苗藥“桿努盡煙”對慢性支氣管炎大鼠TLR4-MyD88-NF-κB信號通路的影響*

吳寧， 黃雨霄， 石雪， 陳晉倫， 彭凌峰， 楊露露， 徐紅， 孫見飛， 劉華

(貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 基礎醫(yī)學實驗教學中心， 貴州 貴陽 550025)

慢性支氣管炎(chronic bronchitis，CB)是一種臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰或伴有喘息，常并發(fā)阻塞性肺氣腫[1]。CB病程晚期，可進展為肺動脈高壓、肺源性心臟病[1-2]。臨床常采用西藥對CB進行治療，且具有起效快、療效明顯等優(yōu)勢，但CB病程長且容易復發(fā)，因需長期服藥，患者的依從性較差，而傳統(tǒng)中草藥具有多成分、多靶點、多途徑及副作用小等特點，在CB的治療方面具有一定的潛力[3-4]。貴州凱里苗族地區(qū)常采用特色藥方“桿努盡煙”對支氣管炎進行治療，療效顯著[5-6]；但因其作用機制尚不明確，從而阻礙了該藥的研發(fā)，該藥一直處于經(jīng)驗用藥階段。根據(jù)課題組前期研究結果[7]，本研究采用低(2 g/kg)、高(8 g/kg)兩個劑量的“桿努盡煙”對CB模型大鼠進行治療，并于用藥的第28天時觀察大鼠肺組織的病理變化、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量及Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)-髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)-核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達水平，探究苗藥“桿努盡煙”對CB大鼠模型的療效及其可能機制，為該藥的開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 30只清潔(specific pathogen free，SPF)級、7～8周齡SD(sprague dawley，SD)大鼠，雌、雄各半；體質量(200±20)g，由重慶騰鑫公司提供[SYXF(黔)2018-0001]。

1.1.2藥物 苗藥“桿努盡煙”全草采摘于凱里市爐山鎮(zhèn)，經(jīng)貴州省中醫(yī)藥大學潘爐臺教授鑒定屬吊石苣苔屬植物吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim.)；桂龍咳喘寧膠囊購自桂龍藥業(yè)有限責任公司。

1.1.3主要試劑 脂多糖(美國Sigma)，TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號A38281155)，TLR4兔抗大鼠一抗(美國Abcam公司)，MyD88兔抗大鼠一抗(美國CST公司)，NF-κB p65兔抗大鼠一抗(中國武漢Abclonal公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔，免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗(中國武漢Abclonal公司，批號AS014)，內參蛋白β-actin兔抗大鼠一抗(中國武漢Abclonal公司)，實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR)反應試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κBp65 mRNA及內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH)引物(武漢天一輝遠公司)，貴煙黃果樹藍佳品(貴陽卷煙廠)。

1.1.4主要儀器 4 ℃高速低溫離心機(美國Thermo公司)，RM2015型石蠟切片機(德國Leica公司)，BX51T-PHD-J11 型顯微鏡(日本Olympus公司)，Synergy H1全功能酶標儀(美國 Bio Tek公司)，上海嘉騰凝膠成像系統(tǒng)(上海嘉騰科技有限公司)，ABI StepOnePlusTMReal-time PCR(美國Thermo)。

1.2 方法

1.2.1苗藥“桿努盡煙”水提液的制備 取2 000 g“桿努盡煙”全草，浸泡于蒸餾水中1 h，電熱恒溫水浴箱90 ℃ 連續(xù)浸提全草12 h，收集、過濾、旋蒸水提液，濃縮至2.5 kg/L。最后高壓蒸汽滅菌分裝，4 ℃貯存。

1.2.2大鼠分組及CB模型建立 制備大鼠吸煙室(0.55 m×0.45 m×0.35 m，上壁留有通氣孔)。30只大鼠在無煙環(huán)境中喂養(yǎng)7 d，隨機分為CB模型組、正常對照組、陽性藥物組、低劑量“桿努盡煙”組及高劑量“桿努盡煙”組，每組6只。正常對照組進行無煙處理；其余4組大鼠進行煙熏處理，30 min/次、2次/d，其中造模的第1天和第14天不做煙熏處理，采用8%水合氯醛(3 mL/kg)行腹腔注射，然后將200 g/L脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液200 μ L注射入氣管內，建立CB大鼠模型，共計28 d[8-9]；造模結束后，5組大鼠進行灌胃給藥處理，低劑量“桿努盡煙”組、高劑量“桿努盡煙”組分別按2 g/kg、8 g/kg灌胃，陽性組為1 g/kg桂龍咳喘寧灌胃，正常對照組和CB模型組，用等量生理鹽水(normal saline，NS)進行灌胃，1次/d，持續(xù)給藥28 d[7,10]。

1.2.3呼吸系統(tǒng)癥狀觀察及肺組織的收集 造模成功及灌胃給藥第28 天時，比較5組大鼠大鼠呼吸系統(tǒng)癥狀。于灌胃給藥處理第28 天時，麻醉狀態(tài)下心臟取血法處死大鼠，取出大鼠肺組織，部分制作HE切片、部分直接使用，下余部分用RNA保存液處理后保存于-80 ℃冰箱、用于后續(xù)指標的檢測。

1.2.4大鼠肺切片組織學變化 取新鮮肺組織，用0.9%NaCl溶液沖洗，用4%甲醛固定左肺上葉，制作切片并蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光鏡下觀察肺組織改變。

1.2.5肺組織中TNF-α含量 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，取50 mg新鮮肺組織，快速剪碎，加入PBS，充分研磨，在5 000 r/min，4 ℃的條件下，離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α表達水平。

1.2.6肺組織TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表達 采用Real-time PCR法檢測，Trizol法提取總RNA，取1 μg RNA進行逆轉錄反應，合成cDNA。TLR4、MyD88、NF-κBp65及內參照GADPH引物序列見表1。按Real-time PCR步驟：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應完成后，讀取各樣本擴增循環(huán)數(shù)(cycle Threshold，Ct)值，用相對定量法計算各指標mRNA的相對表達水平。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of PCR

1.2.7TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表達 采用蛋白免疫印跡法(Western blot)法測定，取新鮮肺組織60 mg，置于研缽中，快速剪碎，加裂解液600 μL充分研磨，總蛋白濃度用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)法測定。取總蛋白40 μg，置于95 ℃恒溫水浴箱8 min，隨后上樣。經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉膜后，用5%(tris buffered saline tween，TBST)脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗大鼠一抗，4 ℃孵育過夜。洗滌聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜3次，5 min/次，加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，孵育120 min。用電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)混合液顯色、凝膠成像系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 呼吸系統(tǒng)癥狀

造模成功后，正常對照組大鼠飲食飲水活動正常，無明顯咳嗽、喘息等癥狀；與正常對照組比較，其余4組大鼠體質量減輕，并伴有咳嗽、喘息等癥狀；灌胃給藥第28天時，與CB模型組大鼠比較，陽性藥物組、低劑量“桿努盡煙”組及高劑量“桿努盡煙”組大鼠的呼吸系統(tǒng)癥狀均有改善，其中高劑量組大鼠效果最為明顯。

2.2 大鼠肺組織學改變

灌胃給藥第28 天時，正常對照組肺泡壁、細支氣管上皮細胞結構完整，無炎癥損傷；CB模型組可見肺泡壁缺損，細支氣管上皮排列紊亂，炎性細胞明顯聚集，管壁上皮壞死、脫落，提示造模成功；與CB模型組比較，陽性藥物組、低劑量“桿努盡煙”組、高劑量“桿努盡煙”組肺泡壁及細支氣管損傷程度明顯減輕，炎性細胞明顯減少，上皮排列較完整，但管腔內仍可見明顯炎癥損傷及少量脫落物。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(HE，×400)Fig.1 Effect of L. pauciflorus Maxim. on histopathological morphology of rat lung tissue(HE，×400)

2.3 大鼠肺組織中TNF-α表達

灌胃給藥第28 天時，與正常對照組比較，其余4組大鼠肺組織中TNF-α含量均有增加(P<0.05)；與CB模型組比較，各給藥組經(jīng)藥物干預后，肺組織TNF-α含量均有不同程度的減少(P<0.05)，其中高劑量“桿努盡煙”組減少大于低劑量“桿努盡煙”組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.05；(2)與CB模型組比較，P<0.05。圖2 各組大鼠肺組織中TNF-α表達Fig.2 Expression of TNF-α in lung of rats

2.4 大鼠肺組織中TLR4、MyD88及NF-κB p65 mRNA的表達

灌胃給藥第28 天時，與正常對照組比較，其余4組大鼠肺組織中TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表達水平增加(P<0.05)，其中CB模型組增加最明顯；與CB模型組比較，各給藥組大鼠經(jīng)藥物干預后，肺組織中TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達均有不同程度的降低(P<0.05)，其中高劑量“桿努盡煙”組降低最明顯。見圖3。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.05；(2)與CB模型組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠肺組織中TLR4、MyD88及NF-κB p65 mRNA表達Fig.3 Expression of TLR4，MyD88，and NF-κB p65 mRNA in lung tissue of rats

2.5 大鼠肺組織中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表達

灌胃給藥第28 天時，與正常對照組比較，其余4組大鼠肺組織中TLR4、MyD88及NF-κB p65 表達水平增加(P<0.05)，其中以CB模型組最為明顯；與CB模型組比較，各給藥組大鼠經(jīng)藥物干預后，肺組織中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表達水平均有不同程度的降低(P<0.05)，其中高劑量“桿努盡煙”組降低最明顯。見圖4。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.05；(2)與CB模型組比較，P<0.05。圖4 各組大鼠肺組織中TLR4、MyD88及NF-κB p65 蛋白表達Fig.4 Expression of TLR4，MyD88，and NF-κB p65 protein in lung tissue of rats

3 討論

CB是指發(fā)生于氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，每年發(fā)病持續(xù)3個月或更長，有的可連續(xù)2年。CB的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，吸煙、革蘭陰性菌感染是最重要的環(huán)境發(fā)病因素，空氣污染、職業(yè)粉塵與慢性氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展也有著密切的聯(lián)系[11-14]。資料表明，CB鏡下特點主要表現(xiàn)為支氣管上皮細胞變性、壞死、脫落，各級氣管周圍組織可見大量炎性細胞浸潤。隨著炎癥損傷進一步加重，可引起肺泡腔擴大及肺泡彈性纖維斷裂[15-16]。

苦苣苔科植物吊石苣苔，苗族名為“桿努盡煙”，主要成分中包含黃酮類物質，該成分在抗炎、抗感染方面有一定的療效[17-18]。本研究結果顯示，灌胃給藥第28天時，經(jīng)“桿努盡煙”干預的CB模型大鼠，其體質量、飲水飲食得到改善；咳嗽、喘息減輕；鏡下可見大鼠肺泡壁及細支氣管的炎癥損傷明顯減輕。據(jù)此推測“桿努盡煙”對CB有較強的抗炎作用，從而緩解CB的臨床癥狀。

多項研究顯示，TLR4-MyD88-NF-κB信號通路是慢性支氣管炎發(fā)病的重要機制之一[19-20]。TLR4是一種重要的免疫識別受體，連接天然免疫和獲得性免疫，在啟動和調節(jié)氣道炎癥過程中發(fā)揮重要作用[21]。香煙煙霧和LPS可以激活TLR4，激活的TLR4會將信號向細胞內傳導，從而使MyD88被特異性激活，將信號進一步傳到至NF-κB，NF-κB進入到細胞核內與特定的靶基因結合，促進TNF-α等炎癥介質大量釋放[22-23]，最終導致肺泡、細支氣管等結構受到炎癥破壞[24-25]。灌胃給藥第28天時，本研究檢測了各組大鼠肺組織中TNF-α的含量及TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達水平，結果表明，經(jīng)“桿努盡煙”干預的大鼠上述因子表達水平均明顯下調。據(jù)此推測“桿努盡煙”可能是通過下調TLR4的表達水平進而抑制MyD88和NF-κB的磷酸化，減少下游炎癥因子TNF-α等的釋放，從而減輕大鼠肺部炎癥損傷。

綜上所述，炎癥反應是CB發(fā)生發(fā)展的核心機制，貴州苗藥“桿努盡煙”可通過其較強的抗炎作用，減輕CB的炎癥損傷，進而緩解其臨床癥狀，而 TLR4/MyD88/NF-κB通路可能是其發(fā)揮抗炎作用的、潛在的重要靶點之一，這為今后深入探究”桿努盡煙”治療CB的作用機制提供科學依據(jù)。