豆腐黃漿水與蔗糖制醋工藝研究及功能性成分分析

陳思雨，孫楠，司定成，鐘凌威，李倩楠，張寶善,2*

1(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安，710119)2(陜西省果蔬深加工工程技術研究中心，陜西 西安，710119)

豆腐黃漿水是制作傳統(tǒng)豆腐、豆皮時，經(jīng)壓濾成型生成的副產(chǎn)物，富含大豆乳清蛋白、皂苷、異黃酮及低聚糖(主要是蔗糖、棉籽糖和水蘇糖)等物質(zhì)，營養(yǎng)價值較高[1-2]。但豆腐黃漿水大都直接排放，很少進行再利用，一方面造成環(huán)境重大污染，另一方面導致資源流失。近年來，隨著對環(huán)境保護和資源回收再利用的關注，有人嘗試采用冷凍濃縮、泡沫分級、膜分離等方式分離提取豆腐黃漿水中的成分[3-8]。例如，褚紹霞[9]通過用超濾和絮凝法把乳清蛋白從大豆黃漿水中分離出來，并對黃漿水進行脫鹽、脫色，生成大豆低聚糖粗糖液。

食醋作為一種調(diào)味品，有多種保健效果：健胃消食、調(diào)節(jié)酸堿平衡、消除疲勞、促進新陳代謝、延緩衰老、預防心血管疾病和糖尿病。此外，醋還具有消炎、抗病毒及殺菌、增強機體肝臟和腎臟的功能，具有防癌抗癌和減肥等功效[10]。利用蔗糖和豆腐黃漿水中的成分制醋，不僅可以使豆腐黃漿水得以回收利用，還可以生產(chǎn)出別具風味且營養(yǎng)豐富的新型醋制品。鄧麗華等[11]在不同黃漿水的配方中，接入純種醋酸菌使其發(fā)酵，探索出液態(tài)發(fā)酵制醋新工藝。張偉等[12]以黃漿水為原料，利用液態(tài)深層發(fā)酵釀醋工藝，制作出符合優(yōu)級老陳醋標準的黃漿醋。由此可知采用豆腐黃漿水生產(chǎn)食醋是可行的。本試驗采用的豆腐黃漿水富含蛋白質(zhì)、酚類和有機酸等物質(zhì)，可以為微生物發(fā)酵提供充分的氮源和無機鹽，還含有少量生理功能性成分，呈微酸性，是良好的微生物生長環(huán)境。

本文將進一步研究豆腐黃漿水制醋過程，采用單因素和響應面試驗優(yōu)化確定最適工藝條件。并且對發(fā)酵階段中的總黃酮、總酚、氨基酸等成分進行測定，對黃漿水、黃漿水酒液和黃漿水醋液的抗氧化能力進行比較分析，為功能型食醋的開發(fā)與研制打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 豆腐黃漿水

豆腐黃漿水，采集于陜西師范大學后勤加工廠。

1.1.2 發(fā)酵菌種

酵母菌：活性干酵母(Rattusnorvegicus)，湖北安琪酵母股份有限公司；

醋酸菌：巴氏醋酸桿菌(Corynebacteriumpasteurianus)AS1.41，中國普通微生物菌種保藏管理中心，于陜西師范大學食品學院發(fā)酵實驗室保存。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨、酵母浸膏、酵母粉、瓊脂、蔗糖、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、NaOH(粒)、乙酸鋅、CaCO3、K2HPO4、鄰苯二甲酸氫鉀、亞鐵氰化鉀、CuSO4、檸檬酸鈉、HCl，甲醛，無水乙醇，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；酚酞、亞甲藍、結(jié)晶紫，成都市科龍化工試劑廠；以上試劑均為分析純類。

1.1.4 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺，海躍進醫(yī)療器械廠；GSP-9080MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TS-2102C恒溫搖床，上海申安醫(yī)療器械廠；WZS50手持折射儀，上海儀電物理光學儀器有限公司；PL203電子天平，上海天呈實驗儀器制造有限公司；UV752紫外分光光度儀，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化與培養(yǎng)

酵母菌的活化：將活性干酵母接入無菌水中后于35 ℃下靜置20 min。

醋酸菌活化培養(yǎng)基制備[13-14]：1%(質(zhì)量分數(shù))酵母浸膏，1%(質(zhì)量分數(shù))葡萄糖，1.5%(質(zhì)量分數(shù))的CaCO3，調(diào)節(jié)pH值為6.0，滅菌后冷卻至60 ℃以下，然后加入2%(體積分數(shù))無水乙醇。

醋酸菌種子制備及擴大培養(yǎng)的活化[15-16]：挑出醋酸菌保藏斜面上的菌體活化，鏡檢無雜菌。后進行液態(tài)1級擴大培養(yǎng)、2級擴大培養(yǎng)。

1.2.2 酒精發(fā)酵工藝的確定

1.2.2.1 酒精發(fā)酵工藝流程

1.2.2.2 單因素試驗

取分裝好的黃漿水，酵母菌接種量分別為1%、2%、3%、4%和5%，分別在 26、28、30、32、34 ℃條件下培養(yǎng)，初始蔗糖質(zhì)量分數(shù)分別為8%、9%、10%、11%和12%，放置培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。每天測定酒液的酒精度和可溶性固形物含量[17]。

1.2.3 醋酸發(fā)酵工藝的確定

1.2.3.1 醋酸發(fā)酵工藝流程

1.2.3.2 單因素試驗

取分裝好的黃漿水酒液，調(diào)整初始酒精度分別為5%、6%、7%、8%和9%(體積分數(shù))，調(diào)整初始酸度分別為1.3、1.5、1.7、1.9、2.1 g/100mL，醋酸菌接種量分別為6%、8%、10%、12%和14%，分別在 26、28、30、32、34 ℃條件下放置培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。每天測定醋液的總酸和酒精度[18-20]。

1.2.3.3 響應面法優(yōu)化醋酸發(fā)酵最佳工藝

采用中心組合設計對黃漿水酒液醋酸發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。選取初始酒精度(A)、初始酸度(B)、發(fā)酵溫度(C)和接種量(D)4個變量，進行響應面分析，因素水平編碼表如表1所示。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factor level coding table

1.2.4 功能成分的變化規(guī)律

用黃漿水采用最適工藝進行發(fā)酵，測定發(fā)酵期間的總黃酮、總酚，并在發(fā)酵過程中取初始黃漿水、黃漿水酒液和黃漿水醋液，測定氨基酸、總還原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力、羥基自由基(·OH)清除能力和2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]自由基清除能力，進行分析比較。

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 理化指標的測定

總酸：酸堿滴定法[21]；可溶性固形物的測定：手持折光儀法[22]；酒精度：酒精計法[23]；總酚：福林酚測定法[24]，以吸光值為縱坐標，以沒食子酸濃度為橫坐標，建立標準曲線，得到回歸方程為y=0.749 9+0.647 5x(R2=0.994 1)，相關系數(shù)為0.994 1；總黃酮：亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[24]，以蘆丁濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，建立標準曲線，得到回歸方程為y=0.59x+0.015 2(R2=0.996 9)，相關系數(shù)為0.997 9；氨基酸：全自動氨基酸分析儀法[25]。

1.2.5.2 抗氧化能力指標的測定

(1) 還原能力[24]

將0.2 mL樣品、1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和1 mL 1%(質(zhì)量分數(shù))鐵氰化鉀溶液混勻，50 ℃下反應30 min。冷卻后加入10%(質(zhì)量分數(shù))三氯乙酸(CCl3COOH)水溶液1 mL充分反應，3 500 r/min離心18 min。取上清液1 mL與0.2 mL 1%(質(zhì)量分數(shù))FeCl3水溶液，充分反應，靜置8 min。測定樣品與蒸餾水在700 nm波長處吸光度的差值即還原力。

(2) DPPH自由基清除能力[26]

吸取各濃度下樣品的乙醇水溶液2 mL，滴入2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液3 mL，黑暗靜置20 min。以無水乙醇為空白對照調(diào)零，測定樣品組與空白對照組在517 nm處的吸光度差值A樣。往2.0 mL樣品溶液中加入2.0 mL的CH3CH2OH，混勻，測定517 nm處的吸光度A參比，再測定2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL CH3CH2OH的混合溶液在517 nm處的吸光度A空白。以抗壞血酸為對照品，按公式(1)計算DPPH自由基清除率：

(1)

(3) 羥基自由基(·OH)清除能力[26]

試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，不同濃度樣品溶液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，充分反應20 min后于510 nm處測得樣品吸光度A樣，把水楊酸換成水后測得樣品濃度下的吸光度A參比，把抗氧化劑換成水后，測得空白對照吸光度A空白。以抗壞血酸為對照品，按公式(2)計算·OH清除率。

(2)

(4) ABTS+·清除能力[24]

取7 mmol/L ABTS溶液和2倍體積的2.45 mmol/L的焦硫酸鉀(K2S2O7)水溶液，混勻靜置15 h。配制各質(zhì)量濃度下的0.3 mL樣品和生育酚溶液，滴入1.2 mL ABTS溶液，混勻5 min，在734 nm波長下測定吸光度。按公式(3)計算ABTS+·清除率:

(3)

式中：A樣品，ABTS和樣品溶液的吸光度；A對照，ABTS和甲醇溶液的吸光度。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

本試驗利用 Excel 2010 和 DPS 7.5 對試驗數(shù)據(jù)進行分析，試驗重復測定 3 次，結(jié)果用平均值±標準偏差表示。采用 Duncan 新復極差分析法，P<0.05 為顯著相關，P<0.01 為極顯著相關。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐黃漿水酒精發(fā)酵工藝

隨著初始蔗糖濃度、發(fā)酵溫度和酵母菌接種量等單因素發(fā)生變化，黃漿水酒液中的酒精度和可溶性固形物含量變化如圖1所示。

a-初始蔗糖質(zhì)量分數(shù)；b-發(fā)酵溫度；c-酵母菌接種量圖1 單因素變化對黃漿水酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of single factor change on alcohol fermentation of yellow pulp

由圖1-a可知，當初始蔗糖質(zhì)量分數(shù)為11%和12%時，2種發(fā)酵液的最終酒精度均達到8%(體積分數(shù))，已滿足后期醋酸發(fā)酵對酒精度的要求。且通過計算各處理組的糖利用率，得出初始蔗糖質(zhì)量分數(shù)為11%時，酒精發(fā)酵的糖利用率最高。因此可以確定在本組實驗中，初始蔗糖質(zhì)量分數(shù)為11%為最佳處理。

由圖1-b可知，發(fā)酵結(jié)束時34 ℃的酒液酒精度明顯低于30 ℃和32 ℃的酒液，可能因為溫度較高，不適于酵母菌的生長與繁殖[27]。發(fā)酵溫度為32 ℃時，酒液的最終酒精度最高，可溶性固形物含量最低，糖的利用率最大。因此可以得出在本組實驗中，酒精發(fā)酵的最適溫度為32 ℃。

由圖1-c可知，酵母菌接種量為3%的發(fā)酵液酒精度增加量多于4%和5%的發(fā)酵液，可能由于菌量過大時，過多消耗樣液本身的營養(yǎng)物質(zhì)用于自身生長與繁殖，導致糖轉(zhuǎn)化率變低[17]。因此在本組實驗中，選取3%的接種量最佳。

2.2 豆腐黃漿水酒液醋酸發(fā)酵工藝

2.2.1 單因素變化對黃漿水酒液醋酸發(fā)酵的影響

隨著初始酸度、初始酒精度、發(fā)酵溫度和醋酸菌接種量等單因素發(fā)生變化，黃漿水醋液中的總酸和酒精度含量變化如圖2所示。

a-初始酸度;b-初始酒精度;c-發(fā)酵溫度;d-醋酸菌接種量圖2 單因素變化對黃漿水酒液醋酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of single factor change on acetic acid fermentation of yellow pulp water liquor

由圖2-a可知，當初始酸度為2.1 g/100mL時，雖前期發(fā)酵速度快，但后期由于酸度過大也會抑制發(fā)酵，使發(fā)酵提前停止，酸度增加量較小。當初始酸度為1.9 g/100mL時，總酸增加量最多，且剩余酒精較少，醋的風味最佳。說明在試驗組內(nèi)，初始冰乙酸含量為1.9 g/100mL時發(fā)酵效果最佳。

由圖2-b可知，當初始酒精度為9%(體積分數(shù))時，雖前期發(fā)酵較快，但醋酸菌代謝所產(chǎn)生的廢物較其他組更多，從而抑制后期發(fā)酵，導致發(fā)酵速度變慢[28]。而初始酒精度為8%(體積分數(shù))時，總酸最高，可達5.79 g/100mL。說明在試驗組內(nèi)，初始酒精度為8%(體積分數(shù))時效果最佳。

由圖2-c可知，發(fā)酵溫度為30 ℃時，酒液的酸度最高，34 ℃和32 ℃的酒液酸度明顯低于26、28、30 ℃的酒液酸度。這可能是由于溫度較高，不適于菌的繁殖代謝[17]。且30 ℃的發(fā)酵液最終乙醇剩余量最少，醋味較明顯。因此可以得出，最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

由圖2-d可知，醋酸菌接種量為12%和14%的2組發(fā)酵液雖在前期發(fā)酵速度較快，但在發(fā)酵后期由于菌量過多、發(fā)酵過快，導致在醋液中產(chǎn)生的廢物較多，影響醋酸發(fā)酵的效果[17]。同理，8%和10% 2組相比較，8%一組的酸度增加速度較穩(wěn)定，酸度最大?？傮w來說，選用8%的醋酸菌接種量醋酸發(fā)酵效果最佳。

2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析

按照1.2.3.3中的方法，進行響應面法中心組設計，以最終的總酸為響應值，各發(fā)酵液最終酸度結(jié)果如表2所示。擬合數(shù)據(jù)后得到的回歸方程為Y=5.88-0.088A-0.1B+0.099C+0.038D+0.015AB-0.05AD-2.50×10-3BC+5.0×10-3BD-5.0×10-3CD-0.34A2-0.47B2-0.39C2-0.19D2。

表2 響應面試驗設計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

表3 響應面試驗方差分析Table 3 The variance analysis of response surface test

2.3 黃漿水發(fā)酵過程中活性物質(zhì)含量和抗氧化能力的變化

圖3、圖4是黃漿水發(fā)酵過程中的總酚和總黃酮含量測定的結(jié)果，前7 d為酒精發(fā)酵階段，后7 d為醋酸發(fā)酵階段。兩者含量變化趨勢相同，且黃漿水初始總酚為153.66 mg/100mL，初始總黃酮含量為1.43 mg/100mL；在黃漿水酒精發(fā)酵過程中總酚含量不斷升高，結(jié)束時為168.30 mg/100mL，總黃酮含量為19.39 mg/100mL；黃漿水酒液發(fā)酵過程中，兩者含量均呈上升趨勢，最終總酚含量為230.52 mg/100mL，總黃酮含量為66.12 mg/100mL。

圖3 黃漿水發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.3 Changes of total phenolic content during fermentation of yellow pulp water

圖4 黃漿水發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化Fig.4 Changes of total flavonoids content in yellow pulp water fermentation

該試驗對黃漿水、黃漿水酒液和黃漿水醋液的清除自由基活性進行了研究，從圖5、圖6中可知，黃漿水、黃漿水酒液和黃漿水醋液對DPPH自由基、ABTS+·和·OH均有清除作用。在黃漿水發(fā)酵制醋過程中，3種自由基清除率逐漸升高，其中黃漿水醋液對DPPH自由基清除率為85.27%，對ABTS+·清除率為49.22%，對·OH清除率為 94.18%，且黃漿水醋液的總還原力最高，可見黃漿水醋液對自由基清除效果較佳。

圖5 黃漿水、黃漿水酒液和黃漿水醋液的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant capacity of yellow pulp water, yellow pulp water liquor and yellow pulp water vinegar

圖6 黃漿水、黃漿水酒液和黃漿水醋液的總還原力Fig.6 Total reducing power of yellow pulp water,yellow pulp water liquor and yellow pulp water vinegar

表4為總酚、總黃酮含量與不同抗氧化指標的線性回歸方程的R值。由表4可知，R值接近于1，即總酚、總黃酮含量均與DPPH自由基、ABTS+·、·OH清除率、總還原力呈顯著正相關性，總酚、總黃酮質(zhì)量濃度越大，DPPH自由基、ABTS+·、·OH 清除率、總還原力越強。研究結(jié)果表明，黃漿水醋液的DPPH自由基、ABTS+·、·OH 清除率、總還原力在很大程度上受總酚和總黃酮含量的影響。此結(jié)論與張村雪等[29]研究紫甘薯醋及其不同發(fā)酵階段產(chǎn)物的總酚總黃酮與抗氧化指標線性關系結(jié)果一致。

表4 黃漿水發(fā)酵過程中總酚和總黃酮與不同抗氧化指標關系Table 4 Total phenolic and total flavonoids in yellow pulp water fermentation

2.4 黃漿水發(fā)酵過程中氨基酸變化影響

將黃漿水先發(fā)酵7 d(初始蔗糖質(zhì)量分數(shù)為11%，酵母菌接種量為3%，發(fā)酵溫度為32 ℃)，所制得的黃漿水酒液再發(fā)酵7 d[醋酸菌接種量為8%，初始酸度為1.9 g/100mL，初始酒精度為8%(體積分數(shù))，發(fā)酵溫度為30 ℃]。測定黃漿水、黃漿水酒液、黃漿水醋液氨基酸含量。結(jié)果如表5所示。

表5 氨基酸含量的變化 單位：g/kg

由表5可知，黃漿水中檢測出的氨基酸含量為2.415 g/kg，包含了16種，其中有7種必需氨基酸，分別為賴氨酸(1.022 g/kg)、苯丙氨酸(0.02 g/kg)、亮氨酸(0.037 g/kg)、異亮氨酸(0.021 g/kg)、蛋氨酸(0.042 g/kg)、纈氨酸(0.057 g/kg)和蘇氨酸(0.051 g/kg)。酒精發(fā)酵后黃漿水酒液氨基酸含量為2.947 g/kg，與發(fā)酵之前相比有顯著變化，其中蘇氨酸等13種氨基酸在發(fā)酵后含量均增加，天冬氨酸、蛋氨酸含量減少。經(jīng)過醋酸發(fā)酵后黃漿水醋液氨基酸總量為3.544 g/kg，其中天冬氨酸等13種氨基酸含量均增多，可能是因為醋酸菌在發(fā)酵后期失去活性，降解成了氨基酸從而被檢出；精氨酸等3種氨基酸含量減少，可能是被醋酸菌降解成風味物質(zhì)。

參考ARD[30]的分類方法，根據(jù)氨基酸滋味不同，可以將其分為苦味、鮮味、甜味和芳香味4類氨基酸。由圖7可知，通過發(fā)酵，黃漿水發(fā)酵液呈味氨基酸的組成發(fā)生了一些變化。經(jīng)過酒精發(fā)酵，氨基酸含量均有所增加，苦味氨基酸含量由0.669 g/kg增加到0.902 g/kg，鮮味氨基酸含量由1.407 g/kg增加到1.542 g/kg，甜味氨基酸含量由0.286 g/kg增加到0.408 g/kg，芳香味氨基酸含量由0.053 g/kg增加到0.095 g/kg。經(jīng)過醋酸發(fā)酵，苦味氨基酸和鮮味氨基酸含量減少，甜味氨基酸和芳香味氨基酸增加，在一定程度上改變了醋液的口感。黃漿水醋液中苦味氨基酸含量為0.682 g/kg，鮮味氨基酸含量為1.075 g/kg，甜味氨基酸含量為1.341 g/kg，芳香味氨基酸含量為0.446 g/kg。

圖7 呈味氨基酸含量的變化Fig.7 Changes of flavor amino acids

3 結(jié)論

本試驗以豆腐制作過程中析出的黃漿水為原材料，采用單因素和響應面試驗優(yōu)化確定了最適工藝條件。其中，酒精發(fā)酵最佳工藝條件為：初始蔗糖質(zhì)量分數(shù)為11%，酵母菌接種量為3%，發(fā)酵溫度為32 ℃；醋酸發(fā)酵最適工藝條件：醋酸菌接種量為8%，初始酸度為1.9 g/100mL，初始酒精度為8%(體積分數(shù))，發(fā)酵溫度為30 ℃，所制產(chǎn)品醋酸度適口，以證明黃漿水的充分利用，能帶來可觀的經(jīng)濟效益；通過發(fā)酵，營養(yǎng)物質(zhì)總酚、總黃酮、氨基酸含量上升，總還原力，消除DPPH自由基、·OH、ABTS+·等抗氧化能力也有所上升，使人們能夠了解功能性食醋加工過程中營養(yǎng)的損失和保留，為今后功能型新型醋的開發(fā)與研制打下良好基礎。