青梅酚類物質(zhì)在體外模擬消化過程中生物接受率和抗氧化活性的變化

楊瑞麗，郭卓釗，施奕喬，郭美媛，黃葦

1(廣東康輝集團有限公司，廣東 潮州，515638)2(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州，510462)

青梅(Prunusmumesieb.Et Zucc.)，屬于薔薇科李屬，是一種傳統(tǒng)的健康果品，在中國、日本和韓國等東亞地區(qū)廣泛種植。已有研究報道，青梅及其多酚提取物能改善骨質(zhì)疏松癥、酒精肝、糖尿病、肥胖癥、過敏和咳嗽等疾病[5-6]。青梅含有豐富的酚類物質(zhì)，多酚含量約占2.07%[7]，具有很強的抗氧化活性。已有研究表明，青梅的多酚含量和抗氧化活性明顯高于蘋果、柑橘等常見水果[8]。截至目前，國內(nèi)外學者對于青梅的酚類物質(zhì)定性研究主要集中在使用有機溶劑提取的游離酚類物質(zhì)，并通過不同提取和儀器分析方法從不同品種、地區(qū)的青梅游離酚中共分離鑒定出40種單體酚物質(zhì)，但其結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的含量組成以及發(fā)揮的功能活性還未見報道[6, 9]。此外，目前的研究報道大多基于有機溶劑提取后評價其功能活性，未充分考慮酚類物質(zhì)在人體中的消化釋放和吸收利用情況。酚類化合物的穩(wěn)定性差，易受溫度、氧氣、光照、pH等環(huán)境因素影響。然而，人體消化吸收過程是一個復雜的環(huán)境體系，含有酚類物質(zhì)的食物經(jīng)過酸性的胃液環(huán)境和弱堿性的腸液環(huán)境，在不同消化酶體系、滲透壓、甚至其他食物成分作用下從基質(zhì)中釋放出來，這導致經(jīng)人體消化后酚類物質(zhì)含量可能與其在食物中的含量有較大差異。酚類物質(zhì)被人體消化和吸收的程度可用生物可接受率和生物利用度衡量。其中，生物可接受率是指多酚被人體攝入，經(jīng)胃、小腸消化后，可被小腸吸收利用的含量占攝入總量的比值，反映了酚類物質(zhì)在消化過程中的釋放情況，是消化吸收最重要的一步[10]。不同來源的酚類物質(zhì)生物可接受率不同，豆類、蔬菜、谷物的生物可接受率分別為25.47%、26.01%和28%。目前在已有的研究方法中，在生物體內(nèi)進行實驗最能準確反映實際消化情況，但其周期長，成本高，且伴隨著倫理問題和個體差異。因此，國際多領(lǐng)域?qū)＜彝ㄟ^模擬人體實際消化過程，建立了標準化的體外靜態(tài)消化INFOGEST 2.0模型，其實驗結(jié)果與在人體和動物體內(nèi)消化情況有良好的相關(guān)性[11]。

目前，青梅酚類物質(zhì)的含量和生物活性已有研究報道。青梅多酚在體外模擬消化過程中生物接受率和抗氧化活性的變化未見報道。因此，本實驗以青梅為材料，利用 UPLC-MS/MS 分析青梅的多酚含量及單體組成，并采用模擬體外消化模型(INFOGEST 2.0)研究消化過程中青梅酚類物質(zhì)的釋放、生物可接受率，及其抗氧化活性的變化，以期為青梅的功能活性研究和相關(guān)營養(yǎng)保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青梅，廣東康輝集團有限公司。采用分組采樣，從不同果樹隨機采摘青梅，青梅單果重約18 g，均產(chǎn)自廣東普寧(23°29’N，116°117’E)的果園。將采摘后的青梅洗凈，經(jīng)冷凍干燥制得凍干粉后，儲存在-20 ℃冰箱備用。胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、膽鹽、ABTS、熒光素鈉、2, 2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽[2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH]、福林酚試劑，美國Sigma公司；新綠原酸(≥98%)、綠原酸(≥98%)、隱綠原酸(≥98%)、對羥基苯甲酸(≥98%)、p-香豆酸(≥98%)、阿魏酸(≥98%)、原花青素B1(≥98%)等，上海源葉生物科技有限公司；色譜級乙腈，美國Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS，美國Thermo Fisher Scientific 公司；VersaMAS酶標儀，美國Melecular Devices公司；數(shù)顯恒溫循環(huán)水浴鍋，國華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 青梅酚類物質(zhì)的提取

根據(jù)LI等[12]的方法稍加修改，用有機試劑法提取青梅的游離酚，用堿水解法提取青梅的結(jié)合酚，兩部分提取物合并為總酚。精確稱量0.5 g樣品凍干粉，加入15 mL含體積分數(shù)1%甲酸的80%甲醇水溶液，超聲處理30 min，在4 ℃以12 000 r/min離心10 min，合并上清液并加入等量的乙酸乙酯萃取3次，于35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯后，用甲醇定容至10 mL，得青梅游離態(tài)酚。將15 mL 2 mol/L NaOH溶液加入提取完游離酚的青梅果渣，充入N2后，置于30 ℃的恒溫搖床振蕩4 h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，在上述條件下離心、萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后，用甲醇定容至10 mL得結(jié)合態(tài)酚，貯存在-20 ℃冰箱備用。

云銅股份西南銅業(yè)是一個具有60年歷史的國有企業(yè)，在當前國企改革發(fā)展及從嚴治黨的新形勢、新要求下，如何發(fā)揮公司基層黨組織的政治優(yōu)勢、組織優(yōu)勢和群眾優(yōu)勢，不斷提高基層黨組織的戰(zhàn)斗力、凝聚力和吸引力？如何發(fā)揮廣大黨員的先鋒模范作用，不斷提升公司市場盈利能力、核心競爭能力、可持續(xù)發(fā)展能力，成為西南銅業(yè)黨委亟需研究解決的重要課題。

1.2.2 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu 法測定[12]。取25 μL樣品溶液或沒食子酸標準溶液加入96孔板，并加入125 μL的0.2 mol/L的福林酚試劑，在振蕩器混勻后，放置室溫避光反應10 min。向96孔板加入125 μL的飽和Na2CO3溶液，混勻后避光反應30 min。使用酶標儀在765 nm處測定吸光值，結(jié)果表示為每克干物質(zhì)中所含的沒食子酸當量(mg GAE/g DW)，并以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準工作曲線(y=0.005 4x+0.068 2；R2=0.999 7)。

1.2.3 UPLC-Q-Exative Orbitrap/MS 分析酚類物質(zhì)組成及含量

用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)對酚類物質(zhì)提取物進行定性和定量分析。液相條件：采用Agilent PoroShell HPH-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，4 μm)分離酚類物質(zhì)；柱溫設(shè)置為40 ℃；流動相A和B分別為超純水(含體積分數(shù)1‰甲酸)和乙腈(含體積分數(shù)1‰甲酸)；流速0.3 mL/min；進樣體積5 μL；梯度洗脫：0～3 min 95%～85%A，3～11 min 85%～70%A，11～15 min 70%～50%A，15～21 min 50%～10%A，21～22 min 10%～95%A。質(zhì)譜條件為：采用負離子模式，保護氣體(N2)：30 arb，輔助氣體(N2)：10 arb，毛細管電壓3 200 V，毛細管溫度320 ℃，掃描范圍100～1 500m/z。根據(jù)保留時間、一級質(zhì)譜信息和二級質(zhì)譜信息進行定性分析；根據(jù)標準工作曲線進行定量分析。

1.2.4 體外模擬消化模型及生物可接受率分析

為評估青梅酚類物質(zhì)的生物可接受率，按照 INFOGEST 2.0的方法模擬體外胃腸消化[11]。消化過程分為胃和小腸2個消化階段，胃消化儲備液和小腸消化儲備液配制方法參照表1。胃消化階段：準確稱量1 g青梅凍干粉到有螺絲蓋的小瓶中，加入8 mL胃消化儲備液、0.42 mL胃蛋白酶(2 000 U/mL)和0.24 mL胃脂肪酶(60 U/mL)、27.5 μL CaCl2溶液(44.1 g/L)，調(diào)節(jié)pH至3.00，超純水定容至10 mL，充分混勻后，置于37 ℃恒溫搖床避光振蕩反應2 h，在胃消化結(jié)束后取出樣品。小腸消化階段：繼續(xù)加入4 mL小腸消化儲備液、2.5 mL胰酶(100 U/mL)、1.5 mL膽鹽(200 mg/mL)、20 μL CaCl2溶液，調(diào)節(jié)pH至7.00，超純水定容至20 mL，充分混勻后，置于37 ℃恒溫搖床避光振蕩反應2 h，在小腸消化結(jié)束后取出樣品。將上述取得的樣品pH調(diào)至2，4 ℃離心(10 000 r/min)10 min，取上清液作為待測樣品，置于-20 ℃?zhèn)溆谩６喾拥纳锟山邮苈时硎緸橄髽悠分蟹宇愇镔|(zhì)的含量與消化前樣品中酚類物質(zhì)含量的比值。消化前后總酚含量和單體酚含量分別采用1.2.2和1.2.3的方法測定。

1.2.5 抗氧化活性評價

為進一步分析青梅多酚在消化過程中抗氧化活性的變化，本研究測定青梅多酚提取液和不同階段消化液的抗氧化能力。ABTS自由基清除能力測定采用96孔法[13]，單位表示為每克樣品含有水溶性維生素E當量(Trolox equivalent，TE)的毫克數(shù)(mg TE/g DW)，并以Trolox濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準工作曲線(y=-0.004 6x+0.679 1；R2=0.999 8)；DPPH自由基清除能力測定采用VELZQUEZ等[14]的方法，單位表示為每克樣品含有TE當量的毫克數(shù)(mg TE/g DW)，并以Trolox濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準工作曲線(y=-0.003 6x+1.455 9；R2=0.998 3)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Orign 2020軟件進行單因素方差、顯著性分析。所有實驗重復3次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。采用SPSS 24.0對多酚釋放量與抗氧化活性進行相關(guān)性分析。檢驗水準α=0.05，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 青梅多酚在體外消化過程中釋放量和生物可接受率的變化

體外消化實驗是一種廣泛使用的測定攝入化合物生物可接受率的方法。本研究采用INFOGEST 2.0體外靜態(tài)模擬胃腸道消化方法，研究青梅在不同消化階段酚類物質(zhì)含量釋放效應的差異，以期探究青梅酚類物質(zhì)在體外消化的情況。如表2所示，未消化的青梅多酚含量為(10.72±0.23)mg GAE/g DW。經(jīng)體外胃消化后，在胃消化階段的釋放量為(3.10±0.13)mg GAE/g DW。進一步經(jīng)體外小腸消化后，消化液中的多酚含量較胃消化階段顯著減少(P<0.05)，其多酚的釋放量為(1.00±0.04)mg GAE/g DW，較胃消化階段降低了67.74%，青梅多酚的生物可接受率為9.33%。

表2 青梅多酚在體外消化過程中含量及其生物可接受率Table 2 Contents of total phenolics released into digestive fluid and their bioaccessibility during in vitro digestion of P.mume

青梅的多酚含量高于羅鳴等[15]測得的結(jié)果，這可能是本實驗同時提取結(jié)合酚導致，也可能是產(chǎn)地、采摘時間和成熟度等因素造成的差異。青梅的胃和小腸消化液中多酚含量顯著低于化學試劑提取的含量，與文獻報道中黑莓的變化趨勢一致[16]。這表明酚類物質(zhì)在消化過程中的釋放與化學試劑從果實直接提取存在顯著性差異。另一個可能的原因是多酚的完全釋放受消化環(huán)境的影響，并不都是在胃和小腸消化階段中為人體所消化利用。有研究表明，膳食多酚在人體的吸收特性與其存在形式相關(guān)，游離態(tài)酚的消化吸收部位主要是胃和小腸，而結(jié)合態(tài)酚主要在結(jié)腸部位，被腸道菌群及其生物酶代謝，供人體吸收。由于不同食品中酚類物質(zhì)的組成和含量不同，其酚類物質(zhì)的生物可接受率也不同。不同種類水果酚類物質(zhì)在消化過程中的消化釋放機制也存在差異。有學者[17]報道新鮮藍莓的生物可接受率為11.5%，黑莓的生物可接受率為15.29%。本研究中青梅多酚的生物可接受率為9.33%，低于藍莓等水果。原因可能是青梅中的酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，例如在弱堿性環(huán)境下，原花青素和表兒茶素等黃酮類物質(zhì)不穩(wěn)定而發(fā)生降解[18]。另外，可能仍有多酚截留在食物基質(zhì)中，隨著消化道進入了結(jié)腸部位。

2.2 青梅單體酚在體外消化過程中組成含量和生物可接受率

為進一步分析青梅在體外消化過程中單體酚的組成含量變化，通過UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS，在青梅多酚提取物中共鑒定出10種單體物質(zhì)(圖1和表3)，包括7種酚酸(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、對羥基苯甲酸、p-香豆酸、阿魏酸和異阿魏酸)和3種黃酮(原兒茶素B1、表兒茶素和蘆丁)。由于地區(qū)、提取工藝和檢測手段的不同，青梅多酚的單體物質(zhì)鑒定結(jié)果存在差異。夏道宗[19]通過HPLC分析青梅乙酸乙酯提取物的單體酚物質(zhì)，其中綠原酸類含量最高，與本研究結(jié)果一致。SHIN等[5]在青梅乙醇提取物中鑒定出橙皮苷和芹菜素-7-葡萄糖苷。在本研究中(表4)，青梅的主要成分為新綠原酸 (220.94±14.32)mg/100 g DW，其次為表兒茶素(43.25±2.40)mg/100 g DW、異阿魏酸(36.75±4.24)mg/100 g DW和p-香豆酸(32.42±2.85)mg/100 g DW，其他單體酚化合物含量在2.12～20.36 mg/100 g DW。對羥基苯甲酸的生物可接受率最高，其次為蘆丁、p-香豆酸和隱綠原酸等。不同食物的單體酚物質(zhì)，因與食物基質(zhì)結(jié)合程度不同、截留在植物結(jié)構(gòu)中的方式不同和自身性質(zhì)的差異，在胃和小腸消化過程中表現(xiàn)的含量不同[20]。在本研究中，青梅單體酚酸(除隱綠原酸)的含量經(jīng)胃和小腸消化后均出現(xiàn)不同程度的下降(表4)。其中，隱綠原酸的含量顯著增加，原因可能是綠原酸類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)含有不穩(wěn)定的酯鍵和雙鍵較易受消化環(huán)境的影響，發(fā)生同分異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化[21]，進而導致在胃消化階段綠原酸和新綠原酸含量降低，隱綠原酸含量增加。有研究報道，體系中酸和堿的變化能使分子發(fā)生外消旋作用，進而改變手性異構(gòu)的產(chǎn)物[20]。TENORE等[22]研究茶葉多酚在體外消化過程中的變化，表明黃酮類物質(zhì)在腸液的弱堿性條件下，易發(fā)生氧化、降解等反應。本研究中單體黃酮類物質(zhì)(表兒茶素、原花青素B1和蘆丁)含量降低原因可能是對胃和小腸消化過程pH發(fā)生變化敏感，且消化體系中的溶解氧也能導致表兒茶素和原花青素B1等多聚體自氧化[20]。

a-青梅游離酚;b-結(jié)合酚;c-胃消化液;d-腸消化液圖1 酚質(zhì)譜總離子流圖(TICs)Fig.1 Total ion chromatograms (TICs)

表3 單體酚類物質(zhì)的離子碎片Table 3 Identification of individual phenolics from P.mume by UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS

表4 青梅多酚單體在體外消化過程中的釋放量及其生物可接受率Table 4 Changes of individual phenolics content in P.mume during simulated digestion in vitro

續(xù)表4

2.3 青梅在體外消化過程中抗氧化活性的變化

如表5所示，青梅的ABTS和DPPH抗氧化值在體外消化中均出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)。未消化的青梅ABTS抗氧化值為(16.03±1.00)mg TE/g DW，在體外胃和小腸消化過程中，胃消化液的ABTS抗氧化值為(2.02±0.29)mg TE/g DW，小腸消化液的ABTS 抗氧化值僅為(0.30±0.08)mg TE/g DW。青梅的DPPH抗氧化值與ABTS抗氧化值變化趨勢一致，未消化的青梅DPPH抗氧化值為(14.65±1.40)mg TE/g DW，青梅體外胃和小腸消化液的DPPH抗氧化值分別為(2.05±0.04)和(0.32±0.02)mg TE/g DW。

表5 體外模擬消化過程中青梅的抗氧化活性 單位：mg TE/g DW

酚類物質(zhì)是青梅的重要活性物質(zhì)，能通過單電子和氫原子轉(zhuǎn)移有效清除自由基，在生理和細胞水平上能有效防止氧化損傷。目前體外抗氧化評價方法按照反應機制的不同，主要分為基于氫離子轉(zhuǎn)移機制(hydrogen atom transfer,HAT)和基于單電子轉(zhuǎn)移機制(single electron transfer mechanism,SET)的評價方法[21]。HAT法反映以提供氫離子的方式發(fā)揮抗氧化活性的能力，SET法則表示通過轉(zhuǎn)移電子的方式清除自由基的能力[10]。本研究選取了兼具HAT和SET機制的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力評價方法。

有研究表明，天然食物的抗氧化能力與多酚含量呈正相關(guān)。不同果品的植物結(jié)構(gòu)、多酚組成含量及其與其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)等的相互作用不同，抗氧化能力存在差異。錢井[23]測定35種柑橘的抗氧化活性，DPPH抗氧化值為5.48～21.11 mg TE/g；曾少敏[24]研究表明，梨的ABTS抗氧化值為1.54 mg TE/g。青梅的DPPH和ABTS抗氧化能力分別為14.65和16.03 mg TE/g，清除自由基能力遠高于香梨，與柑橘相當?？赡茉蚴乔嗝泛枯^高的單體酚是新綠原酸和咖啡酸，已有研究表明綠原酸類和咖啡酸具有良好的自由基清除能力[25]。

胃和小腸消化后，青梅消化液的DPPH和ABTS抗氧化值出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，且與多酚含量變化趨勢一致，具有極顯著相關(guān)(P<0.01)。多酚含量與ABTS、DPPH抗氧化值的相關(guān)系數(shù)分別為0.935和0.949，表明抗氧化活性降低可能是與酚類物質(zhì)在體外消化的損失有關(guān)。酚類物質(zhì)在弱堿性環(huán)境不穩(wěn)定，且易與蛋白質(zhì)等大分子絡(luò)合，降低其在消化液的溶解性，進而降低抗氧化能力。本研究結(jié)果中，原花青素B1、對羥基苯甲酸、阿魏酸和蘆丁等單體物質(zhì)的含量在體外消化過程中顯著下降，進一步通過SPSS軟件進行相關(guān)性檢驗發(fā)現(xiàn)，在體外消化過程中，青梅的ABTS抗氧化值與原花青素B1、p-香豆酸、阿魏酸和蘆丁的相關(guān)性系數(shù)分別為1.000、0.988、0.994和0.959；DPPH抗氧化值與原花青素B1、對羥基苯甲酸、阿魏酸和蘆丁分別為0.997、0.986、0.992和0.974，均呈顯著性相關(guān)(表6)，這表明原花青素B1、p-香豆酸、阿魏酸和蘆丁可能是青梅抗氧化活性的主要貢獻物質(zhì)。

表6 模擬消化過程中青梅多酚釋放量與抗氧化活性的關(guān)系Table 6 Relationships between polyphenol release and antioxidant activity of P.mume during simulated digestion

續(xù)表6

3 結(jié)論

本研究采用INFOGEST 2.0體外靜態(tài)模擬胃腸道消化模型，研究青梅在消化過程中酚類化合物的釋放量和抗氧化活性的變化，青梅總酚含量、單體酚含量在胃消化階段比小腸消化階段高，表明其在胃消化階段釋放量高且穩(wěn)定，而在小腸消化階段降解相對較多。此外，模擬消化過程中青梅多酚釋放量與ABTS和DPPH抗氧化值存在顯著正相關(guān)，表明酚類化合物是青梅中主要的抗氧化活性物質(zhì)。該研究從模擬人體胃腸道消化角度對青梅酚類化合物的生物可接收率及其抗氧化性進行了全面系統(tǒng)的評估，為青梅的健康作用及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)應用提供科學依據(jù)。