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    傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中乳酸菌的分離及鑒定

    2020-12-01 02:36:58左麗麗高永欣王鈺涓王舒然富校軼
    中國調味品 2020年11期
    關鍵詞:大醬豆醬乳酸菌

    左麗麗,高永欣,王鈺涓,王舒然,富校軼

    (吉林醫(yī)藥學院 公共衛(wèi)生學院,吉林 吉林 132013)

    豆醬是我國古老且具有特色的傳統(tǒng)發(fā)酵調味品,距今已經有數千年的發(fā)展歷史。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的制作方法是以黃豆為主要的原材料,首先經過煮制,然后擠壓成塊,再通過制曲以及發(fā)酵等一系列的工藝加工而成的半流動態(tài)食品[1]。在傳統(tǒng)豆醬的制曲以及豆醬的發(fā)酵過程中,利用原材料以及周圍環(huán)境中存在的各種微生物通過自然發(fā)酵,微生物將原材料中的大分子物質例如蛋白質、脂肪、碳水化合物等進行分解,得到小分子的酸、醛、酮和酯等一系列風味物質,從而使傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的pH值以及各種營養(yǎng)成分等發(fā)生一系列的變化[2,3]。發(fā)酵豆醬中因為含有豐富的營養(yǎng)成分、濃郁的香氣和色澤以及獨特的味道,深受全國各地居民的喜愛。同時發(fā)酵豆醬中還蘊藏著豐富的且有益于機體健康的微生物資源,例如乳酸菌、酵母菌等。大量研究成果表明,乳酸菌在豆醬的自然發(fā)酵過程中發(fā)揮非常重要的作用,能夠直接影響豆醬的色、香、味等,是與其風味的形成關系最為密切的細菌[4,5]。目前,國內外專家以及學者對各種各樣發(fā)酵食品中存在的不同乳酸菌進行了大量的研究工作,然而,對吉林地區(qū)農家傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中天然存在的乳酸菌種類及其分布的研究甚少。

    因此,本文以吉林市農家傳統(tǒng)發(fā)酵大醬為試材,在豆醬自然發(fā)酵過程中,采用傾注法對不同發(fā)酵周期的豆醬進行乳酸菌疑似菌株的分離和純化,通過生理學鑒定,并對不同周期分離出的乳酸菌提取DNA,進行PCR擴增,通過測序分析不同發(fā)酵周期大醬中乳酸菌的種類,為進一步研究、開發(fā)利用東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中豐富多樣的乳酸菌資源,改善豆醬的風味和品質,同時擴大工業(yè)化生產規(guī)模,提供了一定的理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    農家大醬:采用東北傳統(tǒng)方法自制發(fā)酵而成,分別在發(fā)酵后1~10周每周取樣一次,共采集10次,樣品采集方式為隨機采樣。樣品采集后,將其分裝到10 mL滅菌離心管中,于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 培養(yǎng)基與試劑的配制

    MRS培養(yǎng)基配方:葡萄糖20.0 g/L,牛肉浸膏10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,檸檬酸氫二銨2 g/L,乙酸鈉5 g/L,吐溫80 1 g/L,K2HPO42 g/L,MnSO4·4H2O 0.25 g/L,MgSO4·7H2O 0.58 g/L,瓊脂18 g,臨用前添加2% CaCO3,于121 ℃高壓滅菌20 min。

    Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(50次),采購于生工生物工程(上海)股份有限公司;細菌通用引物27f和1495r(引物序列:27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1495r:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′),均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2×Taq PCR Master Mix試劑(試劑中含有染料),購于天根生化科技(北京)有限公司。

    1.3 儀器與設備

    GI54DWS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;明澈D24UV超純水處理系統(tǒng) Millipore(密理博)公司;HZL-F100恒溫恒濕振蕩培養(yǎng)箱 太倉市強樂實驗設備有限公司;5430R型高速冷凍離心機、6331 PCR儀 德國Eppendorf公司;FE20K pH計 Mettler-Toledo公司;1645050電泳儀、ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司;JNOEC XS-212-201生物顯微鏡 日本Olympus工業(yè)有限公司。

    1.4 樣品的采集

    在傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過程中,從發(fā)酵的1~10周每周定時采集不同時期的豆醬樣品各50 g,將其分裝于10 mL滅菌離心管中,同時記錄發(fā)酵過程以及時間等相關信息,運回實驗室保存至-80 ℃超低溫冰箱備用。

    1.5 乳酸菌的分離純化

    采用傾注培養(yǎng)法同時結合劃線分離的方法,對不同發(fā)酵時期傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中的乳酸菌進行分離和純化。分別稱取1~10周各個采樣階段的豆醬樣品1 g,用滅菌的生理鹽水進行10倍、100倍梯度稀釋后,分別吸取10-1~10-2的樣品稀釋液各20 μL于培養(yǎng)皿中,將121 ℃ 20 min滅菌的MRS培養(yǎng)基冷卻至50~60 ℃之間,向其中加入2 mL制霉菌素溶液,使培養(yǎng)基中制霉菌素的質量濃度達到90 μg/mL,目的是防止霉菌和酵母菌的生長和繁殖。然后將MRS培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,與豆醬樣品稀釋液混合均勻,待培養(yǎng)基凝固后,將其倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48~72 h[6-8]。

    1.6 乳酸菌的形態(tài)觀察以及生理學鑒定

    觀察平板內細菌的生長情況,挑取有溶鈣圈并且直徑在1~2 mm的單菌落,反復劃線分離,純化至單菌落為止。

    將分離得到的產酸菌進行過氧化氫實驗,并將過氧化氫酶結果呈陰性的菌株逐一進行形態(tài)學鑒定。同時觀察MRS培養(yǎng)基平板上所分離得到的乳酸菌菌落形態(tài)、大小、光澤、邊緣形狀以及菌落顏色等一系列特征。并將分離得到的乳酸菌進行革蘭氏染色,放置在100倍油鏡下進行菌體形態(tài)學觀察[9],拍照并記錄乳酸菌菌落形態(tài)和大小等結果。

    1.7 乳酸菌總DNA的提取以及純度的檢測

    將篩選出的1~10周的乳酸菌單個菌落分別接種至含有50 mL MRS的液體培養(yǎng)基中,在37 ℃條件下,150 r/min搖床中培養(yǎng)過夜。按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取其中的乳酸菌總DNA。使用ND-1000型微量紫外分光光度計檢測基因組OD260 nm/OD280 nm的比值以及DNA的濃度,然后再次通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

    1.8 16S rDNA序列的PCR擴增

    25 μL PCR反應體系:模板1 μL、上下游引物(細菌16S rDNA通用引物27f和1495r)各1 μL(10 pmol/μL),2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,使用超純水補齊到25 μL。其PCR的反應程序:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,設置30個循環(huán),72 ℃延伸10 min[10-12],最后4 ℃保溫。PCR反應的產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的擴增結果,將膠板放置在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照,同時檢測是否含有約1500 bp的熒光條帶。將最終的PCR結果呈現陽性的擴增產物寄送到生工生物工程(上海)股份有限公司進行分析測序。

    1.9 乳酸菌16S rDNA同源性分析及其種屬的鑒定

    登錄NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)網站,對PCR產物的測序結果進行同源性分析和比對,從數據庫中獲得相關種屬的細菌16S rDNA序列信息[13,14]。以16S rDNA的序列同源性大于99%以上作為標準進行屬種歸類,然后對乳酸菌待測菌株以及相關的模式菌株進行16S rDNA序列分析,并應用軟件Mega 7.0中的Neighbor-Joining法對系統(tǒng)發(fā)育樹進行構建,進一步進行種屬的鑒定[15]。

    2 結果與分析

    2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品中乳酸菌的分離結果

    從不同發(fā)酵時期的豆醬樣品中分離出革蘭氏陽性疑似菌株共10株,經過氧化氫試驗發(fā)現全部為陰性菌株,在含有2 g/dL CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上,菌株的菌落形態(tài)全部呈現為乳白色,觀察其邊緣比較規(guī)則,顯示為圓形菌落,菌落直徑大小在1.0~1.5 mm范圍之內,通過觀察菌落表面的情況,發(fā)現有的菌落相對光滑,而部分菌落表面呈現粗糙狀態(tài),并將其分別命名為SBP1-1、SBP1-2、SBP1-3、SBP1-4、SBP1-5、SBP1-6、SBP1-7、SBP1-8、SBP1-9、SBP1-10。同時對分離獲得的10株疑似菌株進行革蘭氏染色鑒定,并在100倍油鏡下觀察菌體的特征。鏡檢結果表明,所分析的菌株均表現為革蘭氏陽性菌株,其菌體形態(tài)全部呈現為圓球狀,排列方式多種多樣,表現為單個、短鏈以及成對等多種方式。部分乳酸菌疑似菌株的革蘭氏染色鏡檢結果見圖1,其形態(tài)學特征見表1。

    圖1 部分乳酸菌疑似菌株的革蘭氏染色結果圖(×100)

    表1 分離獲得的各乳酸菌的形態(tài)學特征

    2.2 乳酸菌總DNA的提取以及16S rDNA擴增結果檢測

    按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取分離純化的乳酸菌總DNA,采用微量紫外-可見分光光度計檢測分離得到的10株乳酸菌疑似菌株DNA的濃度和純度,結果發(fā)現所檢測菌株的DNA質量濃度全部在200 ng/μL左右,且OD260 nm/OD280 nm的比值基本處于1.6~1.8之間,基本符合PCR擴增體系的要求,可以繼續(xù)進行下一步的PCR擴增實驗。

    將大醬中不同發(fā)酵時期分離出的乳酸菌16S rDNA擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,結果見圖2,可以觀察到在1~10周的大醬發(fā)酵過程中全部泳道在1500 bp左右的位置都出現了一條亮帶,且在其他位置都沒有出現明顯的非特異性擴增條帶,完全符合序列測定要求。將PCR擴增片段大小在1500 bp左右的陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定及分析。

    圖2 乳酸菌株16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

    2.3 乳酸菌16S rDNA同源性的分析及其相關種屬鑒定

    登錄NCBI(The National Center for Biotechnology Information)網站,將分離獲得的乳酸菌16S rDNA/rRNA測序結果與該網站數據庫中相關信息進行BLAST同源性分析和比對。發(fā)酵豆醬中分離純化得到的10株乳酸菌16S rDNA序列同源性比對的相關結果見表2。

    表2 吉林市農家傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離的乳酸菌16S rDNA序列鑒定結果

    由表2可知,分離得到的SBP1-1等6株菌與Pediococcuspentosaceus的相似性達到100%或99%,因此將其鑒定為戊糖片球菌(P.pentosaceus);篩選出的SBP1-7等3株菌與Enterococcusfaecium的相似性達到99%,因此將其鑒定為屎腸球菌(E.faecium);分離獲得的SBP1-9菌株與Enterococcuslactobacillus的相似性達到100%,所以將其鑒定為乳酸腸球菌(E.lactobacillus)。

    2.4 不同時期傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

    登錄NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)網站,從GenBank/EMBL/DDBJ數據庫中獲取信息進行同源性分析,從中提取相似度在99%以上的乳酸菌相關模式菌株的序列,在傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離鑒定的3種乳酸菌中分別各選取1株作為代表菌株,通過Mega 7.0進化樹軟件并采用其中的Neighbor-Joining(NJ)法將測序獲得的乳酸菌序列與GenBank數據庫中模式菌株16S rDNA序列進行比對和分析,同時構建系統(tǒng)發(fā)育樹,獲得發(fā)酵豆醬中乳酸菌目的菌株的分類地位以及它的系統(tǒng)發(fā)育地位。通過軟件獲得系統(tǒng)發(fā)育樹的結果見圖3,由其結果可以看出,SBP1-1、SBP1-7、SBP1-9與相對應的參考菌株同源性較高,都達到99%以上,并與其聚在一起,從而有效地證明傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中乳酸菌16S rDNA區(qū)域序列分析比對的結果有較好的準確性。

    圖3 吉林市傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬分離鑒定的乳酸菌16S rDNA序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 結論

    本研究從吉林市農家自制大醬的不同發(fā)酵階段采集的10份樣品中,共分離獲得10株乳酸菌,通過16S rDNA序列分析法對分離得到的乳酸菌進行分析和鑒定,其鑒定結果分別為戊糖片球菌(P.pentosaceus)6株、屎腸球菌(E.lactobacillus)3株,乳酸腸球菌(E.lactis)1株??梢猿醪酵茢喑鑫焯瞧蚓羌质修r家自制豆醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌群,對傳統(tǒng)豆醬的風味起著至關重要的作用。

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