反向離子對(duì)高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用分析富硒食品中硒的形態(tài)

黃韜睿，王鑫，王小平

(1.四川旅游學(xué)院 烹飪學(xué)院，成都 610100；2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，成都 610097)

硒是人體必需的微量元素，具有抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等顯著的生理功能，所以維持機(jī)體中適量的硒水平能預(yù)防多種疾病，如癌癥、克山病、大骨節(jié)病等[1]。然而，從世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)來看，全球存在普遍缺硒的問題，40多個(gè)國家和地區(qū)處于低硒或缺硒的狀態(tài)[2]。目前人們可通過多種途徑補(bǔ)充硒元素，如藥物、硒營養(yǎng)強(qiáng)化劑、膳食補(bǔ)硒等，其中通過食物補(bǔ)硒是最便捷的方法，也是最值得推崇的方法，因此諸如富硒大米、富硒小麥、富硒酵母、富硒平菇、富硒靈芝、富硒土豆、富硒豬肉、富硒酸奶等富硒食品的研究和開發(fā)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[3]。硒元素毒性與營養(yǎng)的閾值范圍極窄，國際學(xué)術(shù)組織聯(lián)合會(huì)(FAO/WHO/IAEA)建議成年男女膳食硒適宜需要量分別為40 μg/d和30 μg/d[4]。長期食用低于0.1 mg/kg的含硒食物會(huì)導(dǎo)致人體硒缺乏反應(yīng)癥，長期食用硒高于1 mg/kg的食物則會(huì)引起硒中毒[5]。硒元素在食品中的形態(tài)主要分為無機(jī)硒和有機(jī)硒，無機(jī)硒主要包括單質(zhì)硒、硒酸鹽、亞硒酸鹽、揮發(fā)態(tài)的甲基硒和硒化氫[6]，有較大毒性。有機(jī)硒主要為大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物，大分子硒主要包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等，小分子硒化物包括硒甲基硒半胱氨酸、硒代高胱氮酸、硒代蛋氨酸和硒肽等。有機(jī)硒毒性遠(yuǎn)低于無機(jī)硒，生物活性更高，富含營養(yǎng)，更有利于人體吸收[7]。

目前絕大多數(shù)食品標(biāo)準(zhǔn)中涉及到的硒都是總硒含量，但是這對(duì)于食品中硒的營養(yǎng)和毒性分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。市面上富硒產(chǎn)品越來越多，為了消費(fèi)者能夠吃上真正的富硒食品，享受硒元素的保健效果，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法檢測(cè)食品、藥品及保健品等產(chǎn)品中的硒含量以及對(duì)硒元素形態(tài)進(jìn)行分析對(duì)人類的健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要意義[8]。

而要實(shí)現(xiàn)食品中不同硒元素形態(tài)的分析，首先必須建立食品中硒化物的提取、分離和檢測(cè)方法。目前，食品中硒化物的提取方法主要有水提取法、酸提取法、酶提取法、固相萃取法等[9-16]，也有使用氫氧化鈉、Tris-鹽酸緩沖液等作為提取劑的提取方法[17,18]。由于食品中硒形態(tài)的復(fù)雜性和多樣性，目前所發(fā)展的測(cè)定技術(shù)對(duì)無機(jī)硒的形態(tài)分析較為成熟，而對(duì)有機(jī)硒的形態(tài)分析方法在測(cè)定實(shí)際樣品時(shí)還要進(jìn)一步完善。為此，需將各種分離方法和檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，并且期待聯(lián)用技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展[19]。硒化物分離檢測(cè)的主流方法包括液相色譜與原子熒光聯(lián)用法(HPLC-AFS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS)、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-ICP-MS)、氣相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-ICP-MS)和電泳及其聯(lián)用技術(shù)等[20-23]。本實(shí)驗(yàn)將運(yùn)用酶解技術(shù)提取富硒食品中的硒化物并通過反向離子對(duì)高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)富硒食品中硒酸根(SeO42-)、亞硒酸根(SeO32-)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)5種主要形態(tài)的硒化物進(jìn)行分離和檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

硒酸根溶液Se4、亞硒酸根溶液Se6、硒代胱氨酸SeCys2(98%)、硒甲基硒代半胱氨酸MeSeCys(98%)、硒代蛋氨酸SeMet(98%)、胰蛋白酶、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、磷酸二氫鉀(色譜純)、七氟丁酸(色譜純)、甲醇(色譜純)：美國Sigma公司；富硒酵母標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(產(chǎn)地：湖北恩施)；富硒茶(產(chǎn)地：湖北恩施)；富硒大米(產(chǎn)地：廣西河池)；富硒礦泉水(產(chǎn)地：陜西安康)；富硒馬鈴薯(產(chǎn)地：湖北恩施)；富硒小米(產(chǎn)地：湖北恩施)。

1.1.2 儀器

Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色譜儀、SNO2355R iCAP RQ ICP-MS電感耦合等離子質(zhì)譜儀、Hypersil GOLD C8反向色譜柱 美國賽默飛世爾公司；7DFE8C7A恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；3K30離心機(jī) 美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硒化合物的提取

本文使用在2018年6月21日發(fā)布的第一個(gè)關(guān)于食品中有機(jī)硒的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1903.28-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑 硒蛋白》中推薦的一種混合酶解提取硒化物的方法[24]：采用胰蛋白酶、蛋白酶K和鏈霉蛋白酶在Tris-HCl緩沖液中37 ℃條件下振蕩酶解36 h，經(jīng)離心、截留大分子、過濾后上機(jī)，具體步驟見圖1。

圖1 硒化物提取流程圖

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將5種標(biāo)準(zhǔn)溶液用去氣水配制成空白、1，5，10，50 μg/L。

1.2.3 色譜條件及儀器參數(shù)

無機(jī)硒和硒代氨基酸的極性較強(qiáng)，在一般的C8或C18反相柱上保留很弱，不能實(shí)現(xiàn)有效分離，可以通過加入離子對(duì)試劑改善目標(biāo)化合物在反相柱上的保留。實(shí)驗(yàn)采用Hypersil GOLD C8作為分離柱，磷酸二氫鉀-七氟丁酸-甲醇-水體系作流動(dòng)相，其中七氟丁酸作為離子對(duì)試劑，磷酸二氫鉀作緩沖鹽增加了離子強(qiáng)度，提高了流動(dòng)相洗脫能力，運(yùn)用Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色譜與iCAP RQ ICP-MS聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了5種Se形態(tài)的快速高效分離。iCAP RQ具有專利Flatapole碰撞反應(yīng)池QCell，本實(shí)驗(yàn)使用單氦氣作為動(dòng)能歧視效應(yīng)(KED)的碰撞氣體，選擇性地有效抑制了多原子離子對(duì)78Se+的干擾，同時(shí)能保持相聯(lián)設(shè)備(HPLC-ICP-MS)的高靈敏度。實(shí)驗(yàn)中直接將柱子出口與霧化器相聯(lián)完成儀器之間的聯(lián)用。同時(shí)用通訊電纜連接到iCAP RQ ICP-MS的I/O面板，建立雙向觸發(fā)。使用Thermo Scientific Qtegra控制軟件的tQuant功能實(shí)現(xiàn)全部定量分析(峰面積積分、濃度、校準(zhǔn)曲線擬合等)。具體色譜條件及儀器參數(shù)見表1和表2。

表1 5種硒化物分離色譜條件

表2 檢測(cè)儀器參數(shù)

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

將1.2.2制備的5種硒化物同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別混合，按照1.2.3色譜條件及儀器參數(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)，記錄5種硒化物在不同濃度下的峰面積積分并分別制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 不同硒形態(tài)檢出限測(cè)定

在空白樣品中加入5 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍基線噪音測(cè)定5種硒化物的檢出限。

1.2.6 回收率測(cè)定

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，選取富硒酵母標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(SELM-1)作為分析對(duì)象按照所確定方法檢測(cè)其中硒代蛋氨酸含量，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品證書標(biāo)稱含量計(jì)算方法回收率。

1.2.7 樣品檢測(cè)

選取市售富硒茶(樣品1)、富硒大米(樣品2)、富硒礦泉水(樣品3)、富硒馬鈴薯(樣品4)、富硒小米(樣品5)5種樣品進(jìn)行硒元素含量檢測(cè)和5種不同硒元素形態(tài)的分離檢測(cè)，計(jì)算總硒的提取回收率，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.8 方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證

為了考察方法的準(zhǔn)確度，向市售樣品提取液中加入5種硒形態(tài)濃度同為38 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別計(jì)算5種硒化物的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種硒形態(tài)各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜疊加圖

將5種不同硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)液混合物按照1.2.3色譜條件及儀器參數(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)，將5種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合液所得色譜圖進(jìn)行疊加，結(jié)果見圖2。

圖2 5種硒形態(tài)各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜疊加圖

由圖2可知，本文所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hypersil GOLD C8，以七氟丁酸-磷酸二氫鉀-甲醇-水為流動(dòng)相等度洗脫，對(duì)5種硒形態(tài)的分離效果較好，采用常規(guī)粒徑液相色譜柱實(shí)現(xiàn)了在800 s內(nèi)完成5種硒形態(tài)的快速分離。

2.2 5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.4制定5種不同硒化物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種硒化物在0～50 μg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均為1.000，線性關(guān)系良好，見表3。

表3 5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

2.3 檢出限的測(cè)定

0.5 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖3，各形態(tài)峰高均≥基線噪音的3倍，SeO42-、SeO32-、SeCys2、MeSeCys和SeMet的檢出限可分別達(dá)到0.20,0.25,0.25,0.20,0.50 μg/L。

圖3 0.5 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.4 回收率測(cè)定結(jié)果

按照1.2.6方法，測(cè)定富硒酵母標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(SELM-1)中硒代蛋氨酸結(jié)果及回收率，見表4。結(jié)果表明該法回收率高，回收效果好。

表4 富硒酵母標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.5 樣品檢測(cè)結(jié)果

選取市售富硒茶(樣品1)、富硒大米(樣品2)、富硒礦泉水(樣品3)、富硒馬鈴薯(樣品4)、富硒小米(樣品5)作為樣品進(jìn)行硒元素含量檢測(cè)和5種不同硒元素形態(tài)的分離檢測(cè)，按照1.2所建立的方法，樣品中5種硒元素形態(tài)均能實(shí)現(xiàn)有效分離，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)采用的混合酶解提取硒化物方法提取效率較高，能有效實(shí)現(xiàn)富硒食品中硒化物的提取，另外從結(jié)果中也可以看出5種富硒食品樣本中硒種類與含量各不相同，其營養(yǎng)價(jià)值及利用度值得深入探究。

表5 樣品檢測(cè)結(jié)果

2.6 方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

為了考察方法的準(zhǔn)確度，向市售樣品提取液中加入5種硒形態(tài)濃度同為38 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別計(jì)算5種硒化物的回收率，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，該方法對(duì)5種不同硒元素形態(tài)回收率好、準(zhǔn)確度高。

表6 回收率驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了利用反向離子對(duì)高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用分離檢測(cè)富硒食品中硒酸根(SeO42-)、亞硒酸根(SeO32-)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)5種不同硒元素形態(tài)的方法，其中采用胰蛋白酶、蛋白酶K和鏈霉蛋白酶在Tris-HCl緩沖液中37 ℃條件下振蕩酶解36 h提取食品中的硒化合物。結(jié)果表明：所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hypersil GOLD C8常規(guī)粒徑液相色譜柱，以七氟丁酸-磷酸二氫鉀-甲醇-水為流動(dòng)相等度洗脫，實(shí)現(xiàn)了在800 s內(nèi)完成5種硒元素形態(tài)的快速準(zhǔn)確分析。通過市售富硒食品樣品驗(yàn)證，該方法是一種有效可行的對(duì)富硒產(chǎn)品中硒形態(tài)的分析方法。硒元素對(duì)人體的保健功能越來越被重視，目前市面上的富硒食品種類也越來越多，此方法的建立將有助于對(duì)富硒食品中硒元素的形態(tài)和硒對(duì)人體的作用進(jìn)行更深層次的研究，為國家食品監(jiān)管部門建立更完善的富硒食品國家標(biāo)準(zhǔn)和富硒食品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)，使富硒食品市場變得更加規(guī)范，為消費(fèi)者更好地選擇和食用富硒食品提供了保障。