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    微波萃取結(jié)合高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析測(cè)定干制食用菌中汞的形態(tài)

    2020-12-02 01:52:18熊善波肖全偉何鮚汪佳林何瀚庭蘭航
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:甲基汞半胱氨酸食用菌

    熊善波,肖全偉,何鮚,汪佳林,何瀚庭,蘭航

    (成都市食品藥品檢驗(yàn)院,四川 成都,610500)

    汞是自然界中一種常見(jiàn)的污染物,在自然界中主要以無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞的形態(tài)存在。汞化合物的毒性依賴(lài)于其化學(xué)形態(tài)和濃度,甲基汞是毒性最強(qiáng)的汞化合物之一,并通過(guò)食物鏈富集可對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆的損害[1]?;诠螒B(tài)毒性的差異,僅測(cè)定食品中的總汞含量已不能滿(mǎn)足評(píng)價(jià)汞毒性的需求,因此采用高靈敏度的形態(tài)分析測(cè)定方法測(cè)定食品中的汞含量對(duì)食品安全具有積極的意義[2]。野生食用菌為一類(lèi)珍稀名貴的食材,富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素及多種礦物質(zhì)元素,因其味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)。野生食用菌重金屬含量與土壤、水分、大氣等生長(zhǎng)環(huán)境因子具有密切聯(lián)系。多數(shù)對(duì)重金屬 Hg、As、Cd、Pb有很強(qiáng)的富集能力,尤其是汞含量超標(biāo)問(wèn)題凸顯,對(duì)消費(fèi)者身體健康造成威脅[3]。因此,研究汞元素的化學(xué)形態(tài)對(duì)正確認(rèn)識(shí)野生菌中汞元素對(duì)人體的危害具有重要意義。

    目前汞形態(tài)分析主要有高效液相-紫外檢測(cè)器聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-ultraviolet ,HPLC-UV)、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry ,GC-MS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)、液相色譜-原子熒光光譜法(liquid chromatography - atomic fluorescence spectrometry ,LC-AFS)[4]等方法。但是GC-MS法需要將汞衍生化處理成氣態(tài)化合物,經(jīng)過(guò)萃取才可上機(jī)測(cè)定,過(guò)程繁瑣[5]; HPLC-UV 對(duì)流動(dòng)相要求較高,靈敏度較低,不適合低含量的樣品分析;而LC-AFS雖然使用成本較低,但是由于汞燈的不穩(wěn)定,造就分析時(shí)基線(xiàn)漂移,穩(wěn)定性欠缺。HPLC-ICP-MS 具有檢出限低,精密度高,和分離效果好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[6]。本文采用微波萃取并結(jié)合高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),建立了快速、準(zhǔn)確測(cè)定食用菌中不同形態(tài)汞元素的方法,檢測(cè)前處理簡(jiǎn)單,線(xiàn)性范圍寬,檢出限低,為全面客觀評(píng)價(jià)野生食用菌中汞元素的危害提供了方法依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    黃牛肝菌、黑牛肝菌、松茸、青杠菌、黑虎掌菌、黑松露、蔥菌、雞樅菌、羊肚菌、雞菇,四川川野食品有限公司。

    1.2 儀器與試劑

    iCAP RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、U3000型HPLC高效液相色譜儀(色譜柱Thermo C18-5 μm, 4.6 mm×150 mm),賽默飛世爾;超純水儀,德國(guó)密理博公司;分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司;微波消解儀,安東帕;甲基汞(metHg,(65.5±2.5) μg/g)、乙基汞(etHg,(76.4±2.8) μg/g)、苯基汞(phHg,純度 98.0 %)、二價(jià)汞(Hg2+,10 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;乙酸銨(色譜純)、L-半胱氨酸(優(yōu)級(jí)純)、氨水,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純),賽默飛世爾。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水;實(shí)驗(yàn)中所用器材均用25%的HNO3溶液浸泡過(guò)夜,去離子水沖凈晾干備用。

    1.3 方法

    1.3.1 溶液的配制

    無(wú)機(jī)汞(Hg2+)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液,用2% HNO3逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,避光保存于4 ℃冰箱中[7]。甲基汞(metHg)、乙基汞(etHg)、苯基汞(phHg)標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液:標(biāo)準(zhǔn)溶液分別轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液(以Hg計(jì)),避光保存于4 ℃冰箱中?;旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液:分別移取無(wú)機(jī)汞、甲基汞、苯基汞和乙基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相(20 mmoL/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸+5%甲醇)逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/L的汞形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

    1.3.2 儀器條件

    色譜條件:色譜柱Thermo C18(4.6 mm×150 mm),5 μL流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,柱溫35 ℃,流動(dòng)相:5%甲醇+20 mmol/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸。ICP-MS工作參數(shù):射頻功率1 550 W,采樣深度5 mm,半導(dǎo)體制冷溫度 -5 ℃,檢測(cè)器電壓(計(jì)數(shù)) 1 037.5 V,檢測(cè)器電壓(模擬):-1 787.5 V,冷卻氣流量14 L/min,Hg質(zhì)量數(shù)202,檢測(cè)模式KED,采樣錐和截取錐為鉑錐,載氣為≥99.999%高純氬。

    1.3.3 樣品前處理

    1.3.3.1 微波萃取-酸提取

    準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于微波消解罐中,加入10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液,靜置30 min后在85 ℃、功率為1 000 W的條件下微波消解15 min。冷卻后將提取液轉(zhuǎn)移到離心管,用少量超純水轉(zhuǎn)移消解罐的殘?jiān)?,逐滴緩慢加入NaOH溶液(6 mol/L),使樣液pH 為5~7,然后于4 ℃,8 000 r/ min離心15 min。轉(zhuǎn)移全部上清液于25 mL容量瓶中, 再加入1 mLL-半胱氨酸溶液(25 g/L),用超純水定容至刻度,最后用0.45 μm濾膜過(guò)濾后分析測(cè)定[4],同時(shí)做試劑實(shí)驗(yàn)。

    1.3.3.2 超聲輔助-酸提取

    準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于50 mL塑料離心管中,加入10 mL,6 mol/L的HCl溶液,放置過(guò)夜。室溫下超聲水浴提取60 min,期間振搖數(shù)次,將提取液轉(zhuǎn)移到離心管[8-9]。下同微波萃取-酸提取方法。

    1.3.3.3 堿-甲醇溶液提取

    準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于50 mL 塑料離心管中,加入10 mL 25%氫氧化鉀甲醇溶液,旋渦混勻,于90 ℃水浴2 h,冷卻至室溫后,甲醇補(bǔ)充至10 mL,離心后取其中1 mL用流動(dòng)相稀釋至10 mL,使用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為5.0~7.0, 0.45 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定[10-11],同時(shí)做試劑實(shí)驗(yàn)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所有測(cè)量數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用 Origin 8.0 繪圖軟件繪圖,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品前處理方法的選擇

    定量分析汞形態(tài)時(shí),汞化合物的提取是關(guān)鍵,本文取松茸和牛肝菌為基質(zhì)比較微波萃取-酸提取、堿-甲醇溶液提取、超聲輔助-酸提取3種不同的汞形態(tài)提取方法。通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(以甲基汞計(jì))比較不同前處理方式的提取效果,見(jiàn)表1。

    表1 前處理方式對(duì)汞化合物(以甲基汞計(jì))提取率的影響Table 1 Effect of pretreatment methods on extraction rate of mercury compounds (metHg)

    由于干制野生食用菌的特殊性,水分含量少,含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、粗纖維、多糖等,特別容易因?yàn)闃悠非疤幚矸绞讲划?dāng)提取不完全,回收率低[12]。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),堿-甲醇溶液提取容易引入復(fù)雜成分,干擾測(cè)定結(jié)果,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定,并且處理過(guò)程復(fù)雜,而且回收率低;酸提取基體干擾較少,過(guò)程簡(jiǎn)單,但比較微波萃取-酸提取和超聲輔助-酸提取2種方法,后者因?yàn)樘崛l件相對(duì)溫和,無(wú)法完全破壞干制食用菌的有機(jī)成分,使提取效率和回收率達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。而微波萃取-酸提取方式則能很好的破壞其有機(jī)質(zhì),回收率為78.7%~109.3%,既節(jié)省時(shí)間提高了效率又能保證提取效果,因此本實(shí)驗(yàn)用微波萃取-酸提取對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

    2.2 色譜條件的優(yōu)化

    2.2.1 流動(dòng)相中甲醇濃度優(yōu)化

    經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入適量的甲醇會(huì)改善汞的形態(tài)分離效果[13]。實(shí)驗(yàn)研究不同濃度甲醇(2%~10%,體積分?jǐn)?shù))對(duì)分離效果的影響,結(jié)果表明,甲醇濃度增加,4種汞形態(tài)的保留時(shí)間逐漸變小,分析時(shí)間變短。儀器響應(yīng)值也會(huì)隨著甲醇濃度的增加變強(qiáng),但超過(guò)5%會(huì)使儀器的霧化器的霧化效率,儀器的靈敏度降低。超過(guò)8%后會(huì)使等離子體熄火。綜合考慮,選擇甲醇濃度為5%(體積分?jǐn)?shù))。

    2.2.2L-半胱氨酸的濃度優(yōu)化

    由于汞元素的特殊性,在測(cè)定汞時(shí)會(huì)有較強(qiáng)的記憶效應(yīng),特別是汞形態(tài)分析時(shí),目標(biāo)物在進(jìn)入檢測(cè)器前會(huì)通過(guò)長(zhǎng)的管路,特別容易形成記憶效應(yīng)[14-15]。通常考慮加入合適的絡(luò)合劑避免汞化合物在管路、色譜柱、矩管、采樣錐和截取錐中富集[16]。常見(jiàn)的絡(luò)合劑多為含硫化合物,如2-巰基乙醇,L-半胱氨酸,同型半胱氨酸等,考慮L-半胱氨酸的親水性較強(qiáng),與汞形成的絡(luò)合物在C18柱上保留較弱,即可降低記憶效應(yīng),又能縮短檢測(cè)時(shí)間,故實(shí)驗(yàn)選用L-半胱氨酸作為絡(luò)合劑[17-18]。形成的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不加入L-半胱氨酸時(shí),汞形態(tài)不能很好地分離,而加入L-半胱氨酸可以正常實(shí)現(xiàn)分離。流動(dòng)相中L-半胱氨酸質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L時(shí),用20 μg/L的混合標(biāo)液分別進(jìn)樣10次,看基線(xiàn)強(qiáng)度變化情況。研究發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí),分離效果及峰型均有所改善,儀器響應(yīng)值較好,而且汞的化合物洗脫完全,基本消除汞的記憶效應(yīng)。繼續(xù)增加其用量沒(méi)有明顯變化。

    2.3 線(xiàn)性范圍及檢出限

    用HPLC-ICP-MS分析測(cè)定干制野生食用菌中汞的形態(tài),結(jié)果表明,方法在1~50 μg/L線(xiàn)性良好,無(wú)機(jī)汞、甲基汞、苯基汞和乙基汞相關(guān)系數(shù)分別為0.999 2、0.999 6、0.999 3、0.999 5,甲基汞含量測(cè)定的線(xiàn)性方程為y=3 549 345x-806 689,乙基汞含量測(cè)定的線(xiàn)性方程為y=3 093 569x+462 418,無(wú)機(jī)汞汞含量測(cè)定的線(xiàn)性方程為y=2 359 142x-756 262,苯基汞含量測(cè)定的線(xiàn)性方程為y=2 986 272x+382 461。選擇流動(dòng)相組成(5%甲醇+20 mmol/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸),采用等度洗脫的方式,色譜峰分離效果圖見(jiàn)圖1。根據(jù)檢出限的方法,測(cè)定無(wú)機(jī)汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞的檢出限。結(jié)果見(jiàn)表1。按照前處理方式稱(chēng)樣量為0.5 g,定容量為25 mL,計(jì)算該方法無(wú)機(jī)汞、甲基汞、乙基汞、苯基汞定量限分別為0.009、0.024、0.018、0.024 mg/kg。

    圖1 汞形態(tài)分離效果圖Fig.1 Diagram of mercury speciation

    表2 MetHg、etHg、phHg、Hg2+方法測(cè)定低限 單位:μg/L

    2.4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    在實(shí)際產(chǎn)品中不容易找到同時(shí)存在4種汞化合物的樣品,本實(shí)驗(yàn)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0 μg/L)上機(jī)進(jìn)行測(cè)試7次,結(jié)果見(jiàn)3。甲基汞質(zhì)量濃度平均值為2.12 μg/L,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.1%,乙基汞質(zhì)量濃度平均值為1.99 μg/L,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.5%,無(wú)機(jī)汞質(zhì)量濃度平均值為1.92 μg/L,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.9%,苯基汞質(zhì)量濃度平均值為1.90 μg/L,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.5%。

    表3 精密度實(shí)驗(yàn) 單位:μg/L

    2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    選取牛肝菌、松茸、羊肚菌3種干制野生食用菌做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),分別向其中添加3個(gè)水平(0.04、0.25、0.50 mg/kg)的汞形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知,4種汞形態(tài)的加標(biāo)回收率分別為81.6%~117.5%, 81.8%~93.6%,83.0%~99.4%,77.5%~92.5%。滿(mǎn)足GB/T 27404—2008標(biāo)準(zhǔn)給定的方法回收率。由此可見(jiàn),在本實(shí)驗(yàn)選定的實(shí)驗(yàn)條件下,研究選用的儀器條件和實(shí)驗(yàn)方法的可靠性較高。

    表4 不同樣品中4種汞形態(tài)的加標(biāo)回收率Table 4 The recoveries of four mercury species in different samples

    2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析測(cè)定

    用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10029和Tort-3進(jìn)行汞化合物測(cè)定,驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性,結(jié)果見(jiàn)表5,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平行樣測(cè)定結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi),說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)選定的實(shí)驗(yàn)條件下,研究選用的儀器條件和實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度較高。

    表5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中汞形態(tài)的測(cè)定結(jié)果 單位:mg/kg

    2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

    應(yīng)用本文建立的方法對(duì)黃牛肝菌、黑牛肝菌、松茸、青杠菌、黑松露、蔥菌、雞樅菌、羊肚菌、滑子菇、雞菇、黑虎掌菌的干制樣品進(jìn)行測(cè)定(表6)。結(jié)果表明,汞的形態(tài)主要以無(wú)機(jī)汞(Hg2+)的形式存在,其中牛肝菌、青杠菌、松茸、雞樅菌、黑虎掌菌含有少量甲基汞,乙基汞、苯基汞均為未檢測(cè)。

    表6 樣品中不同價(jià)態(tài)汞的含量 單位:mg/kg

    3 結(jié)論

    HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)分析測(cè)定不同汞形態(tài)是目前較為先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)。本文通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相的組成,較好地解決了汞測(cè)定時(shí)的富集效應(yīng)和記憶效應(yīng)。而由于干制食用菌樣品的特殊性,通過(guò)比較微波萃取-酸提取、堿-甲醇溶液提取、超聲輔助-酸提取3種不同的汞形態(tài)提取方法,最終選擇了借助微波酸萃取的方法。建立了微波萃取結(jié)合HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定干制野生食用菌中汞形態(tài)的方法,在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了甲基汞、乙基汞、無(wú)機(jī)汞、苯基汞4種汞的形態(tài)分離。根據(jù)建立的方法和優(yōu)化的條件,以牛肝菌、松茸、羊肚菌3種基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),四種汞形態(tài)的加標(biāo)回收率分別為81.6%~117.5%,81.8%~93.6%,83.0%~99.4%,77.5%~92.5%,采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10029和Tort-3驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性,滿(mǎn)足分析,方法定量限分別為0.009、0.024、0.018、0.024 mg/kg,精密度良好。此方法前處理簡(jiǎn)單、樣品提取效率高,分離效果好,準(zhǔn)確度高,適用于干制食用菌中汞形態(tài)的定量分析,為食用菌中汞形態(tài)測(cè)定分析研究提供了一種方法依據(jù)。

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