基于高通量測序探討健脾調(diào)肝飲對肥胖小鼠腸道菌群的影響

谷雨明， 王喆， 馮博

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，山東濰坊 261031；2.濰坊醫(yī)學(xué)院中醫(yī)教研室，山東濰坊 261031；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)2020級博士研究生，上海 200000；4.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，山東濟(jì)南 250014）

肥胖與糖尿病、高血壓病、高脂血癥等多種疾病密切相關(guān)?！读~刀》雜志中一項(xiàng)研究顯示我國肥胖人口已經(jīng)超越美國位居世界首位[1]。腸道菌群已經(jīng)成為肥胖發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。本課題組前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，健脾調(diào)肝飲可以有效降低體質(zhì)量、減少白色脂肪堆積[2-5]。為進(jìn)一步闡明健脾調(diào)肝飲的作用靶點(diǎn)，本研究從腸道菌群角度探討其對肥胖的可能作用機(jī)制，以期為健脾調(diào)肝飲的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及飼料40 只普通雄性C57BL/6J小鼠，4周齡，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供，動物質(zhì)量合格證編號： SCXK（魯）20140007。造模所用的高脂飼料（具體成分按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比：62.8%基礎(chǔ)飼料、10%蛋黃粉、12%豬油、5%蔗糖、5%奶粉、5%花生、0.2%膽鹽），購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。普通基礎(chǔ)飼料，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2藥物、試劑與儀器健脾調(diào)肝飲（由生黃芪30 g，柴胡12 g，茯苓15 g，丹參15 g，炒薏苡仁15 g，炒白芍15 g，決明子15 g，佩蘭15 g，澤瀉12 g，大黃6 g，山楂12 組成）中藥材購自山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院。水煎制備，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸二甲雙胍片，由北京京豐藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H11021518。電子天平（珠恒電子有限公司）；灌胃針、注射器、離心管、蒸餾水、液氮罐等（山東省千佛山醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心提供）。

1.3動物分組與肥胖模型復(fù)制40只小鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)挑選8只小鼠作為正常對照組，繼續(xù)給予普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余32 只小鼠為造模組，給予喂食高脂飼料。所有小鼠造模期間自由飲水。喂養(yǎng)12 周后，造模組小鼠體質(zhì)量大于正常對照組平均體質(zhì)量的20%，且大于± 1.96 標(biāo)準(zhǔn)差，認(rèn)為造模成功；如小鼠體質(zhì)量未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)或體質(zhì)量增長緩慢，認(rèn)為有肥胖抵抗，予以剔除[6]。最終造模成功的小鼠23只，造模成功率為71.875%。選取合格的模型小鼠，按照體質(zhì)量均一的原則隨機(jī)分為模型對照組、二甲雙胍組、健脾調(diào)肝飲組，組間及組內(nèi)動物分別作標(biāo)記。

1.4給藥方式及治療參考徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]，二甲雙胍組小鼠給予二甲雙胍19 mg/6 mL/kg 灌胃，健脾調(diào)肝飲組小鼠給予健脾調(diào)肝飲12 g/6 mL/kg 灌胃，正常對照組、模型對照組小鼠給予蒸餾水6 mL/kg/次灌胃。每天8∶00及16∶00各灌胃1次，連續(xù)5周。

1.5腸道菌群測序流程

1.5.1 樣本收集 末次給藥后，隨機(jī)從每組選取3只小鼠，分別單獨(dú)放入剛剛高溫高壓滅菌的小鼠籠中。用一次性無菌鑷子，收集各個(gè)小鼠新鮮的糞便標(biāo)本，儲存于高溫蒸汽消毒滅菌的離心管中，并存放于液氮罐中，于-80 ℃冰箱凍存。直到全部收集完成，放入干冰運(yùn)輸箱中，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16SrDNA測序。

1.5.2 DNA 抽提和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增 按照E.Z.N.A.? soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進(jìn)行總DNA 抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。用338F（5’-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5.3 Illumina MiSeq測序 將PCR產(chǎn)物純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)文庫， 應(yīng)用Illumina 公司的MiSeq PE300平臺進(jìn)行測序，得到原始測序序列。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理及分析 將原始測序序列用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接，得到最終的序列。應(yīng)用STAMP 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間比較采用T檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠糞便菌群測序情況通過16SrDNA高通量測序，各組樣品PCR產(chǎn)物平均在300 ～500 bp之間，均為合格樣本。稀釋性曲線顯示隨著測序量的不斷增加，曲線趨向平坦，表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度足夠。見圖1。

圖1 各組合格樣本菌群稀釋性曲線Figure 1 Coverage curves of gut microbiota in qualified samples of various groups

2.2各組小鼠腸道菌群物種注釋與評估各組小鼠腸道菌群生物學(xué)分類情況：12 個(gè)糞便標(biāo)本共檢測出17 個(gè)門（phylum）、36 個(gè)綱（class）、72 個(gè)目（order）、118個(gè)科（family）、239個(gè)屬（genus）、372個(gè)種（species）的腸道菌群，總操作分類單元OTU 數(shù)為761個(gè)。詳見表1。

表1 各組小鼠腸道菌群生物學(xué)分類情況Table 1 The biological classification of gut microbiota in mice of various groups （n/個(gè)）

2.3樣本比較分析ANOSIM 分析各組間差異明顯大于組內(nèi)差異（P＜0.05），分組方式有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖2。

表2 分組ANOSIM分析統(tǒng)計(jì)值Table 2 ANOSIM analysis statistics

圖2 組間距離盒狀圖Figure 2 Box-plot for distance among inter-groups

2.4各組小鼠腸道菌群物種組成分析

2.4.1 物種維恩圖分析 在OTU水平上，各組間有共同之處，也存在一定差異。具體見圖3。

圖3 各組OTU水平維恩圖Figure 3 Venn diagram for OTU level in various groups

2.4.2 群落組成分析 在門水平上， 正常對照組、模型對照組、健脾調(diào)肝飲組群落分布都是以擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）為主，前2組擬桿菌門豐富度較高，健脾調(diào)肝飲組厚壁菌門豐度較高，二甲雙胍組以擬桿菌門、厚壁菌門及疣微菌門（Verrucomicrobia）豐富度高。此外， 正常對照組和健脾調(diào)肝飲組在放線菌門（Actinobacteria）上也有較高的豐富度，肥胖組則相對較低。見圖4。相應(yīng)的群落熱圖也展示出相應(yīng)的豐富度情況，見圖5。

圖5 各組腸道菌群門水平群落熱圖Figure 5 Community heatmap for phylum level of gut microbiota in various groups

2.5各組小鼠腸道菌群物種差異分析

2.5.1 多組間比較 在門水平上，各組腸道菌群物種在擬桿菌門、厚壁菌門上存在顯著性差異（P＜0.01）。見圖6。

圖6 4組腸道菌群門水平比較Figure 6 Comparison of phylum level of gut microbiota in the 4 groups

2.5.2 正常對照組與模型對照組比較 在門水平上，正常對照組與模型對照組腸道菌群物種間差異性不顯著（P＞0.05）；在科水平上，2 組腸道菌群在梭菌科_1（Clostridiaceae_1）存在顯著性差異（P＜0.01）。見圖7。

圖7 正常對照組與模型對照組腸道菌群科水平比較Figure 7 Comparison of family level of gut microbiota in the normal control group and model control group

2.5.3 二甲雙胍組與模型對照組比較 在門水平上，二甲雙胍組與模型對照組腸道菌群物種在疣微菌門、變形細(xì)菌門（Proteobacteria）上差異顯著（P＜0.01），在擬桿菌門上存在差異（P＜0.05）。見圖8。

圖8 二甲雙胍組與模型對照組腸道菌群門水平比較Figure 8 Comparison of phylum level of gut microbiota in the metformin group and model control group

2.5.4 健脾調(diào)肝飲組與模型對照組比較 在門水平上，健脾調(diào)肝飲組與模型對照組腸道菌群物種在擬桿菌門、厚壁菌門上差異性顯著（P＜0.01），在放線菌門上有顯著性差異（P＜0.05）。見圖9。

圖9 健脾調(diào)肝飲組與模型對照組腸道菌群門水平比較Figure 9 Comparison of phylum level of gut microbiota in SLP group and model control group

2.5.5 健脾調(diào)肝飲組與二甲雙胍組比較 在門水平上，健脾調(diào)肝飲組與二甲雙胍組腸道菌群物種在厚壁菌門、 疣微菌門上差異有顯著性（P＜0.01），在Unclassified_k__norank、擬桿菌門、放線菌門、 Tenericutes 上存在顯著性差異（P＜0.05）。見圖10。

圖10 健脾調(diào)肝飲組與二甲雙胍組腸道菌群門水平比較Figure 10 Comparison of phylum level of gut microbiota in the SLP group and metformin group

2.5.6 正常對照組與二甲雙胍組比較 在門水平上， 擬桿菌門、 疣微菌門上差異性顯著（P＜0.01）。見圖11。

圖11 正常對照組與二甲雙胍組腸道菌群門水平比較Figure 11 Comparison of phylum level of gut microbiota in the normal control group and metformin group

2.5.7 健脾調(diào)肝飲組與正常對照組比較 在門水平上，健脾調(diào)肝飲組與正常對照組腸道菌群物種在擬桿菌門、厚壁菌門上差異性顯著（P＜0.01）。見圖12。

3 討論

圖12 健脾調(diào)肝飲組與正常對照組腸道菌群門水平比較Figure 12 Comparison of phylum level of gut microbiota in the SLP group and normal control group

肥胖癥的病因復(fù)雜，既往關(guān)注點(diǎn)側(cè)重于運(yùn)動消耗、飲食攝入等方面。近年來研究顯示，腸道菌群異常與肥胖的發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)。人體腸道內(nèi)的微生物群被認(rèn)為是人體的第二基因組。寧光教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，與肥胖人群相比，正常人腸道菌群更加豐富，且肥胖人群腸道菌群中多形擬桿菌的含量明顯降低[8]。丹麥的研究者發(fā)現(xiàn)，本國的肥胖人群體內(nèi)腸道菌群的數(shù)量和多樣性明顯低于正常人群[9]。動物研究也顯示，肥胖宿主與正常宿主間的腸道菌群存在差異，移植了肥胖小鼠腸道微生物的無菌小鼠體脂含量顯著上升[10]?？梢哉J(rèn)為，腸道菌群紊亂是肥胖的重要致病因素。

目前，腸道菌群引起肥胖的作用機(jī)制尚未完全闡明。近年來腸道菌群對脂肪代謝的影響受到重視，“腸道菌群-脂肪” 信號軸（microbiota-fat signaling axis，MFSA）的概念[11-12]被提出?！澳c道菌群-脂肪” 信號軸的基本構(gòu)成包括腸道菌群、脂肪組織、相關(guān)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)等。“腸道菌群-脂肪” 信號軸各部分相互作用，形成了復(fù)雜的反饋性網(wǎng)絡(luò)，通過多途徑影響機(jī)體的脂肪代謝。越來越多的研究顯示 “腸道菌群-脂肪” 信號軸對白色脂肪棕色化有調(diào)控作用；還有研究顯示，將熱量限制方式干預(yù)的小鼠腸道菌群移植到肥胖小鼠體內(nèi)，可以明顯增強(qiáng)功能性棕色脂肪活性，考慮其與抑制Toll樣受體4（TLR4）通路有關(guān)[11]；另有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過腸道處理的無菌小鼠體內(nèi)AMP 活化的蛋白激酶（AMPK）活性增加，促進(jìn)肥胖小鼠腹股溝皮下和周圍臟器內(nèi)脂肪組織發(fā)生褐變[12-13]。故我們認(rèn)為可通過 “腸道菌群-脂肪” 信號軸調(diào)節(jié)腸道菌群以促進(jìn)白色脂肪棕色化，從而達(dá)到減肥的作用。

作為糖尿病診療指南的一線治療藥物，二甲雙胍不僅可以改善胰島素敏感，還具有減肥作用，其應(yīng)用于肥胖的治療展現(xiàn)出較好的療效及安全性[14-17]。本課題組前期研究選擇二甲雙胍作為陽性對照藥物，顯示其有減輕體質(zhì)量的作用，因此本次研究也選用二甲雙胍作為陽性對照藥物。

腸道菌群數(shù)據(jù)分析顯示，從OTU 數(shù)量上，正常對照組高于二甲雙胍組、模型對照組，健脾調(diào)肝飲組略高于正常對照組，其中，二甲雙胍組OTU 數(shù)量明顯減少，可見高脂飲食在一定程度上降低了小鼠腸道菌群的多樣性，二甲雙胍可顯著降低腸道菌群多樣性。在門水平上，正常對照組和模型對照組沒有顯著性差異，但是，在科水平上存在顯著性差異，這個(gè)結(jié)果和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)稍有差異，可能與樣本量過少有關(guān)；現(xiàn)有數(shù)據(jù)也提示高脂飲食可能通過改變小鼠腸道菌群的豐富度及多樣性導(dǎo)致肥胖的產(chǎn)生。在門水平上，二甲雙胍組腸道菌群的疣微菌門的豐富度明顯高于其他組，健脾調(diào)肝飲組腸道菌群厚壁菌門豐富度增高，擬桿菌門豐富度降低。表明二甲雙胍和健脾調(diào)肝飲對肥胖小鼠腸道菌群具有不同的調(diào)節(jié)作用，提示2種藥物減輕體質(zhì)量的機(jī)制不同。二甲雙胍雖然也具有很好的減輕體質(zhì)量作用，但是，存在腸道菌群豐富度及多樣性減低的風(fēng)險(xiǎn)，而健脾調(diào)肝飲在減輕小鼠體質(zhì)量的同時(shí)，可以更好地恢復(fù)肥胖小鼠腸道菌群的豐富度及多樣性。本課題組前期研究已表明，健脾調(diào)肝飲可減輕肥胖小鼠的體質(zhì)量，并可促進(jìn)白色脂肪棕色化[5]。再結(jié)合文獻(xiàn)研究，我們認(rèn)為健脾調(diào)肝飲可能通過調(diào)節(jié)肥胖小鼠腸道菌群，以此介導(dǎo) “腸道菌群-脂肪” 信號軸促進(jìn)白色脂肪棕色化，以達(dá)到減輕體質(zhì)量的作用。

綜上所述，本研究初步明確了健脾調(diào)肝飲與腸道菌群之間的聯(lián)系，進(jìn)一步豐富了 “腸道菌群-脂肪” 信號軸的科學(xué)內(nèi)涵，亦可為健脾調(diào)肝飲臨床應(yīng)用治療肥胖提供依據(jù)。在今后的研究中，我們有待應(yīng)用宏基因組測序、代謝組學(xué)等技術(shù)更深入地探究健脾調(diào)肝飲對腸道菌群及 “腸道菌群-脂肪” 信號軸的作用機(jī)制。