非釀酒酵母在葡萄酒混菌發(fā)酵中的應(yīng)用及其挑戰(zhàn)

譚鳳玲，王寶石，胡培霞，劉成功，張明霞

(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 新鄉(xiāng)，453003)

果酒風(fēng)味特性及其品質(zhì)不僅受到水果種類和釀造工藝的影響，同時與所選擇微生物的代謝活動密切相關(guān)。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)因其發(fā)酵力高[1]、耐受環(huán)境脅迫力強(qiáng)[2]，且菌種安全穩(wěn)定[3]等優(yōu)勢，成為釀造果酒的最佳微生物，而且已經(jīng)發(fā)展成為商用釀酒酵母。由于商用釀酒酵母菌的種類比較單一，形成的代謝產(chǎn)物相似，尤其是風(fēng)味化合物，導(dǎo)致風(fēng)味同質(zhì)化現(xiàn)象嚴(yán)重，降低果酒的口感以及風(fēng)味復(fù)雜度，影響果酒的潛在多樣性，不能滿足消費者的多樣化需求[4]。此外，部分釀酒酵母會在發(fā)酵過程中生成有害代謝物如氨基甲酸乙酯，是酵母代謝產(chǎn)生的尿素與乙醇反應(yīng)生成的致癌物質(zhì)[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)在果酒發(fā)酵過程中會形成更復(fù)雜的香氣，達(dá)到增加果酒香氣的效果，賦予果酒更復(fù)雜的香氣特性，提高果酒品質(zhì)。作為自然發(fā)酵的一種代替方案，非釀酒酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵已成功應(yīng)用于改善果酒口感和風(fēng)味特性，滿足了消費者對于果酒多樣化和多元化的需求[6-7]?；旌辖湍赴l(fā)酵方式逐漸成為果酒釀造領(lǐng)域的熱點。本文對釀酒酵母和非釀酒酵母混合發(fā)酵果酒過程中的接種方式、兩者間的相互作用、對果酒品質(zhì)的影響、存在的問題等方面進(jìn)行了綜述，并對其未來進(jìn)行了預(yù)測，以期為果酒混合酵母菌發(fā)酵體系的研究提供一定參考。

1 果酒混合釀造體系中的非釀酒酵母

果酒發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程，包括糖和氨基酸轉(zhuǎn)化為乙醇、CO2和一系列次級揮發(fā)性代謝物。在果酒的混合菌種發(fā)酵初期可以檢測到大量的非釀酒酵母，但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母逐漸衰亡[8]。這是因為非釀酒酵母的低酒精耐受性，使其不適應(yīng)發(fā)酵中后期的高酒精濃度環(huán)境。非釀酒酵母主要包括假絲酵母屬(Candida)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、畢赤酵母屬(Pichia)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)和克勒克酵母屬(Kloeckera)等[9-10]。大多數(shù)非釀酒酵母發(fā)酵效率較低、對SO2和pH耐受性較低[11]，一直被認(rèn)為是導(dǎo)致果酒風(fēng)味敗壞的主要原因[12]。近年來，大量研究顯示，非釀酒酵母在果酒的釀造過程發(fā)揮著積極的作用，如可以生成更多的香氣化合物，提高果酒的香氣復(fù)雜性[13-14]；也可以生成一些有益化合物如具有抗氧化性的褪黑素，從而提高果酒的營養(yǎng)價值[15]。與釀酒酵母相比，非釀酒酵母胞外酶量更高，水解更多香氣物質(zhì)前體，釋放更多的香氣物質(zhì)，從而提高果酒的香氣復(fù)雜度[16-17]。與此同時，一些非釀酒酵母可以生成更多的酯類、高級醇、甘油等具有提高香氣復(fù)雜性、降低酒精度以及豐富口感作用的代謝產(chǎn)物[18-19]。但大多數(shù)非釀酒酵母缺乏獨自完成酒精發(fā)酵的能力，釀酒酵母和非釀酒酵母的混合發(fā)酵方式可以在提高果酒風(fēng)味特性的同時完成果酒發(fā)酵過程[20]，逐漸成為發(fā)酵果酒強(qiáng)吸引力的解決方案(如圖1)。非釀酒酵母(東方伊薩酵母)和釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，不僅可以大大減弱前者生成的醚的味道，還可以保留后者帶來的花香、果香，提高果酒的品質(zhì)[21]。因此，采用釀酒酵母和非釀酒酵母混合發(fā)酵方式，可以生成更多有益次級代謝產(chǎn)物，豐富果酒的口感和風(fēng)味，從而顯著提高果酒的質(zhì)量和品質(zhì)[22]。

圖1 釀酒酵母與非釀酒酵母生理特性比較Fig.1 Comparison of physiological characteristics between S.cerevisiae and non-S.cerevisiae

2 非釀酒酵母對果酒混合釀造體系的影響

2.1 接種方式對果酒品質(zhì)的影響

大部分非釀酒酵母缺乏獨立完成酒精發(fā)酵的能力，只有在釀酒酵母的幫助下才能完成。同時，一些非釀酒酵母胞外酶(如糖苷酶、果膠酶等)含量更加豐富，水解更多香氣物質(zhì)前體，可以增加果酒的香氣化合物[23]。因此將兩種酵母菌的混合發(fā)酵應(yīng)用到果酒釀造工藝中，生成更多的香氣物質(zhì)，或者兩者的部分代謝物之間生成新的代謝物質(zhì)，可以彌補(bǔ)彼此在香氣上的不足[24]。在果酒混合發(fā)酵體系中，不同階段的發(fā)酵液環(huán)境不同，釀酒酵母與非釀酒酵母對環(huán)境的適應(yīng)能力不同[25]。所以若采用的接種方案不同，則釀酒酵母與非釀酒酵母之間的相互作用不同，從而以不同的方式提高果酒的香氣復(fù)雜性。

果酒混合發(fā)酵體系酵母菌接種方案主要包括同時接種和順序接種，兩種接種方案均可以減弱由非釀酒酵母純種發(fā)酵引起的不良風(fēng)味并能保持兩者的積極特性[26]。同時接種非釀酒酵母與釀酒酵母發(fā)酵果酒時，首先由非釀酒酵母進(jìn)行代謝生成相關(guān)的代謝物，尤其是生成的β-葡萄糖苷酶，可以水解糖復(fù)合物前體中的糖苷鍵，釋放更多的活性芳香化合物；然后由釀酒酵母主導(dǎo)完成發(fā)酵過程，從而提高果酒的品質(zhì)[27-28]。但同時接種時，會出現(xiàn)非釀酒酵母過早死亡的現(xiàn)象，導(dǎo)致其對果酒香氣的貢獻(xiàn)有限[29]。

順序接種又分為先接種釀酒酵母和后接種釀酒酵母兩種類型，即2種酵母菌的接種時間及接種順序均不相同。這2種順序接種方式各有其優(yōu)點，如釀酒酵母產(chǎn)生的異戊醇含量高于非釀酒酵母，先接種釀酒酵母，會降低異戊醇含量，減弱由異戊醇含量過高產(chǎn)生的指甲油味；相反，若是先接種非釀酒酵母，等其生長至對數(shù)期時接種釀酒酵母，生成的果酒擁有最豐富的香氣物質(zhì)。戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母順序接種發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)酒樣中萜烯類、高級醇和酯類香氣化合物等15種化合物含量升高[30]。與同時接種相比，順序接種對營養(yǎng)物質(zhì)的利用程度更高，不僅提高了果酒的品質(zhì)，而且可以提高原料利用率。

綜上所述，釀酒酵母和非釀酒酵母的混合發(fā)酵通過變換接種方式來改變發(fā)酵液中微生物類型及其生理活性，并作用于微生物的生長代謝，產(chǎn)生不同的香氣物質(zhì)，由這些香氣物質(zhì)之間的相互作用提高果酒的風(fēng)味復(fù)雜性，進(jìn)而提高果酒的品質(zhì)。

2.2 果酒混合釀造體系中酵母菌間的交互作用

在果酒的混合菌種發(fā)酵中，釀酒酵母可以作用于非釀酒酵母，并改變其部分特性[6]， 2種酵母菌之間的相互作用即為間接相互作用。在果酒混合釀造的過程中，會出現(xiàn)2種酵母菌的交替現(xiàn)象，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象是由酵母菌間的代謝產(chǎn)物抑制、細(xì)胞接觸抑制等相互作用造成的[31]。除此之外，酵母菌之間的相互作用還包括代謝物互作(累加效應(yīng)、協(xié)同效應(yīng)和負(fù)面效應(yīng))以及基因表達(dá)和酶活性的相互作用等[32](圖2)。

圖2 果酒混合釀造體系中酵母菌之間的相互作用[33]Fig.2 Interactions between yeasts in the mixed brewing system of fruit wine

在酵母菌的生長過程中，氮源、水和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)缺一不可，混合發(fā)酵體系中，兩種酵母菌之間會相互競爭營養(yǎng)物質(zhì)[34]。若一種酵母菌對一種營養(yǎng)成分的吸收超過平均值之后，則會影響其他酵母菌對此成分的利用，從而影響其他酵母菌的生長，甚至導(dǎo)致其死亡。研究發(fā)現(xiàn)Hanseniasporauvarum與釀酒酵母混合發(fā)酵時，會搶奪發(fā)酵液中的微量元素，導(dǎo)致后者的營養(yǎng)流失[35]。因此，部分酵母菌通過營養(yǎng)競爭作用于發(fā)酵過程中的微生物并改變其類型、生理活性，從而影響果酒的品質(zhì)。PRIOR等[34]的研究表明，部分釀酒酵母與非釀酒酵母的氮源偏好以及氨基酸的吸收順序不同，甚至在順序接種時，先接種的非釀酒酵母可以提供一些含氮化合物和其他營養(yǎng)物質(zhì)，被后接種的釀酒酵母所利用。

釀酒酵母在與非釀酒酵母的混合發(fā)酵過程中，會生成毒性代謝物、中長鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，抑制非釀酒酵母菌的生長[31]；有些非釀酒酵母也會產(chǎn)生類似的代謝物質(zhì)，對釀酒酵母的生長代謝產(chǎn)生影響，導(dǎo)致發(fā)酵過程中酵母菌的交替現(xiàn)象[36]。翟明昌等[37]用透析袋發(fā)酵法，證明了在混合發(fā)酵過程中，釀酒酵母會產(chǎn)生一些分子質(zhì)量不同的代謝產(chǎn)物(10 kDa蛋白類物質(zhì))，正是這些物質(zhì)誘導(dǎo)了克魯維酵母的衰亡。與此同時，一些非釀酒酵母的部分代謝物質(zhì)，如鐵紅梅氏酵母和葡萄汁有孢漢生酵母可以生成對釀酒酵母有益的氨基酸，促進(jìn)釀酒酵母的生長[38]。在釀造果酒時，部分酵母細(xì)胞接觸之后會導(dǎo)致致死因子的出現(xiàn)，從而對酵母菌株產(chǎn)生影響。如Torulasporadelbrueckii在與釀酒酵母接觸之后衰亡，似乎是細(xì)胞間接觸和可溶性致死分子釋放的原因，但是這種作用的具體機(jī)制尚不清晰[32]。部分非釀酒酵母具有疊加效應(yīng)，可將其與釀酒酵母對果酒發(fā)酵的積極或消極作用疊加，即通過兩者間的協(xié)同作用發(fā)揮更大的影響。釀酒酵母和德爾布酵母兩種酵母菌可以通過協(xié)同作用提高發(fā)酵制品中的琥珀酸、乙酸和必需氨基酸的產(chǎn)量[20]。HU等[39]也發(fā)現(xiàn)了一種有孢漢遜酵母，與釀酒酵母的協(xié)同反應(yīng)可以增加中鏈脂肪酸乙酯的生成量。申靜云等[40]研究葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)與釀酒酵母DV10混合發(fā)酵，促進(jìn)了萜烯類和酯類物質(zhì)合成，其中乙酸苯乙酯提高14.6倍，增強(qiáng)了果酒黃油味和花果香。

綜上所述，酵母菌之間的相互作用在很大程度上取決于酵母菌的種類。不同酵母菌之間的相互作用及其本身的發(fā)酵動力學(xué)均有顯著差異[41]。果酒的混合菌種釀造工藝正是利用這些差異，選擇不同的酵母菌株，通過它們之間的相互作用改變發(fā)酵過程中微生物的類型及其生理活性，從而生成不同的代謝產(chǎn)物，對果酒的品質(zhì)產(chǎn)生不同的影響。

3 混合菌種發(fā)酵果酒的挑戰(zhàn)

文獻(xiàn)報道的關(guān)于釀酒酵母與非釀酒酵母相互作用的研究，許多是基于人工模擬果酒的自然發(fā)酵過程獲得的。但參與果酒自然發(fā)酵過程的微生物較多，還存在一些未知微生物，可能與酵母菌之間存在相互作用。除此之外，混合發(fā)酵方式雖可以提高果酒的品質(zhì)，但特定非釀酒酵母在混合發(fā)酵中可能會引起其與釀酒酵母的拮抗作用，積累一些不理想代謝物[42]；兩種酵母菌的接種率不同也可以改變果酒的香氣特性和酒精含量。所以非釀酒酵母種類、與釀酒酵母的接種比例和接種時機(jī)不當(dāng)，則其與釀酒酵母的混合發(fā)酵會增加果酒的不穩(wěn)定香氣，甚至?xí)l(fā)果酒中的異味[39]。綜上所述，雖然已經(jīng)證實了非釀酒酵母在混菌發(fā)酵過程中的積極作用，并將其投入實踐，也有研究發(fā)現(xiàn)了酵母菌之間相互作用的類型。但到目前為止，關(guān)于種水平上非釀酒酵母與釀酒酵母的具體作用類型，以及相互作用的分子機(jī)制，還未完全得知。并且對于已知相互作用的混菌發(fā)酵體系，未能實現(xiàn)酵母菌株之間的有效協(xié)調(diào)。同時，我們對非釀酒酵母的新陳代謝和生長繁殖的有限理解，仍然是妨礙充分開發(fā)利用非釀酒酵母的障礙。因此，應(yīng)用釀酒酵母與非釀酒酵母混合菌種發(fā)酵果酒，需要結(jié)合現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)，將混合發(fā)酵體系進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。

大多數(shù)非釀酒酵母可以應(yīng)用于共發(fā)酵體系，需要在分子水平上深度理解釀酒酵母和非釀酒酵母之間相互作用[43-44]。另一個重要點是菌株的特異性，因此必須開發(fā)新的高通量篩選方法，以便篩選出大量的菌株來適應(yīng)特定的性狀。最后，對于一些菌株，為了獲得實用的商業(yè)化非釀酒酵母菌，主要的挑戰(zhàn)是找到理想的保存條件，以獲得活性干酵母或凍干菌株。近年來，關(guān)于酵母菌共培養(yǎng)體系研究越來越多，VAN RIJSWIJCK等[45]建立了不同酵母菌單獨培養(yǎng)的動態(tài)模型，此模型可以用于預(yù)測釀酒酵母與非釀酒酵母共培養(yǎng)時的發(fā)酵性能，有望為果酒混合發(fā)酵體系提供指導(dǎo)。

4 展望

果酒傳統(tǒng)釀造工藝中普遍采用商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵，但由此工藝生產(chǎn)出的果酒出現(xiàn)了風(fēng)味同質(zhì)化的現(xiàn)象。為了滿足消費者的需求，人們對非釀酒酵母進(jìn)行了研究，并將其應(yīng)用到與釀酒酵母的混合發(fā)酵中，生產(chǎn)更高品質(zhì)的果酒。全球氣溫的回升，造成釀酒葡萄的糖含量增高而酸度降低，在釀酒時需要選擇低醇和增酸的菌種，來提高葡萄酒的品質(zhì)。近年來，發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母如伊薩酵母屬、畢赤酵母屬、有孢漢遜酵母屬和德巴利酵母屬，能夠分泌豐富的糖苷酶類，將香氣前體水解，增強(qiáng)品種香氣，降低乙醇濃度和揮發(fā)酸濃度，萜烯類、高級醇和酯類香氣化合物。同時發(fā)現(xiàn)同一屬不同酵母株間，對葡萄酒香氣影響存在差異，在釀酒時需要根據(jù)原料和產(chǎn)地選擇合適的釀酒酵母和非釀酒酵母組合。但是，關(guān)于釀酒酵母和非釀酒酵母混合發(fā)酵果酒研究，大多集中在發(fā)酵工藝對果酒品質(zhì)的影響，關(guān)于兩種酵母菌之間相互作用尚不清晰。未來，結(jié)合現(xiàn)代微生物組學(xué)技術(shù)和大數(shù)據(jù)模擬計算等新型技術(shù)手段，有望揭示關(guān)于非釀酒酵母與釀酒酵母的交互作用及其作用機(jī)理。同時結(jié)合現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)，實現(xiàn)混合菌種發(fā)酵體系的理性調(diào)控，為創(chuàng)制新型多樣化果酒奠定基礎(chǔ)。