新疆桃果內(nèi)生細(xì)菌群落組成分析

劉曉靜，林楊，呂卓，石玲，李亞玲，李玲，何歡，朱璇*，張志東*

1(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊，830091) 2(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)

桃作為五果之首[1]，含有多種功能性的糖、酸、蛋白質(zhì)、粗纖維、維生素及無(wú)機(jī)鹽、胡蘿卜素、尼克酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，易于人體的消化吸收，具有美膚、清胃、潤(rùn)肺、祛痰等功效[2-3]。同時(shí)，桃果中的含鐵量為蘋(píng)果和梨的4～6倍，能夠有效預(yù)防缺鐵性貧血[4-5]。桃起源于中國(guó)，且種植面積及產(chǎn)量均居世界首位。新疆因特殊的地理?xiàng)l件，日照充足，晝夜溫差大，利于瓜果糖分的累積，是久負(fù)盛名的“瓜果之鄉(xiāng)”。桃作為新疆的特色水果，在南北疆廣泛種植。常見(jiàn)的種類有水蜜桃、油桃、蟠桃等，不僅是鮮食的佳品，也可加工成桃干、罐頭、果汁等產(chǎn)品，具有極高的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是當(dāng)?shù)氐奶厣止娃r(nóng)民增收的手段[6-7]。目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究主要集中于其采后生理生化變化、保鮮技術(shù)方法等方面[8-9]。近年來(lái)，植物內(nèi)生菌因具有促生、固氮、抑菌防病、提高宿主抗逆能力等多種生物學(xué)作用被作為研究的熱點(diǎn)，且在已開(kāi)展的植物研究中均發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生菌的存在[10-11]。然而，暫未見(jiàn)桃果內(nèi)生菌的相關(guān)研究，對(duì)其內(nèi)生菌的組成與分布規(guī)律，是否存在與人體健康相關(guān)的潛在功能微生物等相關(guān)研究，更是鮮有報(bào)道。

因此，本研究以新疆特色油桃、水蜜桃、蟠桃為試驗(yàn)對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)3類桃果采后內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性進(jìn)行較為全面的解析，并對(duì)其中存在的與人體健康潛在相關(guān)的微生物進(jìn)行了分析。本文的開(kāi)展，為揭示桃果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，進(jìn)一步研究桃果內(nèi)生細(xì)菌群落與人體健康潛在的相互關(guān)系，深度挖掘與利用內(nèi)生細(xì)菌資源研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

油桃(YT)、水蜜桃(SMT)、蟠桃(PT)樣品，分別采自吐魯番市托克遜鎮(zhèn)、阿克蘇市阿瓦提縣和石河子市農(nóng)八師143團(tuán)果園中。采用隨機(jī)采樣法，選擇自然成熟、表皮有光澤且無(wú)損傷、顏色大小一致的桃果，經(jīng)發(fā)泡網(wǎng)包裹裝筐后，12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)研究室，于4 ℃下貯藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理

各樣品流水沖洗10 min，無(wú)菌紙吸干水分；75%無(wú)水乙醇處理5 min，無(wú)菌水洗滌；3.3% NaClO浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗；75%無(wú)水乙醇浸泡1 min后，無(wú)菌水沖洗，吸干水分，并對(duì)洗滌液涂板檢測(cè)確認(rèn)表面消毒完全[12]。

1.2.2 DNA抽提

采用十六烷基三甲基溴化銨法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行大量提取，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度；1%瓊脂糖凝膠，5V/cm電壓，時(shí)間20 min檢測(cè)DNA完整性[13]。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

采用引物為515F和806R，PCR參數(shù)：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 、10 min。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后取3 μL上樣2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序[14]。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

所得序列經(jīng)Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)去嵌合體，排除宿主葉綠體序列數(shù)據(jù)的干擾后，以相似性97%水平以上的序列視為一個(gè)操作分類單元(operational taxonmic units，OTU)，進(jìn)行聚類處理，利用數(shù)據(jù)庫(kù)注釋物種，開(kāi)展相關(guān)微生物豐度、多樣性等方面的分析處理，以此來(lái)確定出微生物群落結(jié)構(gòu)特征信息[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果及序列深度驗(yàn)證

樣品共測(cè)得原始序列238 740條，過(guò)濾掉低質(zhì)量序列后，總數(shù)為211 633條。在上述序列進(jìn)行去冗余處理后，有效序列數(shù)170 886條，并在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，并去除植物體內(nèi)的線粒體、葉綠體相關(guān)序列后，共獲得106個(gè)OTUs，其中油桃的內(nèi)生細(xì)菌所得OTUs最高，共測(cè)得98個(gè)OTUs。統(tǒng)計(jì)得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息，各樣品測(cè)序信息結(jié)果如表1所示。

稀釋曲線反映了測(cè)序的深度，也可以用來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋樣品所有種群。由圖1可知，油桃、水蜜桃、蟠桃的稀釋曲線均基本趨于平緩，但仍未達(dá)到飽和，說(shuō)明此次所得序列可基本反映出桃果中真實(shí)的內(nèi)生細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)。

表1 不同品種桃果內(nèi)生細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of sequencing data of endophytic bacteria in different peaches

圖1 桃果內(nèi)生細(xì)菌的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of endophytic bacteria communities in different peaches

2.2 樣品間多樣性分析

以各樣品中分布的OTUs數(shù)為計(jì)算依據(jù)，對(duì)各樣品中群落梯狀性進(jìn)行分析，并構(gòu)建韋恩圖。韋恩圖能夠直觀反映樣品當(dāng)前重疊情況下的共有單元和非重疊情況下的特有分類單元數(shù)目。如圖2所示，3類桃果實(shí)中共包含106個(gè)OTUs，其中以油桃的OTUs最多，包含98個(gè)OTUs，而水蜜桃中含89個(gè)OTUs，蟠桃中含有83個(gè)OTUs。在所有的106個(gè)OTUs中73個(gè)OTUs均同時(shí)出現(xiàn)在油桃、蟠桃和水蜜桃果實(shí)中，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)選取的3類桃果中，存在極為相似的內(nèi)生細(xì)菌組成。

圖2 三類桃果內(nèi)生細(xì)菌群落相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of endophytic bacteria communities in three kinds of peaches

采用Alpha多樣性指標(biāo)中的香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)和辛普森指數(shù)反映桃果內(nèi)生細(xì)菌的豐富程度。由表2可知，3類樣品的Alpha多樣性指數(shù)明顯不同，油桃、蟠桃的Chao1數(shù)值與水蜜桃相比差異較大，說(shuō)明油桃、蟠桃的分化較為明顯；香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)表明，水蜜桃與油桃、蟠桃微生物群落多樣性存在明顯的差異。綜上所述，盡管3類桃果中內(nèi)生細(xì)菌群落組成較為相似，但多樣性仍存在明顯差異。

表2 不同品種桃果樣品多樣性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of sequencing data of endophytic bacteria communities in different peaches

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

將OTU注釋到各分類水平，結(jié)果如圖3所示，實(shí)驗(yàn)所得的106個(gè)OTUs共涉及細(xì)菌的9個(gè)門(mén)，31個(gè)目，59個(gè)屬。3類桃果樣本中均包含變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、柔膜菌門(mén)(Tenericutes)、熱微菌門(mén)(Thermomicrobia)、奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)共9個(gè)門(mén)。且均以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)4個(gè)菌門(mén)為主，共占樣品菌群的95%以上。

圖3 各樣品門(mén)水平上主要的內(nèi)生細(xì)菌群落組成Fig.3 Major phylums of endophytic bacteria communities in different peaches

目水平分析結(jié)果如圖4所示，3類桃果樣品中假單胞菌目(Pseudomonadales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)均為優(yōu)勢(shì)菌群，二者總計(jì)占油桃、蟠桃、水蜜桃菌群的29.35%、54.82%和45.37%，但二者在不同桃果樣品中的所占比例存在一定差異。蟠桃中腸桿菌目菌群相對(duì)含量最高，占總菌群數(shù)的36.67%，單胞菌目菌群僅占18.14%；水蜜桃中假單胞菌目菌群相對(duì)含量最高，占總菌群數(shù)的34.32%，腸桿菌目菌群僅占11.05%；而油桃中假單胞菌目、腸桿菌目相對(duì)含量均占總菌群數(shù)的15%左右。此外，芽孢桿菌目(Bacillales)菌群在油桃和蟠桃中的相對(duì)含量均約為16%左右，而在水蜜桃中僅占7.66%。

圖4 各樣品目水平上主要的內(nèi)生細(xì)菌群落組成Fig.4 Major orders of endophytic bacteria communities in different peaches

進(jìn)一步對(duì)其屬水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(表3)，3類桃果內(nèi)生細(xì)菌共涉及59個(gè)屬。其中，22個(gè)為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，約共占總菌群的83%以上，但其所占比例在不同品種的桃果中呈現(xiàn)出顯著差異。如表3所示，芽孢桿菌屬(Bacillus)和未分類菌群高度富集于油桃果實(shí)中，分別占15.63%和15.15%；而在水蜜桃中主要菌群為泛菌屬(Pantoea)和芽孢桿菌屬，其中泛菌屬菌群數(shù)占到總計(jì)的1/3以上；蟠桃中則為假單胞菌屬(Pseudomonas)和未分類菌屬菌群，分別占19.83%和16.57%。此外，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)也均為3類桃果的優(yōu)勢(shì)菌群，其所占比例均大于4%。需要指出的是，在3類桃果中均存在大量未分類菌屬，表明桃果中存在大量未知的微生物資源，有待進(jìn)一步發(fā)掘。

表3 各樣品屬水平上主要的內(nèi)生細(xì)菌群落組成Table 3 Major genera of endophytic bacteria communities in different peaches

同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，桃果中存在大量與人體健康相關(guān)的菌群。主要以芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、布勞特氏菌屬、毛螺菌屬等腸胃代謝相關(guān)的有益菌群為主。以上所述菌群能夠直接參與宿主的消化、吸收、代謝、營(yíng)養(yǎng)和免疫等生理過(guò)程。此外，桃果中也存在著如淺黃假單胞菌屬、銅綠假單胞菌屬等潛在的條件致病菌株，但其在桃果實(shí)的含量極少，均在0.9%以下，具體情況如表4、表5所示。

表4 各樣品中與人體健康有關(guān)的潛在有益菌Table 4 Potentially beneficial bacteria on human health in different peaches

表5 各樣品中與人體健康有關(guān)的條件致病菌Table 5 Conditional pathogenic bacteria on human health in different peaches

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生菌在長(zhǎng)期的系統(tǒng)演化過(guò)程中，與宿主形成了高度協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。植物可為內(nèi)生菌提供生長(zhǎng)所需要的能量及營(yíng)養(yǎng)，內(nèi)生菌可通過(guò)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)作用和自身的代謝產(chǎn)物對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[16]。蔡學(xué)清等[17-18]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌能在荔枝葉片、花、幼果及采后果皮上定殖，可在花和幼果間傳導(dǎo)，且對(duì)果實(shí)中的營(yíng)養(yǎng)成分產(chǎn)生一定影響。如內(nèi)生細(xì)菌能夠降低荔枝果實(shí)的可溶性糖、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸含量，提高還原性VC及游離有機(jī)酸和氨基酸含量。許日升等[19]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌為花生的主要類群，具有固氮、抗病、分泌植物激素、促進(jìn)花生吸收營(yíng)養(yǎng)元素等多方面的有益作用。目前也有少量研究表明，一些食品功能因子可以通過(guò)影響腸道微生物，間接地影響人體健康[20]。如KRAUTKRAMER等[21-22]發(fā)現(xiàn)勞特氏菌、糞球菌、瘤胃球菌、柯林斯氏菌等與體重指數(shù)和血脂代謝密切相關(guān)，可被認(rèn)為是腸道微生物群與肥胖之間的中介。郭虹雯等[23-24]發(fā)現(xiàn)通過(guò)改善腸道中擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比例，可達(dá)到減肥降脂的效果。

本文采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)新疆特色油桃、蟠桃、水蜜桃果內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，桃果中存在著豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源，3類實(shí)驗(yàn)桃果內(nèi)生細(xì)菌共涉及9個(gè)門(mén)的59個(gè)屬，其中以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)4個(gè)菌門(mén)為主。但不同品種間的桃果內(nèi)生細(xì)菌群落組成存在顯著差異。如芽孢桿菌屬菌群高度富集于油桃果實(shí)組織內(nèi)部，而在水蜜桃中則為泛菌屬類，蟠桃中為假單胞菌屬類。此外，通過(guò)對(duì)3類桃果內(nèi)生細(xì)菌群落組成的分析發(fā)現(xiàn)，桃果中存在著大量利于人體健康的有益菌群，可能與人體腸胃代謝相關(guān)。如雙歧桿菌可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸，幫助消化吸收，酸化腸內(nèi)環(huán)境，阻止有害菌在腸上皮的黏附[25]。阿克曼氏菌能夠分解細(xì)胞泌的黏蛋白，改善肥胖，降低血糖[26]。一些芽孢桿菌和酵母菌可參與和調(diào)節(jié)宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常消化和吸收，同時(shí)維持腸道內(nèi)微生物菌群的平衡等，降低肥胖、炎癥性腸炎、糖尿病和免疫缺陷疾病等的發(fā)生概率[27-28]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在桃果中存在一定數(shù)量的條件致病菌，其是否會(huì)在食用過(guò)程中定植并導(dǎo)致相關(guān)疾病，有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

上述研究結(jié)果，初步揭示了新疆3類桃果采后內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性，為進(jìn)一步分析桃果內(nèi)生細(xì)菌群落與人體健康的相互關(guān)系，深度挖掘與利用內(nèi)生細(xì)菌資源等研究提供了科學(xué)依據(jù)。