五味子素B增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251MG化療敏感性

劉紅艷， 張婷， 朱慧敏， 劉麗， 張曉東

（1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院腫瘤放療中心，湖北恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院腫瘤科，湖北恩施 445000）

膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤中最嚴(yán)重和侵襲性最強(qiáng)的一種[1]。替莫唑胺（temozolomide）應(yīng)用于臨床上新診斷的惡性膠質(zhì)瘤和復(fù)發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤的治療。替莫唑胺的臨床應(yīng)用是近10 年來(lái)惡性膠質(zhì)瘤化療的最大亮點(diǎn)，其聯(lián)合放療已成為膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[2-5]。替莫唑胺的治療機(jī)制主要是能有效地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]，然而，膠質(zhì)瘤細(xì)胞通常對(duì)替莫唑胺產(chǎn)生抵抗并降低替莫唑胺的細(xì)胞毒性。替莫唑胺產(chǎn)生化學(xué)耐藥性是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的主要原因。提高替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的敏感性具有重要的臨床意義。本研究擬觀察五味子素B 對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-251MG增殖、凋亡和自噬的影響，探討五味子素B是否增加替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療敏感性，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤U-251MG 細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection， ATCC）。 U- 251MG 細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 ～3 d更換1次。當(dāng)需要收集細(xì)胞時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化。

1.2藥物、試劑與儀器五味子素B（美國(guó)Selleck公司），純度為99.94%，化學(xué)式為C23H28O6，分子量為400.46；替莫唑胺（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）。五味子素B 和替莫唑胺都溶于體積分?jǐn)?shù)10% 二甲基亞砜（DMSO）中，母液（替莫唑胺：100 mg/mL），使用時(shí)稀釋。 DMEM培養(yǎng)基、FBS、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶（美國(guó)Gibco 公司）；DMSO、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）（美國(guó)Simga公司）；抗Beclin 1、p62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）、 Ki67、 cleaved Caspase-3、Caspase-3 抗體（美國(guó)Abcam 公司）。Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher 公司）；BX53正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；TCS SP8 X 激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）；Tanon 4800 Multi凝膠成像儀（上海天能公司）。

1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

以不同質(zhì)量濃度（0、 0.05、 0.1、 0.2、 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μmol/L）五味子素B 處理U-251MG 細(xì)胞后，應(yīng)用CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞存活率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇2.5 μmol/L 的五味子素B進(jìn)行處理。將U-251MG 細(xì)胞分為4 組：對(duì)照組（U-251MG）、五味子素B 組、替莫唑胺組、協(xié)同組。根據(jù)Carmo A 等[6]研究確定替莫唑胺的處理濃度為100 μmol/L。

1.3.1 CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖能力 連續(xù)培養(yǎng)各組U-251MG細(xì)胞0、24、48、72、96 h，收集各組待測(cè)細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞吸光度。首先，用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液將待測(cè)細(xì)胞制成1 × 106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后，37 ℃培養(yǎng)1 ～4 h，最后應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.3.2 Hoechst染色測(cè)定細(xì)胞凋亡情況 將U-251MG細(xì)胞消化、離心收集，用含體積分?jǐn)?shù)2%FBS 的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)細(xì)胞密度約為1 × 106個(gè)/mL。按照說(shuō)明書(shū)操作方法，加入Hoechst 33342 染液，37 ℃孵育1 h。最后，在熒光顯微鏡下，觀察拍照。在隨機(jī)選取的6個(gè)視野中，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞核濃縮的細(xì)胞數(shù)量來(lái)確定凋亡細(xì)胞的數(shù)量。

1.3.3 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞LC3表達(dá) U-251MG細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，室溫下用40 g/L 多聚甲醛固定，再用體積分?jǐn)?shù)3% BSA 孵育90 min，PBS 沖洗3 次，然后在室溫下用LC3 一抗孵育1 h，用0.1 g/mL 4’6-二脒基-苯基吲哚（DAPI）孵育3 min，用二抗孵育30 min。最后應(yīng)用共聚焦熒光顯微鏡拍照，獲得熒光圖像。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞增殖、自噬、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 藥物處理后，收集各組待測(cè)U-251MG 細(xì)胞，用PBS 清洗3 次，加入含絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）的RAPI細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取蛋白質(zhì)樣品（20 mg），100 ℃變性5 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 ～2 h后加入相應(yīng)的一抗，于4 ℃過(guò)夜孵育；次日，清洗后再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記（HRP）的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。GAPDH 作為上樣量參照，至少進(jìn)行3 次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 分組、造模與給藥 為驗(yàn)證五味子素B 聯(lián)合替莫唑胺的體內(nèi)療效，本研究采用6周齡雌性胸腺裸鼠皮下注射U- 251MG 細(xì)胞（2 × 105個(gè)/mL，Hank’s 平衡鹽溶液稀釋）建立異位異種移植瘤模型。動(dòng)物分為4組，即對(duì)照組、五味子素B組、替莫唑胺組、協(xié)同組，每組小鼠8 只。U-251MG細(xì)胞注射后第1天，五味子素B組給予五味子素B 5.0 mg·kg-1·d-1灌胃，替莫唑胺組給予替莫唑胺2.0 mg·kg-1·d-1灌胃。給藥30 d 后所有小鼠給予頸椎脫臼法處死。

1.4.2 腫瘤體積觀察 用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積，公式：橢球體的體積= 長(zhǎng)×（寬）2× 0.5。

1.4.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織Ki67、Caspase-3表達(dá) 石蠟包埋的腫瘤切片（2 μm）經(jīng)脫蠟后，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶在室溫下用體積分?jǐn)?shù)20%過(guò)氧化氫 阻 斷15 min， 然后分別用抗Ki67 抗體、 抗Caspase-3 抗體孵育30 min。將生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗孵育30 min，在Tris-HCl緩沖液（TBS）中洗滌后，用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素試劑和3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）孵育復(fù)染5 min。脫水干燥后顯微鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，分析比較處理組與對(duì)照組之間增殖倍數(shù)、凋亡率以及蛋白表達(dá)的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1五味子素B降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251MG存活率選擇如圖1 所示梯度濃度的五味子素B 處理U-251MG 細(xì)胞48 h 后，采用CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞存活情況。五味子素B 在1 μmol/L 及以下的濃度時(shí)，細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；五味子素B 2.5 μmol/L 及以上濃度時(shí)，細(xì)胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01，與對(duì)照組比較），表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。故選擇對(duì)U-251MG 細(xì)胞低毒性的劑量2.5 μmol/L作為五味子素B 單獨(dú)或聯(lián)合處理濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同質(zhì)量濃度五味子素B降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251MG存活率Figure 1 Different mass concentrations of Schisandrin B deceases survival rate of U-251MG cells

圖2 五味子素B增強(qiáng)替莫唑胺誘導(dǎo)的U-251MG增殖抑制和凋亡Figure 2 Schisandrin B enhances temozolomide-induced proliferation inhibition and apoptosis in U-251MG cells

2.2五味子素B增強(qiáng)替莫唑胺誘導(dǎo)的U-251MG增殖抑制和凋亡如圖2-A 所示，與對(duì)照組比較，五味子素B 組、替莫唑胺組和協(xié)同組促進(jìn)U-251MG細(xì)胞凋亡（P＜0.01），且協(xié)同組的促進(jìn)作用優(yōu)于替莫唑胺組（P＜0.01）。如圖2-B所示，與對(duì)照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協(xié)同組均抑制U-251MG細(xì)胞的生長(zhǎng)（P＜0.01），且協(xié)同組的抑制作用優(yōu)于替莫唑胺組（P＜0.05）。通過(guò)對(duì)U-251MG細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Ki67和cleaved Caspase-3的Western Blot 分析，驗(yàn)證了上述結(jié)果，如圖2-C、-D所示，與對(duì)照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協(xié)同組U-251MG細(xì)胞Ki67的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而cleaved Caspase-3 的相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），且協(xié)同組的作用效果優(yōu)于替莫唑胺組（P＜0.05）。

2.3五味子素B增強(qiáng)替莫唑胺誘導(dǎo)的U-251MG細(xì)胞自噬采用免疫熒光法檢測(cè)LC3 表達(dá)情況如圖3-A 所示，與對(duì)照組比較，五味子素B 組、替莫唑胺組和協(xié)同組U-251MG 細(xì)胞LC3 表達(dá)水平明顯升高，且協(xié)同組升高作用優(yōu)于替莫唑胺組（P＜0.01）。 Western Blot檢測(cè)結(jié)果如圖3-B所示，與對(duì)照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協(xié)同組均顯著下調(diào)細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白p62 蛋白水平，上調(diào)Beclin 1 蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.01），且協(xié)同組上調(diào)Beclin 1 蛋白表達(dá)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的作用和下調(diào)p62 蛋白表達(dá)的作用優(yōu)于替莫唑胺組（P＜0.01）。

圖3 五味子素B增強(qiáng)替莫唑胺誘導(dǎo)的U-251MG細(xì)胞自噬Figure 3 Schisandrin B enhances temozolomide -induced autophagy in U-251MG cells

2.4五味子素B增強(qiáng)替莫唑胺誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制如圖4-A 所示，從左至右分別為對(duì)照組、五味子素B組、替莫唑胺組和協(xié)同組小鼠體內(nèi)取出的腫瘤。與對(duì)照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協(xié)同組腫瘤體積明顯減?。≒＜0.01）；與替莫唑胺比較，協(xié)同組腫瘤體積更?。≒＜0.01）。具體結(jié)果見(jiàn)圖4-B。免疫組織化學(xué)法分析腫瘤組織Ki67和Caspase-3的表達(dá)，如圖5-A、-B所示，與對(duì)照組比較，五味子素B 組、替莫唑胺組和協(xié)同組Ki67 的表達(dá)水平均明顯降低，Caspase-3 的表達(dá)水平升高，且協(xié)同組對(duì)Ki67的降低作用與對(duì)Caspase-3的升高作用明顯優(yōu)于替莫唑胺組（P＜0.01）。

圖4 五味子素B協(xié)同替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)Figure 4 Schisandrin B enhances the effect of temozolomide on inhibit glioma growth

圖5 五味子素B協(xié)同替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤Ki67表達(dá)、促進(jìn)Caspase-3表達(dá)Figure 5 Schisandrin B enhances the effect of temozolomide on inhibiting Ki67 expression and promoting Caspase-3 expression in glioma

3 討論

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的果實(shí)，味酸，性溫，有斂肺滋腎、生津止汗、澀精止瀉、安神的功效，可治久嗽虛喘、消渴、津少口干、自汗、盜汗、遺精、久瀉、瞳孔散大、健忘、失眠等病癥。五味子素B（schisandrin B）是從五味子中提取出來(lái)的有效成分。藥理學(xué)研究表明，五味子素B不僅用于治療神經(jīng)退行性疾病[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9]，還可抑制膠質(zhì)瘤[10-12]。然而，既往研究未見(jiàn)有關(guān)五味子素B 是否增加替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療敏感性的報(bào)道。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，五味子素B 抑制U-251MG 細(xì)胞的活力（P＜0.05 或P＜0.01）。與對(duì)照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協(xié)同組均增加U-251MG 凋亡細(xì)胞比率，升高細(xì)胞cleaved Caspase-3 表達(dá)水平，增加細(xì)胞核內(nèi)LC3 陽(yáng)性色斑，減弱p62表達(dá)，增強(qiáng)Beclin 1表達(dá)及升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（均P＜0.01）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協(xié)同組均減小異種移植膠質(zhì)瘤體積，降低Ki67 表達(dá)，增強(qiáng)Caspase-3 表達(dá)（均P＜0.01）。且協(xié)同組的上述作用效果均優(yōu)于替莫唑胺組（均P＜0.01）。表明五味子素B可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬。與上述研究[8-12]一致，證實(shí)了五味子素B的抗膠質(zhì)瘤作用，同時(shí)表明五味子素B對(duì)替莫唑胺化療的治療效果有協(xié)同增效作用。

膠質(zhì)瘤是一種具有高度增殖和侵襲能力的惡性腫瘤[13]。同時(shí)，膠質(zhì)瘤是對(duì)傳統(tǒng)化療最具抵抗力的腫瘤之一，即使經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的手術(shù)切除結(jié)合化療或放療，患者的生存率仍然較低[14-15]。為了克服這一障礙，目前的研究主要集中于化療藥物與其他藥物的結(jié)合應(yīng)用以及新型分子靶向藥物的開(kāi)發(fā)[16-18]。近年來(lái)，膠質(zhì)瘤替莫唑胺治療的改進(jìn)被廣泛報(bào)道，microRNAs、中藥提取物被證明可增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的敏感性[19-22]。本研究結(jié)果表明，五味子素B 可協(xié)同替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤U-251MG細(xì)胞和小鼠異種移植瘤。單獨(dú)五味子素B處理，其增殖抑制作用、凋亡和自噬促進(jìn)作用不如單獨(dú)替莫唑胺處理強(qiáng)，說(shuō)明單獨(dú)五味子素B治療膠質(zhì)瘤療效不如替莫唑胺，替莫唑胺仍是膠質(zhì)瘤化療的相對(duì)更有效的藥物。然而，將五味子素B和替莫唑胺聯(lián)合使用，表現(xiàn)出比單獨(dú)替莫唑胺使用更強(qiáng)的抗膠質(zhì)瘤潛力，說(shuō)明五味子素B可增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和腫瘤的敏感性，降低膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的抵抗性。

綜上所述，五味子素B可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和自噬，具有抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的作用。同時(shí)，五味子素B可增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的敏感性，增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用、對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的促進(jìn)作用，且五味子素B增強(qiáng)了替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑制作用。