微波萃取結(jié)合高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析測(cè)定干制食用菌中汞的形態(tài)

熊善波，肖全偉，何鮚，汪佳林，何瀚庭，蘭航

(成都市食品藥品檢驗(yàn)院，四川 成都，610500)

汞是自然界中一種常見(jiàn)的污染物，在自然界中主要以無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞的形態(tài)存在。汞化合物的毒性依賴(lài)于其化學(xué)形態(tài)和濃度，甲基汞是毒性最強(qiáng)的汞化合物之一，并通過(guò)食物鏈富集可對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆的損害[1]?；诠螒B(tài)毒性的差異，僅測(cè)定食品中的總汞含量已不能滿(mǎn)足評(píng)價(jià)汞毒性的需求，因此采用高靈敏度的形態(tài)分析測(cè)定方法測(cè)定食品中的汞含量對(duì)食品安全具有積極的意義[2]。野生食用菌為一類(lèi)珍稀名貴的食材，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素及多種礦物質(zhì)元素，因其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)。野生食用菌重金屬含量與土壤、水分、大氣等生長(zhǎng)環(huán)境因子具有密切聯(lián)系。多數(shù)對(duì)重金屬 Hg、As、Cd、Pb有很強(qiáng)的富集能力，尤其是汞含量超標(biāo)問(wèn)題凸顯，對(duì)消費(fèi)者身體健康造成威脅[3]。因此，研究汞元素的化學(xué)形態(tài)對(duì)正確認(rèn)識(shí)野生菌中汞元素對(duì)人體的危害具有重要意義。

目前汞形態(tài)分析主要有高效液相-紫外檢測(cè)器聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-ultraviolet ，HPLC-UV)、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry ，GC-MS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS)、液相色譜-原子熒光光譜法(liquid chromatography - atomic fluorescence spectrometry ，LC-AFS)[4]等方法。但是GC-MS法需要將汞衍生化處理成氣態(tài)化合物，經(jīng)過(guò)萃取才可上機(jī)測(cè)定，過(guò)程繁瑣[5]; HPLC-UV 對(duì)流動(dòng)相要求較高，靈敏度較低，不適合低含量的樣品分析;而LC-AFS雖然使用成本較低，但是由于汞燈的不穩(wěn)定，造就分析時(shí)基線(xiàn)漂移，穩(wěn)定性欠缺。HPLC-ICP-MS 具有檢出限低，精密度高，和分離效果好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[6]。本文采用微波萃取并結(jié)合高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了快速、準(zhǔn)確測(cè)定食用菌中不同形態(tài)汞元素的方法，檢測(cè)前處理簡(jiǎn)單，線(xiàn)性范圍寬，檢出限低，為全面客觀評(píng)價(jià)野生食用菌中汞元素的危害提供了方法依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃牛肝菌、黑牛肝菌、松茸、青杠菌、黑虎掌菌、黑松露、蔥菌、雞樅菌、羊肚菌、雞菇，四川川野食品有限公司。

1.2 儀器與試劑

iCAP RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、U3000型HPLC高效液相色譜儀(色譜柱Thermo C18-5 μm, 4.6 mm×150 mm)，賽默飛世爾；超純水儀，德國(guó)密理博公司;分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；微波消解儀，安東帕；甲基汞(metHg，(65.5±2.5) μg/g)、乙基汞(etHg，(76.4±2.8) μg/g)、苯基汞(phHg,純度 98.0 %)、二價(jià)汞(Hg2+，10 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乙酸銨(色譜純)、L-半胱氨酸(優(yōu)級(jí)純)、氨水，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，賽默飛世爾。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水；實(shí)驗(yàn)中所用器材均用25%的HNO3溶液浸泡過(guò)夜，去離子水沖凈晾干備用。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

無(wú)機(jī)汞(Hg2+)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2% HNO3逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存于4 ℃冰箱中[7]。甲基汞(metHg)、乙基汞(etHg)、苯基汞(phHg)標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液：標(biāo)準(zhǔn)溶液分別轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液(以Hg計(jì))，避光保存于4 ℃冰箱中?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取無(wú)機(jī)汞、甲基汞、苯基汞和乙基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相(20 mmoL/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸+5%甲醇)逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/L的汞形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱Thermo C18(4.6 mm×150 mm)，5 μL流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動(dòng)相：5%甲醇+20 mmol/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸。ICP-MS工作參數(shù)：射頻功率1 550 W，采樣深度5 mm，半導(dǎo)體制冷溫度 -5 ℃,檢測(cè)器電壓(計(jì)數(shù)) 1 037.5 V，檢測(cè)器電壓(模擬)：-1 787.5 V，冷卻氣流量14 L/min，Hg質(zhì)量數(shù)202，檢測(cè)模式KED，采樣錐和截取錐為鉑錐，載氣為≥99.999%高純氬。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 微波萃取-酸提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于微波消解罐中，加入10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，靜置30 min后在85 ℃、功率為1 000 W的條件下微波消解15 min。冷卻后將提取液轉(zhuǎn)移到離心管，用少量超純水轉(zhuǎn)移消解罐的殘?jiān)?，逐滴緩慢加入NaOH溶液(6 mol/L)，使樣液pH 為5～7，然后于4 ℃，8 000 r/ min離心15 min。轉(zhuǎn)移全部上清液于25 mL容量瓶中， 再加入1 mLL-半胱氨酸溶液(25 g/L)，用超純水定容至刻度，最后用0.45 μm濾膜過(guò)濾后分析測(cè)定[4]，同時(shí)做試劑實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 超聲輔助-酸提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于50 mL塑料離心管中，加入10 mL，6 mol/L的HCl溶液，放置過(guò)夜。室溫下超聲水浴提取60 min，期間振搖數(shù)次，將提取液轉(zhuǎn)移到離心管[8-9]。下同微波萃取-酸提取方法。

1.3.3.3 堿-甲醇溶液提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 25%氫氧化鉀甲醇溶液，旋渦混勻，于90 ℃水浴2 h，冷卻至室溫后，甲醇補(bǔ)充至10 mL，離心后取其中1 mL用流動(dòng)相稀釋至10 mL，使用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為5.0～7.0， 0.45 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定[10-11]，同時(shí)做試劑實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)量數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用 Origin 8.0 繪圖軟件繪圖,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

定量分析汞形態(tài)時(shí)，汞化合物的提取是關(guān)鍵，本文取松茸和牛肝菌為基質(zhì)比較微波萃取-酸提取、堿-甲醇溶液提取、超聲輔助-酸提取3種不同的汞形態(tài)提取方法。通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(以甲基汞計(jì))比較不同前處理方式的提取效果，見(jiàn)表1。

表1 前處理方式對(duì)汞化合物(以甲基汞計(jì))提取率的影響Table 1 Effect of pretreatment methods on extraction rate of mercury compounds (metHg)

由于干制野生食用菌的特殊性，水分含量少，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、粗纖維、多糖等，特別容易因?yàn)闃悠非疤幚矸绞讲划?dāng)提取不完全，回收率低[12]。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，堿-甲醇溶液提取容易引入復(fù)雜成分，干擾測(cè)定結(jié)果，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，并且處理過(guò)程復(fù)雜，而且回收率低；酸提取基體干擾較少，過(guò)程簡(jiǎn)單，但比較微波萃取-酸提取和超聲輔助-酸提取2種方法，后者因?yàn)樘崛l件相對(duì)溫和，無(wú)法完全破壞干制食用菌的有機(jī)成分，使提取效率和回收率達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。而微波萃取-酸提取方式則能很好的破壞其有機(jī)質(zhì)，回收率為78.7%～109.3%，既節(jié)省時(shí)間提高了效率又能保證提取效果，因此本實(shí)驗(yàn)用微波萃取-酸提取對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相中甲醇濃度優(yōu)化

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入適量的甲醇會(huì)改善汞的形態(tài)分離效果[13]。實(shí)驗(yàn)研究不同濃度甲醇(2%～10%,體積分?jǐn)?shù))對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明,甲醇濃度增加，4種汞形態(tài)的保留時(shí)間逐漸變小，分析時(shí)間變短。儀器響應(yīng)值也會(huì)隨著甲醇濃度的增加變強(qiáng)，但超過(guò)5%會(huì)使儀器的霧化器的霧化效率，儀器的靈敏度降低。超過(guò)8%后會(huì)使等離子體熄火。綜合考慮，選擇甲醇濃度為5%(體積分?jǐn)?shù))。

2.2.2L-半胱氨酸的濃度優(yōu)化

由于汞元素的特殊性，在測(cè)定汞時(shí)會(huì)有較強(qiáng)的記憶效應(yīng)，特別是汞形態(tài)分析時(shí)，目標(biāo)物在進(jìn)入檢測(cè)器前會(huì)通過(guò)長(zhǎng)的管路，特別容易形成記憶效應(yīng)[14-15]。通常考慮加入合適的絡(luò)合劑避免汞化合物在管路、色譜柱、矩管、采樣錐和截取錐中富集[16]。常見(jiàn)的絡(luò)合劑多為含硫化合物，如2-巰基乙醇，L-半胱氨酸，同型半胱氨酸等，考慮L-半胱氨酸的親水性較強(qiáng)，與汞形成的絡(luò)合物在C18柱上保留較弱，即可降低記憶效應(yīng)，又能縮短檢測(cè)時(shí)間，故實(shí)驗(yàn)選用L-半胱氨酸作為絡(luò)合劑[17-18]。形成的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不加入L-半胱氨酸時(shí)，汞形態(tài)不能很好地分離，而加入L-半胱氨酸可以正常實(shí)現(xiàn)分離。流動(dòng)相中L-半胱氨酸質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L時(shí)，用20 μg/L的混合標(biāo)液分別進(jìn)樣10次，看基線(xiàn)強(qiáng)度變化情況。研究發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)，分離效果及峰型均有所改善，儀器響應(yīng)值較好，而且汞的化合物洗脫完全，基本消除汞的記憶效應(yīng)。繼續(xù)增加其用量沒(méi)有明顯變化。

2.3 線(xiàn)性范圍及檢出限

用HPLC-ICP-MS分析測(cè)定干制野生食用菌中汞的形態(tài)，結(jié)果表明，方法在1～50 μg/L線(xiàn)性良好，無(wú)機(jī)汞、甲基汞、苯基汞和乙基汞相關(guān)系數(shù)分別為0.999 2、0.999 6、0.999 3、0.999 5，甲基汞含量測(cè)定的線(xiàn)性方程為y=3 549 345x-806 689，乙基汞含量測(cè)定的線(xiàn)性方程為y=3 093 569x+462 418，無(wú)機(jī)汞汞含量測(cè)定的線(xiàn)性方程為y=2 359 142x-756 262，苯基汞含量測(cè)定的線(xiàn)性方程為y=2 986 272x+382 461。選擇流動(dòng)相組成(5%甲醇+20 mmol/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸)，采用等度洗脫的方式，色譜峰分離效果圖見(jiàn)圖1。根據(jù)檢出限的方法，測(cè)定無(wú)機(jī)汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞的檢出限。結(jié)果見(jiàn)表1。按照前處理方式稱(chēng)樣量為0.5 g，定容量為25 mL，計(jì)算該方法無(wú)機(jī)汞、甲基汞、乙基汞、苯基汞定量限分別為0.009、0.024、0.018、0.024 mg/kg。

圖1 汞形態(tài)分離效果圖Fig.1 Diagram of mercury speciation

表2 MetHg、etHg、phHg、Hg2+方法測(cè)定低限 單位:μg/L

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在實(shí)際產(chǎn)品中不容易找到同時(shí)存在4種汞化合物的樣品，本實(shí)驗(yàn)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0 μg/L)上機(jī)進(jìn)行測(cè)試7次，結(jié)果見(jiàn)3。甲基汞質(zhì)量濃度平均值為2.12 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.1%，乙基汞質(zhì)量濃度平均值為1.99 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.5%，無(wú)機(jī)汞質(zhì)量濃度平均值為1.92 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.9%，苯基汞質(zhì)量濃度平均值為1.90 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.5%。

表3 精密度實(shí)驗(yàn) 單位:μg/L

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取牛肝菌、松茸、羊肚菌3種干制野生食用菌做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別向其中添加3個(gè)水平(0.04、0.25、0.50 mg/kg)的汞形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知，4種汞形態(tài)的加標(biāo)回收率分別為81.6%～117.5%， 81.8%～93.6%,83.0%～99.4%，77.5%～92.5%。滿(mǎn)足GB/T 27404—2008標(biāo)準(zhǔn)給定的方法回收率。由此可見(jiàn)，在本實(shí)驗(yàn)選定的實(shí)驗(yàn)條件下，研究選用的儀器條件和實(shí)驗(yàn)方法的可靠性較高。

表4 不同樣品中4種汞形態(tài)的加標(biāo)回收率Table 4 The recoveries of four mercury species in different samples

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析測(cè)定

用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10029和Tort-3進(jìn)行汞化合物測(cè)定,驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表5，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平行樣測(cè)定結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)選定的實(shí)驗(yàn)條件下，研究選用的儀器條件和實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度較高。

表5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中汞形態(tài)的測(cè)定結(jié)果 單位:mg/kg

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本文建立的方法對(duì)黃牛肝菌、黑牛肝菌、松茸、青杠菌、黑松露、蔥菌、雞樅菌、羊肚菌、滑子菇、雞菇、黑虎掌菌的干制樣品進(jìn)行測(cè)定(表6)。結(jié)果表明,汞的形態(tài)主要以無(wú)機(jī)汞(Hg2+)的形式存在，其中牛肝菌、青杠菌、松茸、雞樅菌、黑虎掌菌含有少量甲基汞，乙基汞、苯基汞均為未檢測(cè)。

表6 樣品中不同價(jià)態(tài)汞的含量 單位:mg/kg

3 結(jié)論

HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)分析測(cè)定不同汞形態(tài)是目前較為先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)。本文通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相的組成，較好地解決了汞測(cè)定時(shí)的富集效應(yīng)和記憶效應(yīng)。而由于干制食用菌樣品的特殊性，通過(guò)比較微波萃取-酸提取、堿-甲醇溶液提取、超聲輔助-酸提取3種不同的汞形態(tài)提取方法，最終選擇了借助微波酸萃取的方法。建立了微波萃取結(jié)合HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定干制野生食用菌中汞形態(tài)的方法，在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞、苯基汞4種汞的形態(tài)分離。根據(jù)建立的方法和優(yōu)化的條件，以牛肝菌、松茸、羊肚菌3種基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，四種汞形態(tài)的加標(biāo)回收率分別為81.6%～117.5%，81.8%～93.6%,83.0%～99.4%,77.5%～92.5%，采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10029和Tort-3驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性，滿(mǎn)足分析，方法定量限分別為0.009、0.024、0.018、0.024 mg/kg，精密度良好。此方法前處理簡(jiǎn)單、樣品提取效率高，分離效果好，準(zhǔn)確度高，適用于干制食用菌中汞形態(tài)的定量分析,為食用菌中汞形態(tài)測(cè)定分析研究提供了一種方法依據(jù)。