離子對(duì)液相色譜法檢測(cè)烹調(diào)香料中非法摻雜的罌粟殼

睢超霞，陳蕾，徐娜

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系 化學(xué)教研室，鄭州 451191)

烹調(diào)香料是某些植物的種子、果實(shí)、根等組織，添加在食物中具有去腥、除膻、解膩、增香、提鮮等功能。罌粟殼俗稱大煙殼，系罌粟科植物罌粟的干燥成熟果殼，內(nèi)含嗎啡、可待因、罌粟堿等多種生物堿。罌粟殼中的生物堿雖然含量較低，但長(zhǎng)期食用會(huì)出現(xiàn)盜汗、乏力、犯困等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)造成損害[1]。近年來屢有不法商販在烹調(diào)香料中摻雜罌粟殼，制成所謂的秘制配方售賣，作為調(diào)味品在火鍋料、鹵料和湯汁中使用，用于招攬生意，牟取暴利[2]。2009年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》，嚴(yán)禁將罌粟殼作為食用添加劑。

罌粟殼研磨成粉末后摻入烹調(diào)香料，常規(guī)的形態(tài)鑒別法難以準(zhǔn)確辨別是否違法添加。罌粟殼中富含罌粟堿、嗎啡、可待因等生物堿成分，判斷是否違禁使用罌粟殼可以通過測(cè)定罌粟殼中的生物堿來判斷。目前，測(cè)定罌粟殼中生物堿的方法有光譜法、電化學(xué)分析法、免疫分析法和色譜法等[3]。與其他分析方法相比，色譜法采用先分離后測(cè)定技術(shù)，能夠排除樣品中其他雜質(zhì)的干擾，是鑒別食品中是否違法添加罌粟殼的最佳方法。沈平等[4]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，檢測(cè)了罌粟殼提取物中罌粟堿、蒂巴因等生物堿組分。林黛琴等[5]采用液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法定量檢測(cè)摻雜罌粟殼食品中多種生物堿的殘留。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有分析效率高、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但是色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，操作步驟復(fù)雜，對(duì)操作人員的要求較高，在基層實(shí)驗(yàn)室難以開展。罌粟堿是罌粟殼特有的標(biāo)志性組分，在罌粟殼中含量較高，具有興奮、鎮(zhèn)痛等麻醉作用，通過測(cè)定罌粟堿的含量可初步鑒別烹調(diào)香料是否違法添加罌粟殼。本研究采用基層實(shí)驗(yàn)室最常用的液相色譜儀，以己烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑，通過優(yōu)化色譜條件，建立靈敏可靠、快速準(zhǔn)確的液相色譜方法來測(cè)定罌粟堿，該方法適用于烹調(diào)香料中違禁成分罌粟殼的篩查與鑒別，可供基層實(shí)驗(yàn)室參考借鑒，為預(yù)防和減少摻雜罌粟殼的烹調(diào)香料造成的健康危害提供了檢測(cè)技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鹽酸罌粟堿對(duì)照品(定值100%)：中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)、己烷磺酸鈉(>98.0%)：Merck公司；鹽酸三乙胺(≥99%)：Sigma公司；其他試劑為優(yōu)級(jí)純或分析純，實(shí)驗(yàn)用水符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6682-2008的要求。

Alliance 2695高效液相色譜儀 Waters公司；TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CT15RE高速離心機(jī) Hitachi公司。

1.2 色譜條件

Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相(A∶B為40∶60)：其中流動(dòng)相A為0.02 mol/L戊烷磺酸鈉水溶液(稱取3.48 g的己烷磺酸鈉，去離子水溶解后加入2.0 mL的三乙胺，磷酸調(diào)pH至3.5，0.45 μm濾膜過濾后去離子水定容到1000 mL)，流動(dòng)相B為甲醇；色譜柱溫度為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相流速為1.0 mL/min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取2.5 mg鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品至25 mL容量瓶中，甲醇定容，制成100 μg/mL的罌粟堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。采用流動(dòng)相將儲(chǔ)備液稀釋到0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 μg/mL，制成標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

1.4 樣品處理方法

首先配制1000 mL甲醇-乙酸混合提取溶劑(溶液中含甲醇70%，乙酸2%，水28%)。烹調(diào)香料樣品經(jīng)研磨后過3號(hào)篩，精密稱取樣品粉末2.0 g，置于50 mL棕色錐形瓶中，加入20 mL提取溶劑，室溫浸泡24 h，超聲波(功率250 W，頻率40 kHz)提取30 min，5000 r/min離心10 min，將上清液用濾紙過濾后置于100 mL棕色容量瓶中，按上述步驟提取3次，合并上清液后將提取溶劑定容到刻度，微孔濾膜(0.45 μm)過濾后進(jìn)行HPLC 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 罌粟堿的光譜性能

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇影響液相色譜分析方法的靈敏度，現(xiàn)有文獻(xiàn)檢測(cè)罌粟堿采用的波長(zhǎng)有253，210，240 nm等[6-8]。罌粟堿的吸收光譜和溶劑有關(guān)，本研究采用流動(dòng)相配制50 μg/mL的罌粟堿溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描紫外光吸收，結(jié)果見圖1。罌粟堿在200～340 nm之間有紫外吸收，最大特征紫外吸收波長(zhǎng)為239 nm，罌粟堿在此波長(zhǎng)下的檢測(cè)靈敏度最高，是罌粟堿檢測(cè)的最佳波長(zhǎng)。

圖1 罌粟堿的紫外吸收光譜圖

2.2 流動(dòng)相的選擇

罌粟堿屬于生物堿，在酸性溶液中質(zhì)子化后以陽離子形式存在，具有較強(qiáng)的親水性。當(dāng)以純水-甲醇(或乙腈)為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰出峰時(shí)間較早，同時(shí)罌粟堿的胺基與色譜柱固定相表面殘存的硅醇基發(fā)生相互作用，吸附在色譜柱的固定相上，造成色譜峰拖尾現(xiàn)象。

通過在流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑可以改善分離效果，己烷磺酸鈉中的極性磺酸根陰離子基團(tuán)與罌粟堿的胺基陽離子基團(tuán)締合形成中性分子，增加樣品離子在非極性固定相中的溶解度，增強(qiáng)其保留作用，改善分離效果。同時(shí)在流動(dòng)相中加入0.2%的三乙胺作為峰形改進(jìn)劑，三乙胺可與色譜柱固定相表面的殘留硅醇基結(jié)合，一定程度上抑制了罌粟堿與硅醇基的吸附作用，起到改善峰形的作用。

不同流動(dòng)相下罌粟堿的色譜流出曲線見圖2。

圖2 不同流動(dòng)相條件下罌粟堿的色譜流出圖

由圖2可知，添加離子對(duì)試劑后，色譜峰的保留時(shí)間延長(zhǎng)，色譜峰形的對(duì)稱性有所改善，增加了色譜定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相采用二元等度法，流動(dòng)相比例A∶B為40∶60，其中流動(dòng)相A為離子對(duì)水溶液(0.02 mol/L己烷磺酸鈉溶液，含0.1%三乙胺，磷酸調(diào)pH至3.5)，流動(dòng)相B為甲醇。

2.3 校正曲線的建立

按照1.2部分設(shè)定的色譜參數(shù)進(jìn)樣罌粟堿對(duì)照品，色譜峰見圖3。罌粟堿在6.75 min出峰，標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰形呈正態(tài)分布且對(duì)稱性良好，基本無拖尾現(xiàn)象。標(biāo)準(zhǔn)系列測(cè)試結(jié)果表明，在0.05～5.0 μg/mL范圍內(nèi)，罌粟堿濃度和色譜峰面積呈線性關(guān)系，以峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作圖并線性擬合工作曲線；回歸方程為Y=39815X+472擬合時(shí)要求相關(guān)系數(shù)大于0.995。

圖3 罌粟堿對(duì)照品、空白烹調(diào)香料樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖

同時(shí)將建立的液相色譜方法應(yīng)用于空白烹調(diào)香料樣品和加標(biāo)烹調(diào)香料樣品的測(cè)試，色譜流出曲線見圖3。由樣品色譜圖可知，加標(biāo)樣品中的罌粟堿與空白樣中其他雜質(zhì)成分得到了基線分離，分析方法專屬性良好。色譜峰正態(tài)對(duì)稱分布，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間基本一致(偏差<2.0%)。將加標(biāo)樣品色譜峰高稀釋到3倍樣品空白噪聲(S/N=3)，計(jì)算出方法的檢出限為0.01 mg/L。

2.4 方法的驗(yàn)證

2.4.1 樣品的提取

罌粟殼中生物堿常用的提取方法有索氏提取法[9]和超聲波提取法[10]，索氏提取法屬于加熱回流萃取方法，優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是耗時(shí)，需要的提取溶劑也較多，對(duì)中藥材的提取效率較差。超聲波獨(dú)具的物理特性能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，提高有效成分的提取效率，通常在30 min即可獲得最佳提取率，同時(shí)提取溫度較低，對(duì)易水解或氧化的待測(cè)成分具有保護(hù)作用。

常用的罌粟殼中生物堿的提取溶劑有純水、甲醇、乙醇和乙酸[11]，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)考察各種溶劑的提取效率，固定浸泡時(shí)間為24 h，超聲提取時(shí)間為1 h，考察各種提取溶劑的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇和乙酸混合溶劑(溶液中含甲醇70%，乙酸2%，水28%)的提取率最高。采用超聲波提取儀和甲醇-乙酸混合溶劑提取烹調(diào)香料的生物堿，提取過程見1.4。

2.4.2 加標(biāo)樣品的檢測(cè)

測(cè)定市售3種烹調(diào)香料中的罌粟堿，配制加標(biāo)樣品，測(cè)定樣品中罌粟堿的加標(biāo)回收率和檢測(cè)精密度。烹調(diào)香料調(diào)味品中添加不同含量的罌粟殼，分別在3份烹調(diào)香料中加入1.0，2.0，5.0 mL的100 μg/mL罌粟堿儲(chǔ)備液，樣品中罌粟堿的加標(biāo)量分別為100，200，500 μg，按照1.4部分所示提取樣品中的罌粟堿，并將樣品稀釋到校正曲線的線性范圍以內(nèi)，液相色譜測(cè)試結(jié)果見表1。

表1 樣品含量和加標(biāo)回收測(cè)試

由表1可知，3種不同加標(biāo)水平樣品中罌粟堿的回收率為78.5%～91.2%，檢測(cè)結(jié)果平行測(cè)定7次的精密度為0.9%～1.4%，精密度和加標(biāo)回收率代表著分析方法的精密度和準(zhǔn)確度，建立的離子對(duì)液相色譜法能夠準(zhǔn)確可靠地檢測(cè)烹調(diào)香料中非法摻雜的罌粟殼。

3 結(jié)論

近年來，在火鍋底料、鹵制品中添加罌粟殼得到了關(guān)注，目前還沒有罌粟殼在食品中違法添加的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，上海市食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)(DB31/2010-2012)[12]，該標(biāo)準(zhǔn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了罌粟堿、嗎啡等罌粟殼中含有的生物堿，適用于火鍋中非法添加罌粟殼的鑒定，缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴，基層實(shí)驗(yàn)室無法普及。罌粟殼粉摻雜在烹調(diào)香料中制作秘制配方的危害面嚴(yán)重，需要建立相應(yīng)的簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)方法。高效液相色譜儀在基層較為普及，儀器易于操作，檢測(cè)過程方便快速。本實(shí)驗(yàn)建立了離子對(duì)液相色譜法檢測(cè)罌粟殼中的標(biāo)志性成分罌粟堿，選用己烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑，增強(qiáng)了罌粟堿的保留，同時(shí)加入三乙胺作為峰形改進(jìn)劑，減少了色譜峰的拖尾。本方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，且精密度和重復(fù)性均較好，有利于推廣應(yīng)用。