超聲波輔助提取山竹果殼色素及其抑菌活性的研究

胡元慶，張嬌，李鳳霞

(閩南師范大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000)

山竹(Garciniamangostana)是一種藤黃科藤黃屬植物，原產(chǎn)于印度尼西亞群島，現(xiàn)主要種植于馬來西亞、菲律賓、泰國、越南和中國等地。果實呈球形，成熟時果殼呈紫紅色，占鮮果重的52%～68%，果肉呈透明的白色[1,2]。果殼含有豐富的紅色素，可作為天然食用色素的原料，該紅色素對熱、光和酸度有較好的穩(wěn)定性，可應(yīng)用于碳酸飲料的著色[3]。山竹作為一種藥食同源性水果，以鮮食果肉為主，而果殼一般被作為廢棄物處理，既不利于環(huán)境保護，也不利于天然植物資源的有效利用[4]。在東南亞，山竹果皮作為泰國傳統(tǒng)醫(yī)藥，可治療痢疾、腹瀉、腹痛、化膿、淋病、感染性創(chuàng)傷、慢性潰瘍等疾病[5]。有研究曾報道，山竹果殼提取物具有抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤等多方面的醫(yī)學(xué)活性[6]。果皮中的氧雜蒽酮是決定其抗菌作用的主要成分，研究發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌和幽門螺桿菌都有很好的抑制作用[7-9]。

現(xiàn)代食品工業(yè)依靠色素和添加劑賦予食品豐富的品相和足夠長的保質(zhì)期，其中天然色素不但可以有效使加工食品著色[10]，安全無毒，而且絕大多數(shù)具有生物活性功能[11]。因此，開發(fā)利用山竹果殼不僅可以變廢為寶，還可以減輕環(huán)境污染壓力，進一步提高山竹產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。從山竹果殼中提取紅色素，可為現(xiàn)代食品工業(yè)中的天然色素尋求新的來源，也能減少人工合成色素用于食品著色而產(chǎn)生的毒理學(xué)風(fēng)險[12]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)常用超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶解提取法等方法提取[13-17]。故本文以山竹果殼為原料，通過單因素試驗和正交試驗探索超聲波輔助提取山竹果殼色素的最優(yōu)工藝條件，進一步探討其對幾種常見食源性病原菌的抑菌活性、最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。這對于開發(fā)應(yīng)用天然植物色素提供了新的途徑和理論依據(jù)，具有良好的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山竹：購自漳州新華都超市；無水乙醇：西隴科學(xué)股份有限公司；普通肉湯、營養(yǎng)瓊脂、TCBS瓊脂：北京陸橋技術(shù)有限公司；副溶血性弧菌ATCC17802、金黃色葡萄球菌CMCC26003、沙門氏菌50041、志賀氏菌B4、大腸桿菌D5：由漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心微生物檢測室惠贈，在生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-200VDE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；MIKRO 220R高速冷凍離心機 德國Hettich公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、GSP-9050MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-1100紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；HQY-C恒溫振蕩搖床 金壇市鴻科儀器廠；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將新鮮山竹果殼清洗干凈后自然晾干，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃干燥12 h。干燥后的果殼在萬能粉碎機中粉碎5 min，過60目篩，收集粉末密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 最大波長測定

稱取果殼粉0.5 g于三角瓶中，按照料液比1∶20加入70%乙醇，在溫度65 ℃、功率160 W超聲波清洗器中浸提40 min，4000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL定容至10 mL后搖勻，用紫外可見分光光度計在波長360～630 nm范圍內(nèi)測定山竹果殼色素提取液的吸光度。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 乙醇濃度對山竹果殼色素提取效果的影響

稱取0.5 g果殼粉于三角瓶中，配制體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇作為提取劑，按照料液比1∶20加入提取劑，搖動三角瓶使粉末全部溶解，用保鮮膜將三角瓶封口，在溫度65 ℃、功率160 W的超聲波清洗器中浸提40 min，4000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL定容于10 mL容量瓶中，搖勻，用紫外分光光度計在最大波長478 nm下測定提取液的吸光值，確定最佳乙醇濃度，每個梯度做3組平行，結(jié)果取其平均值。

1.2.3.2 提取溫度對山竹果殼色素提取效果的影響

稱取0.5 g果殼粉置于三角瓶中，按料液比1∶20加入70%乙醇，搖動三角瓶使果殼粉全部溶解，用保鮮膜將三角瓶封口，在功率為160 W、溫度分別為35，45，55，65，75 ℃的超聲波清洗器中浸提40 min，4000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL定容于10 mL，搖勻，用紫外分光光度計在最大波長478 nm下測定提取液的吸光值，確定最佳提取溫度，每個梯度做3組平行，結(jié)果取其平均值。

1.2.3.3 提取時間對山竹果殼色素提取效果的影響

稱取0.5 g果殼粉于三角瓶中，按料液比1∶20加入70%乙醇，搖動三角瓶使果殼粉全部溶解，用保鮮膜將三角瓶封口，將其放在功率為160 W、溫度為65 ℃的超聲波清洗器中分別浸提30，40，50，60，70 min，4000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL定容至10 mL，搖勻，用紫外分光光度計在最大波長478 nm下測定山竹果殼色素提取液的吸光值，確定最佳提取時間，每個梯度做3組平行，結(jié)果取其平均值。

1.2.3.4 超聲波功率對山竹果殼色素提取效果的影響

稱取0.5 g山竹果殼粉置于三角瓶中，按料液比1∶20加入70%乙醇，搖動三角瓶使山竹果殼粉充分溶解，用保鮮膜將三角瓶封口，將其放在溫度為65 ℃、功率分別為80，120，160，200 W的超聲波清洗器中浸提40 min，4000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL定容于10 mL容量瓶中，搖勻，用紫外分光光度計在最大波長478 nm下測定山竹果殼色素提取液的吸光值，確定最佳超聲波功率，每個梯度做3組平行，結(jié)果取其平均值。

1.2.3.5 料液比對山竹果殼色素提取效果的影響

稱取0.5 g山竹果殼粉于三角瓶中，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入70%乙醇，搖動三角瓶使果殼粉全部溶解，用保鮮膜將三角瓶封口，將其放在溫度為65 ℃、功率為160 W的超聲波清洗器中浸提40 min，4000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL定容于10 mL容量瓶中，搖勻，用紫外分光光度計在最大波長478 nm下測定山竹果殼色素提取液的吸光值，確定最佳料液比，每個梯度做3組平行，結(jié)果取其平均值。

1.2.4 正交試驗

1.2.4.1 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用極差法，選取提取溫度、提取時間、超聲功率和乙醇濃度4個因素作為考察對象，設(shè)計了L9(34)正交試驗以優(yōu)化提取工藝條件。

1.2.4.2 最優(yōu)組合驗證試驗

根據(jù)多因素的正交試驗得到最優(yōu)工藝條件組合，進行3次驗證試驗。試驗操作同1.2.3，結(jié)果取其平均值。

1.2.5 山竹果殼色素成品制備

稱取20.0 g山竹果殼粉置于三角瓶中，按照最佳料液比、最佳乙醇濃度加入提取劑，搖動三角瓶使果殼粉全部溶解，用保鮮膜將三角瓶封口，設(shè)置超聲波清洗器在最佳超聲功率、最佳提取溫度和最佳提取時間條件下進行提取。以4000 r/min離心20 min，將所有上清液倒入45 ℃、0.09 MPa、75 r/min的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮1 h使溶液成黏稠狀，再將其在60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥12 h，即得到山竹果殼色素成品。

1.2.6 抑菌活性

1.2.6.1 濾紙片法檢測抑菌圈

采用濾紙片擴散法測定抑菌活性。無菌操作將待測試5種細菌菌懸液的濃度調(diào)整為106～107CFU/mL，吸取200 μL涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基上。用無菌鑷子將浸泡在山竹果殼色素溶液和無菌生理鹽水中的濾紙片取出晾干，貼到培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿等距貼4片(山竹果殼色素溶液和無菌生理鹽水浸泡過的各貼2片)，每種菌重復(fù)3次。將處理過的培養(yǎng)皿倒置在37 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用直尺量取各濾紙片周圍的抑菌圈直徑大小，取3次試驗結(jié)果的平均值。

1.2.6.2 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

采用試管二倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)[18]。取6根干凈的試管，按照二倍稀釋法配制不同濃度的山竹果殼色素溶液(10，5，2.5，1.25，0.625 mg/mL，6號試管不加樣液做空白對照)，在每根試管中均加入各種供試菌菌懸液0.05 mL，不同濃度的色素溶液0.2 mL，每個供試菌種做3個平行，然后放在37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，觀察試管中無細菌生長的最低濃度即為該山竹果殼色素的最低抑菌濃度(MIC)。從上述無菌生長的每根試管中吸取0.2 mL樣液，采用平板涂布法均勻涂布于平板培養(yǎng)基上，在37 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，以含色素量最少且平板上無菌生長的試管，對應(yīng)的濃度為山竹果殼色素對該供試菌種的最低殺菌濃度(MBC)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，單因素試驗中指標(biāo)均測定3次，用X±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長選擇

山竹果殼色素提取液在波長360～630 nm之間有一個最大吸收峰(位于478 nm處)，因此該山竹果殼色素在可見光區(qū)的最大吸收波長為478 nm(見圖1)，與賴萱等對山竹果皮色素的最大吸收波長一致。

圖1 山竹果殼色素的吸收光譜

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對山竹果殼色素提取效果的影響

圖2 乙醇濃度對山竹果殼色素提取效果的影響

山竹果殼色素是醇溶性物質(zhì)，由圖2可知，隨著乙醇濃度升高，色素提取液的吸光值先逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度超過60%時，果殼色素提取液的吸光值下降。這可能是因為當(dāng)乙醇濃度越大時，山竹果殼中的其他醇溶性、脂溶性雜質(zhì)溶出增加，競爭性地減少了提取劑中色素的含量，從而使山竹果殼色素提取液的吸光值呈逐漸下降趨勢[19]。

2.2.2 提取溫度對山竹果殼色素提取效果的影響

圖3 提取溫度對山竹果殼色素提取效果的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，山竹果殼色素提取液的吸光值也逐漸增大，當(dāng)提取溫度超過55 ℃時，色素提取液的吸光值又逐漸減小。這可能是由于適宜的高溫可加快分子的熱運動，加快分子滲透、擴散和溶解速度，提高色素溶解度。但過高的溫度可能會引起山竹果殼色素的氧化降解，同時其他雜質(zhì)隨著溫度升高溶出率也增加，最終使色素得率受到影響。

2.2.3 提取時間對山竹果殼色素提取效果的影響

由圖4可知，在60 min之前，隨著提取時間的延長，山竹果殼色素提取液的吸光值也逐漸增大，即山竹果殼色素的提取量增加。原因可能是在這個時間段山竹果殼的細胞壁基本破壞完全，且溶劑揮發(fā)較少，有利于色素分子的溶出[20]。當(dāng)提取時間大于60 min時，山竹果殼色素提取液的吸光值隨時間的延長又逐漸降低，是因為提取時間過長，色素分子被光照等因素氧化破壞，導(dǎo)致山竹果殼色素提取液的吸光值降低。

圖4 提取時間對山竹果殼色素提取效果的影響

2.2.4 超聲波功率對山竹果殼色素提取效果的影響

圖5 超聲波功率對山竹果殼色素提取效果的影響

由圖5可知，山竹果殼色素提取液的吸光值隨著超聲波功率的增大也逐漸增大，當(dāng)功率達到160 W時，增加的幅度非常小。可能是因為對于一定頻率的超聲波，隨著功率的逐漸增大，單位時間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)也隨之增多。在超聲波場中，聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)可造成細胞壁和細胞膜破碎，促進色素溶出。但過高的功率也會使雜質(zhì)部分溶出率增加，降低色素的提取率。

2.2.5 料液比對山竹果殼色素提取效果的影響

圖6 料液比對山竹果殼色素提取效果的影響

由圖6可知，隨著料液比增加，山竹果殼色素提取液的吸光值逐漸最大。當(dāng)料液比達1∶40時，色素提取液的吸光值基本平穩(wěn)。這可能是因為隨著料液比的增加，除了溶解有效的色素分子外，還會溶出更多的雜質(zhì)成分以及消耗大量的提取溶劑，為了減少生產(chǎn)成本和后續(xù)的處理難度，因此在后面的正交試驗時選取1∶40作為最佳料液比。

2.3 正交因素試驗結(jié)果

通過對單因素試驗的研究，以提取溫度(A)、提取時間(B)、乙醇濃度(C)、超聲波功率(D)4個因素進行L9(34)正交試驗(水平均由單因素試驗得出)，用吸光值(A478 nm)為指標(biāo)，確定超聲波輔助提取山竹果殼色素的最優(yōu)工藝。正交試驗設(shè)計表見表1，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 山竹果殼色素正交試驗設(shè)計表

表2 山竹果殼色素提取工藝正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗結(jié)果方差分析

由表2可知，8號試驗組A3B2C1D3的提取效果最好，即為最優(yōu)提取工藝條件。由表2極差分析可知，RA>RB>RC>RD，即各個因素對超聲波輔助提取山竹果殼色素的影響主次順序為A(提取溫度)>B(提取時間)>C(乙醇濃度)>D(超聲波功率)。由表3方差分析可知，提取溫度對色素提取效果的影響為極顯著，提取時間對色素提取效果的影響為顯著，乙醇濃度和超聲波功率對色素提取效果的影響不顯著，即顯著性分析為A(提取溫度)>B(提取時間)>C(乙醇濃度)>D(超聲波功率)。根據(jù)K值以及從高效和經(jīng)濟角度考慮，選擇的最佳條件為提取溫度65 ℃、提取時間60 min、乙醇濃度60%、超聲波功率200 W。綜上所述，本試驗超聲波輔助提取山竹果殼色素的最優(yōu)工藝條件組合為A3B2C2D3。

2.4 最優(yōu)工藝條件驗證試驗結(jié)果

選取所得最優(yōu)工藝組合，對山竹果殼色素進行提取，對正交試驗所得結(jié)論進行了3次驗證試驗，結(jié)果所得吸光值的平均值為0.463，證實了A3B2C2D3為最優(yōu)組合。

2.5 測定供試菌種抑菌圈直徑試驗結(jié)果

表4 山竹果殼色素對供試菌種抑菌圈直徑結(jié)果

由表4可知，山竹果殼色素對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、志賀氏菌的抑菌圈直徑依次在減小。測量5種供試菌抑菌圈直徑大小，山竹果殼色素對沙門氏菌的抑菌效果最強，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果次之，對副溶血性弧菌的抑菌效果較弱，對大腸桿菌和志賀氏菌沒有抑菌效果。

2.6 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

表5 山竹果殼色素對測試菌的MIC和MBC結(jié)果

由表5可知，山竹果殼色素溶液對3種供試菌均有明顯抑菌效果。山竹果殼色素溶液對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC為1.25 mg/mL，對副溶血性弧菌的MIC為5 mg/mL。山竹果殼色素溶液對沙門氏菌的MBC為2.5 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC為5 mg/mL，對副溶血性弧菌的MBC為10 mg/mL。

3 結(jié)論

本研究以泰國山竹作為試驗材料，采用了超聲波輔助提取法提取山竹果殼色素，選取乙醇作為提取劑，以提取時間、提取溫度、乙醇濃度、超聲波功率和料液比作為影響試驗的主要因素，根據(jù)L9(34)正交試驗結(jié)果及驗證試驗，最終確定出超聲波輔助提取山竹果殼色素的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度65 ℃、提取時間60 min、乙醇濃度60%、超聲波功率200 W、料液比1∶20，此條件下山竹果殼色素提取液的吸光值為0.463。與傳統(tǒng)的提取方法相比較，本研究所采用的超聲波輔助提取方法操作簡單、時間短、提取效率高、節(jié)約溶劑、成本低等。山竹果殼色素對常見食源性病原菌沙門氏菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，對副溶血性弧菌的抑菌作用較弱，對大腸桿菌和志賀氏菌沒有抑菌作用。這些研究為山竹果殼色素在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中提供了重要的參考，同時為山竹副產(chǎn)物生物功能特性的進一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。