液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜禽肉和雞蛋中氨基酸含量

李智，周燦，費華熙，王素利，鄭連姬*

1(重慶食品工業(yè)研究所有限公司，重慶，400042)2(中國輕工業(yè)聯(lián)合會食品質(zhì)量監(jiān)督檢測重慶站，重慶，400042)

氨基酸是蛋白質(zhì)和酶的基本組成部分。氨基酸可按照氨基連在碳鏈上的不同位置而分為α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、ω-氨基酸。平常我們所知的經(jīng)蛋白質(zhì)水解后得到的氨基酸均為α-氨基酸，機體內(nèi)常見氨基酸有20種，其中有8種氨基酸高等動物無法自主合成，包括賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸(又名甲硫氨酸)、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸，這些氨基酸必須通過不斷攝取食物來獲取。

氨基酸在體內(nèi)重要的生理功能不僅是參與合成蛋白質(zhì)和其他含氮化合物，還作為信號分子參與機體多種生理進程的調(diào)控，越來越多的學者證明氨基酸可作為信號分子參與細胞內(nèi)信號傳導過程，可以調(diào)控機體能量和糖脂代謝，最終導致機體整體代謝的改變[1]。如在厭氧狀態(tài)下機體啟動糖原分解時，谷氨酸和天冬氨酸對線粒體的氧化磷酸化和ATP合成進行調(diào)節(jié)[2]；亮氨酸可以通過激活谷氨酸脫氫酶從而促進胰島β細胞合成胰島素[3]。

由于氨基酸分析在蛋白質(zhì)化學、生物化學、食品科學、臨床醫(yī)學等領域的研究中起著重要的作用，因此，對氨基酸分析方法的研究與改進引起人們高度重視。目前報道的氨基酸檢測方法有紫外分光光度法[4]、熒光光度法[5]、紅外光譜法[6]、高效陽離子交換色譜法[7-8]、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法[9]、高效液相色譜法[10]、毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)[11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]等。這些方法通常采用鄰苯二甲醛[14]、異硫氰酸苯酯[15]、9-氯甲酸芴甲酯[16]、丹磺酰氯[17]、二硝基氟苯、1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺[18]、磺酰氯二甲胺偶氮苯[19]、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯[20]、2,4-二硝基氯苯[21]等衍生試劑進行衍生，這使得試劑消耗量大、檢測步驟復雜、檢測周期長。應用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)檢測氨基酸可以直接分析提取物中的氨基酸，無需采用衍生步驟[22-25]。本文通過對樣品水解條件、質(zhì)譜、色譜條件的優(yōu)化，在電噴霧離子源(electron spray ionization, ESI)正離子掃描模式下檢測，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物源性食品畜禽肉和雞蛋中氨基酸的檢測方法，并將檢測結果與我國國家標準自動氨基酸測定方法進行了比較，以期建立一種適用于畜禽肉和雞蛋中氨基酸檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基酸標準溶液(包括半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸)，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇為色譜純，河北百靈威超精細材料有限公司；鹽酸、苯酚、甲酸、乙酸銨、檸檬酸鈉等均為國產(chǎn)分析純，重慶川東化工(集團)有限公司。豬肉、雞蛋、雞肉，市售。

1.2 儀器與設備

Agilent 6460 Triple Quad LC-MS/MS儀，美國安捷倫公司；TOPEX+微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；BGZ-240電熱鼓風恒溫箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；ZFK-040電熱真空干燥箱，上海實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品水解

1.3.1.1 酸水解

稱取均勻試樣2 g于水解管中，加入15 mL 6 mol/L HCl溶液，加入3～4滴苯酚，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min，接到真空泵的抽氣管上，抽真空(接近0 Pa)，然后充入N2，重復抽真空-充入N23次后，在充N2狀態(tài)下封口或擰緊螺絲蓋。將已封口的水解管放在(110±1) ℃的電熱鼓風恒溫箱內(nèi)，水解22 h后，取出，冷卻至室溫。打開水解管，將水解液過濾至50 mL容量瓶內(nèi)，用少量水多次沖洗水解管，水洗液移入同一容量瓶(50 mL)內(nèi)，最后用水定容至刻度，振蕩混勻。準確吸取1.0 mL濾液移入到15 mL或25 mL試管內(nèi)，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40～50 ℃加熱環(huán)境下減壓干燥，干燥后殘留物用1～2 mL水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。用1.0～2.0 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液加入到干燥后試管內(nèi)溶解，振蕩混勻后，吸取溶液通過0.22 μm濾膜后，備用。

1.3.1.2 高壓水解

稱取均勻試樣0.5 g，置于50 mL消解管內(nèi)，加入15 mL HCl溶液，加入2滴苯酚，于110 ℃鼓風干燥箱中消解6 h，取出冷卻，將水解液全部轉(zhuǎn)移至 50 mL容量瓶中，用一級水定容至刻度，搖勻、過濾，精密吸取1 mL于40～50 ℃加熱環(huán)境下減壓干燥，殘留物用0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸溶液定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，備用。

1.3.1.3 微波水解

稱取均勻試樣0.5 g，置于100 mL消解管內(nèi)，加入15 mL HCl溶液，加入2滴苯酚，于80 ℃消解爐內(nèi)消解30 min，取出冷卻，轉(zhuǎn)移至微波消解儀上150 ℃，消解4 h，取出冷卻，將水解液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用一級水定容至刻度，搖勻、過濾，精密吸取1 mL于10 mL容量瓶中，置于真空干燥箱內(nèi)，于50 ℃減壓干燥(真空干燥箱內(nèi)放入P2O5作為干燥劑)，干燥后殘留物用0.1%甲酸溶液定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，備用。

1.3.2 色譜條件

1.3.2.1 液相色譜條件

色譜柱：AthehaC8-WP(2.1 mm×150 mm，3 μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液+10 mmol/L乙酸銨，流動相B為甲醇；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；梯度洗脫參數(shù)見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)；電噴霧電壓：3 500 V；離子源溫度：300 ℃；氣流：5 L/min；霧化器壓力：45 psi；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流：11 L/min；噴嘴電壓：500 V。

1.3.3 方法學驗證

檢出限、精密度、回收率的測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗重復3次，采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計處理。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取5 μL質(zhì)量濃度為1 μg/L氨基酸單標溶液，先后進行母離子和子離子掃描，獲得穩(wěn)定性好、信號強度高的碎片離子，通過MRM模式Fragmenton優(yōu)化不同氨基酸的錐電壓和CE電壓。結果見表2。

表2 十七種氨基酸質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters for the 17 amino acids

2.2 色譜條件優(yōu)化

在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，考察不同色譜柱和不同流動相對目標物質(zhì)譜信號的影響。對比了3種色譜柱，ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm，1.8 μm)，ZORBAX SB-C18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，AthehaC8-WP(2.1 mm×150 mm，3 μm)。分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液(10 mmol/L乙酸銨)、乙腈- 0.1%甲酸水溶液(10 mmol/L 乙酸銨)幾種流動相對目標化合物的影響。結果顯示，使用AthehaC8-WP(2.1 mm×150 mm，3 μm)色譜柱和甲醇-0.1%甲酸水溶液(10 mmol/L乙酸銨)體系，效果更好。甲醇較乙腈在離子響應及分離度上更好，而加入了甲酸可以明顯提高17中氨基酸的離子化效率，乙酸銨能提高信號響應并能有效解決峰拖尾問題。在梯度洗脫條件下目標物出峰較均勻，峰形較好，分離度好，保留時間適中。17種氨基酸的總離子流圖見圖1。

1-Lys;2-His;3-Arg;4-Gly;5-Cys;6-Ser;7-Ala;8-Asp;9-Thr;10-Glu;11-Pro;12-Val;13-Met;14-LLE;15-Leu;16-Tyr;17-Phe圖1 十七種氨基酸的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 17 amino acids

2.3 基質(zhì)效應的研究

值得注意的是，動物源性食品在LC-MS/MS的分析方法中存在明顯的基質(zhì)效應，但是不含氨基酸的空白基質(zhì)難以獲取，無法采用配制基質(zhì)匹配工作曲線的方法消除基質(zhì)效應。另外氨基酸內(nèi)標溶液價格異常昂貴，不利于成本控制。因此本實驗增大樣品提取液的稀釋倍數(shù)以削弱甚至消除基質(zhì)效應。實驗過程中考察了將1.3.1中備用液稀釋1、5、40、50倍(相當于稱樣后稀釋500、2 500、20 000、25 000倍)時氨基酸的含量，實驗結果見圖2。隨著稀釋倍數(shù)的增大，各氨基酸的測定值也逐漸增大，稀釋至20 000～25 000倍時，氨基酸含量基本不變，即稀釋倍數(shù)500、2 500和20 000、25 000之間有顯著性差異，稀釋倍數(shù)為20 000和25 000之間無顯著性差異。這說明各氨基酸在動物源性食品基質(zhì)中呈現(xiàn)基質(zhì)減弱效應，隨著稀釋倍數(shù)的增大，樣液中基質(zhì)含量相應減小，基質(zhì)減弱效應也逐漸衰弱，稀釋至20 000倍及以上時，樣液中極微量的基質(zhì)對氨基酸的影響基本可以忽略不計。因此在后續(xù)實驗中將1.3.1中備用液稀釋40倍(相當于稱樣后總稀釋倍數(shù)為20 000倍)，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后上機測定。

圖2 稀釋倍數(shù)對基質(zhì)效應的影響Fig.2 Effect of dilution ratios on matrix effect注：n=3，不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.4 樣品水解條件優(yōu)化

2.4.1 微波水解條件的優(yōu)化

2.4.1.1 微波溫度的優(yōu)化

固定微波水解時間6 h，通過改變水解溫度(130、140、150、160、170、180 ℃)考察氨基酸含量變化。結果表明，隨著溫度的升高，水解得到的氨基酸含量逐漸增大，150 ℃時氨基酸含量最大，高于150 ℃時部分氨基酸含量有所下降，因此選擇150 ℃為最佳水解溫度。

2.4.1.2 微波時間的優(yōu)化

固定微波水解溫度150 ℃，通過改變水解時間(2、3、4、5、6 h)考察氨基酸含量變化。結果表明，隨著水解時間的增加，水解得到的氨基酸含量逐漸增大，4 h時氨基酸含量最大，時間>4 h時部分氨基酸含量略有下降，可能是因為個別氨基酸被破壞。因此選擇4 h為最佳水解時間。

2.4.2 樣品水解方法的確定

酸水解法蛋白質(zhì)水解徹底，水解過程中不發(fā)生消旋化。缺點是該水解方法耗時長，步驟繁瑣，容易對實驗測定帶來誤差。酸水解法也是目前我國氨基酸檢測國家標準中普遍采用的水解方法。高壓水解法是以酸水解為基礎，解決了酸水解方法耗時長、步驟繁瑣的問題，一般6 h可以完成。微波水解法利用微波輻射引起物體內(nèi)部分子相互摩擦而產(chǎn)生熱能，促使分子發(fā)生極化旋轉(zhuǎn)。該方法水解快，一般4 h可以完成。

為了解決傳統(tǒng)的酸水解法耗時長、步驟繁瑣的問題，本實驗以酸水解法為對照，微波水解法和高壓水解法進行了比較，比較結果見表3。微波水解法與傳統(tǒng)的酸水解法氨基酸測定結果之間無顯著性差異，高壓水解法測定結果中有個別氨基酸(精氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸)的測定結果與傳統(tǒng)的酸水解，微波水解法有顯著性差異，大部分氨基酸無顯著性差異。說明，微波水解法可以把水解時間從傳統(tǒng)酸水解24 h縮短為4 h，并且檢測步驟簡單，易操作。

表3 三種不同水解方法比較結果Table 3 Three different hydrolysis methods comparison results

2.4.3 樣品稱樣量的確定

為了確定不同的稱樣量對微波水解效果的影響，本實驗分別稱取豬肉0.1、0.2、0.5、0.6、1.0 g進行微波消解后測定17種氨基酸含量，結果見圖3。稱樣量為0.5 g時水解效果最優(yōu)，因此采用稱樣量為0.5 g。

圖3 稱樣量對水解效果的影響Fig.3 Influence of sample weight on the hydrolysis effect

2.5 檢出限

配制混合標準溶液質(zhì)量濃度為5.0～375.0 ng/mL的標準溶液，測定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準溶液的工作曲線，在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，標準品質(zhì)量濃度與峰面積值均有良好的線性關系，檢出限(limit of detection，LOD)以1/3信噪比評估法計算得出。具體線性方程及相關系數(shù)，檢出限見表4。

表4 十七種氨基酸的線性方程、相關系數(shù)(R)和檢出限Table 4 The linear equation, correlation coefficient (R) and detection limit of 17 amino acids

2.6 準確度及精密度

采用添加回收的方法，測定不同動物源性食品基質(zhì)中回收率，按表5中添加高、中、低水平做7次平行樣品，測定精密度，結果見表5。不同動物源性食品基質(zhì)中各氨基酸的回收率為85%～96%，精密度(relative standard deviation，RSD)為0.01%～0.71%。

續(xù)表5

2.7 LC-MS/MS與傳統(tǒng)氨基酸分析儀方法比較

為了進一步驗證LC-MS/MS測定動物源性食品畜禽肉和雞蛋中氨基酸含量方法的可行性，與傳統(tǒng)的氨基酸分析儀方法進行了比較，結果見表6。不同的動物源性樣品采用氨基酸分析儀和LC-MS/MS測定結果無顯著性差異，說明微波水解-LC-MS/MS法可以用于動物源性食品畜禽肉和雞蛋中氨基酸含量的測定。

3 結論

本文采用微波消解技術消解畜禽肉和雞蛋中蛋白質(zhì)為游離氨基酸，以0.1%甲酸水溶液+10 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇為流動相，梯度洗脫，串聯(lián)質(zhì)譜正離子模式進行監(jiān)測，外標法定量，測定動物源性食品畜禽肉和雞蛋中17種氨基酸。數(shù)據(jù)表明，本方法耗時短、操作較為簡便、快捷、精密度高，樣品分離度好，測定結果準確可靠，靈敏度高，所用試劑成本低，能滿足動物源性食品畜禽肉和雞蛋中17種氨基酸的檢測。