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    建立檢測(cè)醬油中8種生物胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(LC-MS)

    2020-12-01 02:37:00沙麗娜吐爾洪買買提阿孜古麗衣該木艾買提江阿衣甫別克張明玥
    中國(guó)調(diào)味品 2020年11期
    關(guān)鍵詞:濾膜微孔醬油

    沙麗娜,吐爾洪·買買提,阿孜古麗·衣該木,艾買提江·阿衣甫別克,張明玥

    (1.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院,烏魯木齊 830011;2.新疆大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 能源材料化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830046)

    生物胺(biogenic amine, BA)是一種有生物活性的、低分子量的、含氮有機(jī)化合物的總稱。生物胺對(duì)內(nèi)臟功能和免疫系統(tǒng)的代謝過程起著非常重要的作用,主要存在于各種各樣含蛋白質(zhì)比較豐富的食物中,比如乳制品類、飲料、魚產(chǎn)品類和各種發(fā)酵食品。據(jù)報(bào)道,生物胺是由原料中的微生物或者酶通過代謝產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用形成的。它不僅在各種動(dòng)植物的組織中存在,也微量存在于人體中。目前雖然制定食品中生物胺禁限用標(biāo)準(zhǔn)比較困難,但部分國(guó)家已經(jīng)嘗試根據(jù)不同食品的特性給出生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)對(duì)水產(chǎn)品中組胺的限量為50 mg/kg,酪胺的限量范圍為100~800 mg/kg;歐盟對(duì)食品中組胺的限量為100 mg/kg,酪胺的限量范圍為100~800 mg/kg,對(duì)水產(chǎn)品中組胺的限量為100 mg/kg;而我國(guó)對(duì)鮐鲹魚中組胺的限量為1000 mg/kg,對(duì)其他海產(chǎn)魚類中組胺的限量為300 mg/kg。

    醬油是一種世界流行的色、香、味俱全的液體調(diào)味品[1],具有特殊的香氣、色澤、風(fēng)味和體態(tài)[2],是人們?cè)谌粘I钪蝎@取鹽類的一個(gè)重要來源[3],也是經(jīng)常使用到的含有生物胺的發(fā)酵食品,有研究報(bào)道稱高含量的酪胺可能與生產(chǎn)醬油過程中衛(wèi)生條件不好有關(guān),同時(shí)與尸胺和腐胺的高含量有關(guān)。人類食用到的微量的生物胺一般不會(huì)對(duì)自身造成不良影響,但積累到一定程度時(shí),在體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生毒害作用,比如血壓變化、呼吸紊亂等不良反應(yīng)。但是目前現(xiàn)行有效的醬油檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中卻沒有生物胺的相關(guān)檢測(cè)[4],故以人體健康和食品安全為起點(diǎn),建立一種簡(jiǎn)易、靈敏、快速、高通量的生物胺含量檢測(cè)方法有重要的意義。

    如目前多數(shù)方法一樣,食品中生物胺檢測(cè)現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.208-2016《食品中生物胺的測(cè)定》中樣品前處理需要衍生化[5-7],有些需要固相萃取小柱凈化處理,而本次試驗(yàn)采用連續(xù)三相液液萃取的前處理方法,簡(jiǎn)單易行,毒害小。目前常用的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法、生物傳感器法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、電化學(xué)法、離子色譜法、熒光光度法、分子印跡法和紫外可見光分光光度法等[8-15]。國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法對(duì)于一些痕量的物質(zhì)無法進(jìn)行定量分析,故本次試驗(yàn)使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,并做了方法學(xué)試驗(yàn)。該方法檢測(cè)時(shí)間短,且質(zhì)譜法的檢測(cè)靈敏度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液相色譜法,提高了對(duì)一些含量較低的樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性,尤其對(duì)一些只需要定性檢測(cè)的樣品,提供了快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

    生物胺標(biāo)準(zhǔn)品:色胺(純度98%)、尸胺(純度98%)、組胺(純度≥98%)、苯乙胺(純度99%)、腐胺(純度≥98%)、酪胺(純度≥98.5%)、精胺(純度≥97%)、亞精胺(純度≥98%),均購自上海源葉生物科技有限公司;乙醇:分析純,天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;甲酸銨:色譜純,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;乙酸銨:色譜純,ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai) Inc.;甲醇、乙腈:均為色譜純,購自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;品牌1及品牌2生抽醬油、紅燒醬油、老抽醬油、味極鮮和海鮮醬油:均購自本地超市。

    1.1.2 試驗(yàn)儀器

    XEVO-TQS Micro型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司;CPA 225D型電子分析天平(感量十萬分之一) 德國(guó)賽多利斯公司;RP-1D型磁力攪拌器 Wiggens Labortechnik公司;DMT-2500型渦旋混合儀 Miulab公司;MAXQ4000型震蕩搖床 美國(guó)Thermo Scientific公司;Milli-Q超純水制備儀 美國(guó)Millipore公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

    分別稱取8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各約20 mg(精確至0.00001 g),置于10 mL容量瓶中,作為標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液,再分別取適量制成系列濃度為1,5,10,20,50,100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,待測(cè)?;旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流(total ion chromatography,TIC)圖見圖1。

    圖1 8種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液TIC圖

    1.2.2 供試品溶液的制備

    取醬油樣品3 mL加入5 mL、pH值為13的氫氧化鈉溶液中,放在轉(zhuǎn)速為500 r/min的磁力攪拌器上,用二氯甲烷進(jìn)行萃取,通過選擇性透過膜后,由于濃度差進(jìn)入另一邊的二氯甲烷中,最終被反萃取至濃度為0.4 mol/L的鹽酸溶液中,最后用滴管小心將混有樣品的鹽酸溶液吸取出來,過濾,待測(cè)。具體萃取裝置圖見圖2。

    圖2 萃取裝置及過程圖

    1.2.3 試驗(yàn)條件

    表1 8種生物胺的質(zhì)譜檢測(cè)條件

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    根據(jù)測(cè)得的供試品溶液中生物胺的峰面積值,帶入2.1得到的生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中,計(jì)算出對(duì)應(yīng)的生物胺濃度,按照下式計(jì)算待測(cè)供試品中生物胺的含量ω:

    式中:ω表示樣品中激素類組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/g;ρ表示從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)組分的質(zhì)量濃度,μg/mL;V表示樣品定容體積,mL;m表示樣品取樣量,g。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 方法學(xué)試驗(yàn)

    2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    按照“1.2.3”項(xiàng)下的試驗(yàn)條件,將上述樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入液相色譜中,進(jìn)行生物胺的含量檢測(cè),所得的生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

    表2 8種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.1.2 精密度試驗(yàn)

    取標(biāo)準(zhǔn)品溶液,連續(xù)測(cè)定6次,記錄結(jié)果數(shù)據(jù)。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的生物胺含量結(jié)果的RSD(n=6)為0.30%~0.86%。

    2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    選取標(biāo)曲中間點(diǎn)(即濃度為20 ng/mL左右)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,測(cè)量其在6,12,24,30,40,48 h時(shí)的峰面積,標(biāo)準(zhǔn)品溶液的生物胺含量結(jié)果的RSD(n=6)為2.19%~6.44%。

    2.1.4 檢出限與定量限

    經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證,選取標(biāo)曲的最低點(diǎn)(約1.0 ng/mL)作為生物胺的定量限(苯乙胺因響應(yīng)值較低,故其定量限約為3.0 ng/mL);將標(biāo)曲最低點(diǎn)精密稱取3 mL,用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至10 mL容量瓶中,即濃度為約0.3 ng/mL作為儀器的檢出限(苯乙胺因響應(yīng)值較低,故其定量限約為1.0 ng/mL)。

    2.1.5 加標(biāo)回收率

    將8種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白樣品(與醬油基質(zhì)相同的純凈水)中,一般選取標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點(diǎn)的濃度(本次試驗(yàn)選取生物胺的濃度約為20 ng/mL),分別平行加入6份空白樣品中,按照“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備,待測(cè)。得到的加標(biāo)回收率的具體數(shù)據(jù)見表3。

    表3 8種生物胺的加標(biāo)回收率結(jié)果(n=6)

    2.1.6 樣品測(cè)定結(jié)果

    購買了2個(gè)品牌10個(gè)批次的醬油,其中,生抽和老抽都是經(jīng)過釀造發(fā)酵加工成的醬油,紅燒醬油屬于老抽的一種;高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝適合制作生抽及味極鮮[16],海天味業(yè)則以廣式高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝為主,該方法便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化、節(jié)約化、清潔化生產(chǎn), 并且釀制出的醬油呈香濃郁、品質(zhì)優(yōu)良[17];海鮮醬油是以特級(jí)生抽醬油為主料,配以經(jīng)現(xiàn)代工藝提煉出的海魚蝦的精華液。按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,按照“1.2.3”項(xiàng)下的試驗(yàn)條件分別進(jìn)行測(cè)定,記錄結(jié)果數(shù)據(jù),結(jié)果見表4。

    表4 市售10醬油中生物胺的含量(ng/mL)

    由表4可知,不同品牌不同品種醬油中生物胺的種類和含量差異均較大,其中苯乙胺、腐胺和酪胺的相對(duì)含量較高,色胺和精胺的相對(duì)含量較低,但是沒有一種品牌的醬油是不含有生物胺的。有研究報(bào)道稱高含量的酪胺可能與生產(chǎn)醬油過程中衛(wèi)生條件不好有關(guān),同時(shí)與尸胺和腐胺的高含量有關(guān)。

    2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

    2.2.1 有機(jī)溶劑的考察

    選擇合適的有機(jī)溶劑是液-液萃取過程的關(guān)鍵因素,在連續(xù)三相液相萃取中,萃取溶劑應(yīng)滿足以下條件:分析物在該有機(jī)溶劑中有足夠大的溶解度;與水不互混溶,盡可量減少在萃取過程中的損失[18];使用正L型萃取池時(shí),有機(jī)溶劑的密度要大于水的密度,反之相反;毒性要低,避免對(duì)環(huán)境的污染及試驗(yàn)操作人員的危害;與微孔濾膜不能發(fā)生作用;不與目標(biāo)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),且穩(wěn)定性好。故本次試驗(yàn)中考察了二氯甲烷、氯仿和四氯化碳萃取劑對(duì)生物胺萃取效率的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇萃取率最高的二氯甲烷作為提取溶劑,具體試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

    圖3 不同萃取溶劑對(duì)生物胺萃取率的影響

    2.2.2 微孔濾膜的考察

    在連續(xù)三相液相萃取過程中微孔濾膜的選擇非常重要,微孔濾膜應(yīng)該具有以下特征:微孔濾膜應(yīng)該是疏水性膜;不能與有機(jī)溶劑發(fā)生相互作用;微孔濾膜的厚度要適中,微孔濾膜太厚則透過率低,引起萃取效率的下降;如果微孔濾膜太薄,在萃取過程中容易引起誤差。微孔濾膜的孔徑也要適宜;孔徑太大會(huì)導(dǎo)致水和其他大分子雜質(zhì)物直接透過膜;如果孔徑太小會(huì)引起萃取效率的下降。試驗(yàn)中考察了聚四氟乙烯(其中1號(hào)孔徑為37 μm,2號(hào)孔徑為106 μm)、聚丙烯、尼龍、不銹鋼網(wǎng)4種不同的膜對(duì)生物胺萃取率的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇萃取率最高的聚四氟乙烯(2號(hào)孔徑為106 μm)作為微孔濾膜,具體試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

    圖4 不同濾膜材質(zhì)對(duì)生物胺萃取率的影響

    2.2.3 給體相pH的考察

    給體相與接受相pH在液-液-液三相萃取中起到重要作用。液-液-液三相體系包含給體相、有機(jī)相、接受相3個(gè)液相,對(duì)于堿性分析物通過向給體相中加入堿調(diào)節(jié)給體相的pH值大于目標(biāo)物的pKa值,使目標(biāo)物去離子化以降低其在給體相中的溶解度。通過攪拌使給體相中的目標(biāo)分析物擴(kuò)散并依靠疏水作用進(jìn)入有機(jī)相,接受相中加酸是為了提供質(zhì)子在有機(jī)相和接受相界面使目標(biāo)分析物質(zhì)子化,則被萃取到接受相[19]。本文考察了給體相10~14范圍內(nèi)的pH值對(duì)生物胺萃取效率的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇萃取率最高的13作為給體相的pH值,具體試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

    圖5 不同給體相的pH對(duì)生物胺萃取率的影響

    2.2.4 接受相鹽酸濃度的考察

    鑒于接受相鹽酸濃度對(duì)生物胺萃取效率的影響,本文考察了接受相在0.1~0.5 mol/L范圍內(nèi)的鹽酸濃度對(duì)生物胺萃取效率的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇萃取率最高的0.4 mol/L作為接受相的鹽酸濃度,具體試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

    圖6 不同鹽酸濃度對(duì)生物胺萃取率的影響

    2.2.5 攪拌速率的考察

    攪拌速率是影響萃取效率的另一重要因素。由于攪拌增加接觸面從而可以提高萃取效率,尤其是連續(xù)三相液相萃取中,通過攪拌增加待測(cè)組分快速透過微孔濾膜并縮短平衡時(shí)間。同時(shí),快速攪拌可能造成萃取劑的揮發(fā)損失與產(chǎn)生大量氣泡從而降低萃取效率。在試驗(yàn)中選擇200,300,400,500,600 r/min 5個(gè)不同的攪拌速率進(jìn)行考察。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇萃取率最高的500 r/min作為攪拌速率,具體試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

    圖7 不同轉(zhuǎn)速對(duì)生物胺萃取率的影響

    2.2.6 萃取時(shí)間的考察

    一般隨時(shí)間的增長(zhǎng)萃取效率也增大。但時(shí)間過長(zhǎng),有機(jī)溶劑揮發(fā),不利于萃取。本試驗(yàn)在5~50 min時(shí)間內(nèi)進(jìn)行考察。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇萃取率最高的20 min作為萃取時(shí)間,具體試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

    圖8 不同萃取時(shí)間對(duì)生物胺萃取率的影響

    2.2.7 混勻方式的考察

    一般的混勻方式有磁力攪拌、渦旋混勻及搖床振蕩3種方式,本次試驗(yàn)對(duì)3種混勻方式對(duì)生物胺的萃取率比對(duì)進(jìn)行了考察。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇萃取率最高的渦旋混勻作為混勻方式,具體試驗(yàn)結(jié)果見圖9。

    圖9 不同混勻方式對(duì)生物胺萃取率的影響

    2.3 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

    2.3.1 色譜柱的優(yōu)化

    選取Waters公司的C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、C8(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)、HILIC(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)3種不同填料的色譜柱對(duì)8種生物胺進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HILIC柱及C8柱無法完全檢測(cè)出8種生物胺,最終選擇8種生物胺均可檢出的Waters公司的C18柱。

    2.3.2 耐用性的考察

    分別選?、貱18(50 mm×2.1 mm,內(nèi)徑1.7 μm)、②C18(100 mm×2.1 mm,內(nèi)徑1.7 μm)、③C8(50 mm×2.1 mm,內(nèi)徑3.5 μm)、④C8(100 mm×2.1 mm,內(nèi)徑3.5 μm)4種型號(hào)和規(guī)格的色譜柱,對(duì)生物胺的系統(tǒng)適用性進(jìn)行考察,包括色譜柱的理論板數(shù)(n)、分離度(R)、拖尾因子(T)等。試驗(yàn)結(jié)果顯示①C18(50 mm×2.1 mm,內(nèi)徑1.7 μm)的色譜柱得到的理論板數(shù)、分離度及拖尾因子最好,因此選擇該規(guī)格色譜柱。

    2.3.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

    選取甲醇和乙酸銨水溶液(濃度為5 mmol/L)以及乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)兩種不同的流動(dòng)相對(duì)8種生物胺進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,以乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)為流動(dòng)相時(shí),8種生物胺能獲得較好的峰形、分離效果和檢測(cè)靈敏度。因此,選擇乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)作為流動(dòng)相。

    2.3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    根據(jù)儀器自動(dòng)調(diào)諧的結(jié)果進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)還是有部分生物胺無法檢測(cè)出來,故需對(duì)自動(dòng)調(diào)諧的結(jié)果進(jìn)行微量的手動(dòng)調(diào)諧,優(yōu)化質(zhì)譜調(diào)諧中的毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等參數(shù),根據(jù)響應(yīng)值的大小,確定最終的生物胺的質(zhì)譜檢測(cè)條件。按照試驗(yàn)確定的質(zhì)譜方法中質(zhì)譜檢測(cè)條件(8種生物胺的母離子、碎片離子、錐孔電壓以及碰撞能等條件),對(duì)毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣流量和脫溶劑氣溫度進(jìn)行4種數(shù)據(jù)的測(cè)試,并對(duì)生物胺的響應(yīng)值進(jìn)行檢測(cè),最終選擇1.2.3中的質(zhì)譜條件。

    3 結(jié)論

    采用的連續(xù)三相液液萃取法互補(bǔ)了膜分離和三相液液萃取技術(shù)的缺點(diǎn),提高了方法的準(zhǔn)確性、靈敏度、選擇性,并且縮短了萃取時(shí)間,裝置簡(jiǎn)單,成本低,膜過濾和兩次萃取同時(shí)完成,且重現(xiàn)性好。采用的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為生物胺的檢測(cè)方法分析時(shí)間更短(10.0 min),檢出濃度更低(苯乙胺為1.0 ng/mL,其余7種為0.3 ng/mL),更適用于微量生物胺的檢測(cè)。本次方法學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示8種生物胺的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.99;精密度RSD范圍為0.30%~0.86%;穩(wěn)定性RSD范圍為2.19%~6.44%;回收率范圍為87.02%~90.20%,說明采用此質(zhì)譜方法進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果良好,對(duì)8種生物胺具有普遍適用性。通過對(duì)上述市售的10批次醬油的檢測(cè),證實(shí)本試驗(yàn)的樣品提取方法簡(jiǎn)單、快速,可用于醬油中8種生物胺的檢測(cè),同時(shí)可以繼續(xù)推廣作為紅酒、牛奶、飲料及果汁等其他液態(tài)食品中8種生物胺的檢測(cè)方法。

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