵-自動(dòng)進(jìn)樣器系統(tǒng)（美國(guó)Thermo- Fisher 公司）； 色譜柱為AgilentSB-C18（規(guī)格2.1 mm × 100 mm，粒徑2.7 μm，美國(guó)Agilent 公司）；Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo-Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 分組、造模與給藥 將30只小鼠分為空白對(duì)照組（6只）和造模組（24只）?？瞻讓?duì)照組，不進(jìn)行任何處理，給予正常飲食。造模組小鼠參考Fang等[1]的方法建立膝關(guān)節(jié)損傷小鼠模型：給予小鼠腹腔注射10 g/L 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，置于手術(shù)臺(tái)上，以0.2 mm 直徑鋼針穿刺，后取出鋼針，用酒精清洗傷口，止血夾止血30 min，注射青霉素（4 萬(wàn)單位），連續(xù)注射7 d。然后將這些造模小鼠分為模型對(duì)照組，關(guān)節(jié)康低、中、高劑量組，每組6 只。模型對(duì)照組止血并注射青霉素后，每日給予10 mL生理鹽水灌胃，關(guān)節(jié)康低、中、高劑量組每日給予450、900、1 800 mg/kg劑量（以藥片粉末質(zhì)量計(jì)，下同）的關(guān)節(jié)康溶液（藥片粉末溶于生理鹽水后濾過(guò)）灌胃，連續(xù)7 d。第8 天，將空白對(duì)照組小鼠全部處死，其余各組隨機(jī)選取3只處死。未處死動(dòng)物中，原屬模型對(duì)照組的小鼠繼續(xù)正常飼育（此設(shè)為模型對(duì)照觀察組），原給予低、中、高劑量關(guān)節(jié)康溶液的各給藥組停止給藥，正常飼育（此設(shè)為關(guān)節(jié)康低、中、高劑量觀察組），繼續(xù)觀察各組小鼠恢復(fù)狀況，以能正常行走者示恢復(fù)，記錄每只動(dòng)物恢復(fù)的時(shí)間，并在確認(rèn)恢復(fù)后處死動(dòng)物。

2.1.2 ELISA 法檢測(cè)小鼠血漿、膝關(guān)節(jié)勻漿IL-6含量 取各組小鼠血漿和膝關(guān)節(jié)勻漿液樣品，置于96 孔板中， 每組每個(gè)基質(zhì)3 孔， 參照IL- 6 ELISA試劑盒說(shuō)明方法處理。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定，以空白對(duì)照組為參比，計(jì)算相對(duì)表達(dá)值。所得結(jié)果代入SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)。2.1.3 IL-6 含量檢測(cè)結(jié)果 圖1 結(jié)果顯示：術(shù)后第8 天，模型對(duì)照組血漿和膝關(guān)節(jié)勻漿液IL-6 水平較空白對(duì)照組明顯升高（P ＜0.01），關(guān)節(jié)康各給藥組中，除低劑量組，其余2 組的IL-6 水平均較模型對(duì)照組顯著上升（P ＜0.01），且有劑量依賴(lài)性，同時(shí)血漿與膝關(guān)節(jié)勻漿液中IL-6 水平無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。

觀察至恢復(fù)的動(dòng)物中，IL-6 水平相較術(shù)后第8 天處死的相同方法處理組回落明顯（P ＜0.01），其結(jié)果同樣具有劑量依賴(lài)性，血漿與膝關(guān)節(jié)勻漿液中IL-6水平亦無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。

上述結(jié)果表明，關(guān)節(jié)康片可能通過(guò)調(diào)控體內(nèi)IL-6表達(dá)起到促進(jìn)膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)的功效。

圖1 各組小鼠血漿、膝關(guān)節(jié)勻漿IL-6含量比較（x ± s，n = 3）Figure 1 Comparison of IL-6 content in plasma and knee joint homogenate in various groups（x ± s，n = 3）

2.2 LC-MS測(cè)定IL-6相關(guān)炎癥因子根據(jù)研究[22-23]報(bào)道，我們選擇了LXB4等5個(gè)炎癥因子，建立了LC-MS 同時(shí)測(cè)定方法，并進(jìn)行生物樣品分析方法學(xué)考察。

2.2 .1 制備IL-6相關(guān)炎癥因子混合對(duì)照品溶液 取LXB4、 PGE1、（±）12- HETE、 ± 5（6）DiHET、PGE2 對(duì)照品，精密稱(chēng)定，置于同一容量為10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得各對(duì)照品含量均為100 μg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取血漿或膝關(guān)節(jié)勻漿液100 μL，置于Captiva ND 96 孔板（孔徑0.2 μm）中。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組每個(gè)基質(zhì)各6 孔，每孔精密加入300 μL 含100 ng/mL 胡椒堿（內(nèi)標(biāo)）的乙腈，封口后抽濾，濾液收集于接收盤(pán)中，封口膜密封，備用。

2.2.3 LC-MS 測(cè)定條件 使用ESI 離子源，正負(fù)離子同時(shí)掃描的選擇離子反應(yīng)模式（SRM），噴霧電壓3 500 V（正離子）/3 000 V（負(fù)離子），霧化室溫度350 ℃，離子傳輸管溫度300 ℃，鞘氣壓力30 psi，輔氣壓力10 psi，各待測(cè)炎癥因子的離子對(duì)、管徑補(bǔ)償（Tube Length Offset）電壓和碰撞能量（CE）見(jiàn)表1。色譜條件：使用Agilent SB-C18色譜柱，乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫。程序：0 ～1.5 min，5% ～5% A；1.5 ～2.0 min，5% ～100% A； 2.0 ～5.0 min， 100% ～100% A；5.0 ～5.5 min，100% ～5% A；5.5 ～7.5 min，5% ～5% A。進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃?；旌蠈?duì)照品和供試品的離子流圖見(jiàn)圖2。

表1 各炎癥因子及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜掃描參數(shù)Table 1 Mass scan parameters of various inflammatory factors and internal standard

圖2 各炎癥因子LC-MS離子流圖Figure 2 LC-MS ion current chromatograms for various inflammatory factors

2.2.4 炎癥因子測(cè)定方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性和靈敏度 取混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取適量至8個(gè)1.5 mL離心管中，加生理鹽水適量稀釋?zhuān)吹酶骰衔餄舛确謩e為2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL 的溶液。取上述溶液，按 “2.2.2” 項(xiàng)下方法進(jìn)行處理。按照“2.2.3”項(xiàng)下LC-MS 測(cè)定方法進(jìn)樣分析， 結(jié)果代入LC-Quan 軟件（美國(guó)Thermo-Fisher 公司）中。以峰面積比為橫軸x，濃度為縱軸y，所得各炎癥因子的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

為考察靈敏度，取對(duì)照品溶液，加生理鹽水逐級(jí)稀釋?zhuān)?“2.2.2” 項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按照“2.2.3” 項(xiàng)下LC-MS測(cè)定方法進(jìn)樣分析，至信噪比（S/N）＜10。 結(jié)果顯示， 各成分的最低定量限（LLOQ）在0.1 ～1.0 ng/mL 范圍內(nèi)。為便于考察，將LLOQ 樣品濃度統(tǒng)一定為1.0 ng/mL，平行制備6 份溶液，按照 “2.2.3” 項(xiàng)下LC-MS測(cè)定方法進(jìn)樣分析，記錄各待測(cè)物峰面積，計(jì)算回收率和回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，sR）。結(jié)果顯示，LLOQ樣品的平均回收率為88.79%～103.91%，sR為5.88%～14.24%。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

上述結(jié)果表明，本研究所建立的LC-MS 方法可在2 ～500 ng/mL 對(duì)各待測(cè)物進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，且靈敏度良好。

表3 線性與靈敏度Table 3 Linearity and sensitivity （n = 6）

2.2.4.2 精密度和準(zhǔn)確度 取混合對(duì)照品溶液，精密吸取適量至1.5 mL 離心管中，精密加入生理鹽水適量，配制成各炎癥因子含量分別為5、50、400 ng/mL的溶液，記為QC樣品，每個(gè)濃度平行制備6份。取上述樣品，按 “2.2.2” 項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按照 “2.2.3” 項(xiàng)下LC-MS 測(cè)定方法進(jìn)樣分析，記錄各待測(cè)物峰面積，計(jì)算回收率和回收率的sR。結(jié)果顯示，樣品的平均回收率為96.27% ～106.08%，sR為2.94% ～10.44%，表明本方法精密度和準(zhǔn)確度良好。具體結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.4.3 穩(wěn)定性考察 按 “2.2.4.2” 項(xiàng)下方法制備QC 樣品，共制備4 組，分別按如下方法處理：①常溫穩(wěn)定性：樣品置于常溫（25 ℃）8 h；②進(jìn)樣器穩(wěn)定性：樣品置于LC-MS自動(dòng)進(jìn)樣器中（溫度設(shè)置為4 ℃）2 h；③凍融穩(wěn)定性：樣品于-20 ℃凍存，取出融化，如此重復(fù)3 個(gè)循環(huán)；④長(zhǎng)期穩(wěn)定性：樣品于-20 ℃凍存30 d后，取出融化。上述各組樣品完成相應(yīng)處理后，按 “2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照 “2.2.3” 項(xiàng)下LC-MS 測(cè)定方法進(jìn)樣分析，記錄各待測(cè)物峰面積，計(jì)算回收率和回收率的sR。結(jié)果顯示，樣品的平均回收率為90.82% ～106.26%，sR為4.23% ～12.66%，表明本方法所制備的樣品穩(wěn)定性良好。具體結(jié)果見(jiàn)表5 ～表8。

表4 精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果Table 4 The detection results of precision and accuracy （ ± s，n = 6）

表4 精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果Table 4 The detection results of precision and accuracy （ ± s，n = 6）

化合物L(fēng)XB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標(biāo)示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測(cè)得濃度[ρ/（ng·mL-1）]4.999 ± 0.306 49.557 ± 4.338 404.158 ± 39.162 4.852 ± 0.409 51.531 ± 4.812 424.310 ± 35.026 4.985 ± 0.400 49.958 ± 1.471 424.310 ± 35.026 4.855 ± 0.507 48.135 ± 3.917 393.755 ± 23.613 4.996 ± 0.313 51.035 ± 5.317 405.169 ± 30.741回收率（p/%）99.98 99.11 101.04 97.04 103.06 106.08 99.69 99.92 106.08 97.10 96.27 98.44 99.91 102.07 101.29 sR/%6.11 8.75 9.69 8.42 9.34 8.25 8.02 2.94 8.25 10.44 8.14 6.00 6.27 10.42 7.59

2.2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 取混合對(duì)照品溶液，按“2.2.4.2” 項(xiàng)下各濃度，加甲醇稀釋制備QC 樣品，取所得溶液，按 “2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照 “2.2.3” 項(xiàng)下LC-MS 測(cè)定方法進(jìn)樣分析，記錄各待測(cè)物峰面積，計(jì)算回收率和回收率的sR。結(jié)果顯示，樣品的平均回收率為92.61%～106.73%，sR為4.67%～13.13%，表明樣品基質(zhì)對(duì)測(cè)定不存在明顯影響。具體結(jié)果見(jiàn)表9。

表5 常溫穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 5 The results of room temperature stability （ ± s，n = 6）

表5 常溫穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 5 The results of room temperature stability （ ± s，n = 6）

化合物L(fēng)XB4 PGE1（±）12-HETE± 5（6）DiHET PGE2標(biāo)示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測(cè)得濃度[ρ/（ng·mL-1）]4.966 ± 0.291 52.560 ± 5.017 406.960 ± 36.865 4.823 ± 0.354 48.293 ± 2.989 410.566 ± 32.424 4.748 ± 0.265 50.036 ± 3.997 410.210 ± 20.158 4.837 ± 0.236 48.549 ± 3.826 393.401 ± 29.262 5.003 ± 0.418 51.098 ± 4.930 386.905 ± 16.849回收率（p/%）99.32 105.12 101.74 96.45 96.59 102.64 94.96 100.07 102.55 96.73 97.10 98.35 100.06 102.20 96.73 sR/%5.87 9.54 9.06 7.33 6.19 7.90 5.57 7.99 4.91 4.87 7.88 7.44 8.35 9.65 4.35

表6 進(jìn)樣器穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 6 The results of bench-top stability（ ± s，n = 6）

表6 進(jìn)樣器穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 6 The results of bench-top stability（ ± s，n = 6）

化合物L(fēng)XB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標(biāo)示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測(cè)得濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.038 ± 0.480 48.200 ± 3.650 399.511 ± 26.548 4.972 ± 0.536 51.876 ± 3.666 401.854 ± 47.188 4.552 ± 0.227 48.461 ± 4.593 422.761 ± 28.709 4.743 ± 0.309 49.765 ± 5.019 407.941 ± 39.696 4.943 ± 0.432 52.936 ± 2.105 404.978 ± 39.477回收率（p/%）100.75 96.40 99.88 99.45 103.75 100.46 91.05 96.92 105.69 94.87 99.53 101.99 98.87 105.87 101.24 sR/%9.53 7.57 6.65 10.79 7.07 11.74 4.98 9.48 6.79 6.50 10.09 9.73 8.74 3.98 9.75

2.2.4.5 各組血漿與膝關(guān)節(jié)勻漿液中IL-6相關(guān)炎癥因子含量比較 取 “2.2.2” 項(xiàng)下制備的供試品溶液，按照 “2.2.3” 項(xiàng)下LC-MS 測(cè)定方法進(jìn)樣分析，記錄各待測(cè)物峰面積，計(jì)算含量并將含量結(jié)果代入SPSS 軟件中使用Student-T進(jìn)行檢驗(yàn)分析。結(jié)果顯示：在空白對(duì)照組與術(shù)后第8天處死的模型對(duì)照組中，各炎癥因子的含量存在明顯差異（P＜0.05 或P＜0.01）；術(shù)后第8 天處死的各給藥組中，除低劑量組外，其余2組炎癥因子含量均較模型對(duì)照組明顯下降（P＜0.05 或P＜0.01）。各觀察組的測(cè)定結(jié)果則與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；同一處理組中不同基質(zhì)的結(jié)果存在顯著性差異（P＜0.05），但變化趨勢(shì)基本相同。上述結(jié)果表明，本研究所選用的5個(gè)炎癥因子可以作為評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)損傷及關(guān)節(jié)康片在其中所起作用的生物指標(biāo)。具體結(jié)果見(jiàn)圖3。

表7 凍融穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 7 The results of freeze-thaw stability（ ± s，n = 6）

表7 凍融穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 7 The results of freeze-thaw stability（ ± s，n = 6）

化合物L(fēng)XB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標(biāo)示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測(cè)得濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.204 ± 0.578 49.476 ± 3.730 386.093 ± 38.184 5.083 ± 0.371 47.966 ± 5.115 412.592 ± 21.787 5.176 ± 0.464 49.728 ± 2.105 390.002 ± 41.237 4.976 ± 0.482 49.394 ± 3.608 403.609 ± 25.532 4.865 ± 0.345 46.815 ± 3.015 388.563 ± 35.582回收率（p/%）104.07 98.95 96.52 101.65 95.93 103.15 103.53 99.46 97.50 99.53 98.79 100.90 97.30 93.63 97.14 sR/%11.10 7.54 9.89 7.29 10.66 5.28 8.96 4.23 10.57 9.68 7.30 6.33 7.09 6.44 9.16

表8 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 8 The results of long-term stability （ ± s，n = 6）

化合物L(fēng)XB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標(biāo)示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測(cè)得濃度[ρ/（ng·mL-1）]4.951 ± 0.470 53.128 ± 3.227 381.295 ± 48.286 4.938 ± 0.381 50.389 ± 5.229 402.506 ± 26.958 4.957 ± 0.395 51.134 ± 3.026 397.357 ± 41.768 5.081 ± 0.463 49.947 ± 4.537 363.299 ± 30.095 4.884 ± 0.227 47.769 ± 5.028 408.560 ± 40.111回收率（p/%）99.02 106.26 95.32 98.75 100.78 100.63 99.14 102.27 99.34 101.62 99.89 90.82 97.67 95.54 102.14 sR/%9.50 6.07 12.66 7.71 10.38 6.70 7.96 5.92 10.51 9.10 9.08 8.28 4.64 10.53 9.82

表9 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果Table 9 The results of matrix effect （ ± s，n = 6）

表9 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果Table 9 The results of matrix effect （ ± s，n = 6）

化合物L(fēng)XB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標(biāo)示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測(cè)得濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.169 ± 0.662 49.475 ± 5.305 412.456 ± 19.250 5.132 ± 0.451 49.591 ± 2.847 425.809 ± 19.964 5.337 ± 0.378 50.113 ± 4.296 396.538 ± 52.049 5.243 ± 0.237 46.305 ± 2.259 425.273 ± 48.700 5.161 ± 0.415 48.330 ± 4.537 385.689 ± 37.530回收率（p/%）103.39 98.95 103.11 102.63 99.18 106.45 106.73 100.23 99.13 104.86 92.61 106.32 103.22 96.66 96.42 sR/%12.81 10.72 4.67 8.78 5.74 4.69 7.08 8.57 13.13 4.52 4.88 11.45 8.04 9.39 9.73

3 討論

關(guān)節(jié)康片是以熟地、補(bǔ)骨脂、杜仲、枸杞子、丹參、川芎、紅花等中藥配伍而成的制劑，旨在補(bǔ)腎壯骨，活血止痛，以治療膝骨關(guān)節(jié)炎等膝關(guān)節(jié)損傷疾患[11]。本研究結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)康片可明顯加速小鼠膝關(guān)節(jié)損傷的康復(fù)，縮短其恢復(fù)正常行走的時(shí)間。

圖3 各組血漿和膝關(guān)節(jié)勻漿液中IL-6相關(guān)炎癥因子含量比較（n = 6）（ ± s）Figure 3 Comparison of the contents of IL-6-related inflammatory factors in plasma and knee joint homogenate in various groups（n = 6）（ ± s）

IL-6 是參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨定向分化的重要調(diào)節(jié)因子，有研究表明，IL-6 與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān)[23-24]。本研究結(jié)果亦顯示，IL-6表達(dá)與膝關(guān)節(jié)損傷之間存在關(guān)聯(lián)性。當(dāng)機(jī)體發(fā)生膝關(guān)節(jié)損傷時(shí)，血漿與膝關(guān)節(jié)勻漿液IL-6 表達(dá)被激活，抑制膝關(guān)節(jié)損傷部位壞死；在手術(shù)后和自然修復(fù)過(guò)程中，IL-6 水平逐漸降低至正常；服用關(guān)節(jié)康片后，IL-6 水平出現(xiàn)上升，停藥后恢復(fù)正常。說(shuō)明該制劑可能通過(guò)刺激IL-6 釋放和在膝關(guān)節(jié)損傷部位富集促進(jìn)膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)，故認(rèn)為該指標(biāo)可以作為評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)損傷及修復(fù)的重要參考。

針對(duì)IL-6指標(biāo)，目前主要采用ELISA法或RTPCR法進(jìn)行測(cè)定，但此2種方法存在準(zhǔn)確度不夠的問(wèn)題，而基于該指標(biāo)成分的理化特性，目前尚無(wú)更為精密、準(zhǔn)確的儀器方法可對(duì)其進(jìn)行分析。為解決上述問(wèn)題，基于文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果[13-15]，筆者提出測(cè)定IL-6 相關(guān)體內(nèi)炎癥因子用于評(píng)價(jià)不同實(shí)驗(yàn)組IL-6水平的方法，所選取的指標(biāo)成分既有市售對(duì)照品，又可使用LC-MS 進(jìn)行同時(shí)、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定。

本研究選擇的5 個(gè)炎癥因子與體內(nèi)IL-6 水平密切相關(guān)。既往代謝組學(xué)研究結(jié)果[21]顯示，拔罐后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液和周?chē)つw組織中，上述內(nèi)源性代謝物水平明顯高于對(duì)照組。且這些成分均為文獻(xiàn)報(bào)道較多的調(diào)控炎癥脂質(zhì)介質(zhì)，在其水平顯著變化時(shí)，IL-6 水平也會(huì)隨之出現(xiàn)明顯變化，上述情況在病變/損傷部位尤為明顯[22-23]。因此選擇LXB4等5個(gè)炎癥因子作為本研究的療效評(píng)價(jià)指標(biāo)具有較好的科學(xué)性和針對(duì)性。

本研究對(duì)不同基質(zhì)（血漿、膝關(guān)節(jié)勻漿液）中各炎癥因子水平的測(cè)定結(jié)果表明，其變化趨勢(shì)基本相同。產(chǎn)生上述情況的原因，可能與損傷修復(fù)的機(jī)制有關(guān)，即可將損傷修復(fù)看作代謝反應(yīng)，血液則在其中扮演了中介和傳輸管道的作用，IL-6則通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)受體產(chǎn)生反應(yīng)。在臨床實(shí)踐中，由于患者膝關(guān)節(jié)組織和關(guān)節(jié)液取樣極為困難，血液中炎癥因子水平的指向性作用，可以大幅降低病程和療效評(píng)價(jià)的難度，實(shí)現(xiàn)對(duì)治療全過(guò)程更為精準(zhǔn)的把控。

綜上所述，本研究闡釋了血漿與膝關(guān)節(jié)勻漿液中的IL-6 水平與膝關(guān)節(jié)損傷及其修復(fù)的關(guān)聯(lián)性，并以此說(shuō)明了關(guān)節(jié)康片促進(jìn)膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)的機(jī)制。同時(shí)通過(guò)測(cè)定IL-6 相關(guān)炎癥因子探討了產(chǎn)生這一機(jī)制的生物學(xué)基礎(chǔ)，并建立了快速、準(zhǔn)確、可量化的評(píng)價(jià)方法，可以為膝關(guān)節(jié)損傷和修復(fù)過(guò)程以及關(guān)節(jié)康片的功效評(píng)價(jià)提供研究經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)依據(jù)。