內(nèi)源性脂蛋白脂肪酶及其對牦牛乳風(fēng)味劣變的影響機制研究進展

張金亮，李義恒，楊曉麗，朱妍麗，吳世芳，鐘麗雯，張衛(wèi)兵*，文鵬程*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州，730000)

牦牛是一種草食性反芻家畜，主要生活在我國甘肅天祝甘南等高寒地區(qū)[1-2]。牦牛乳被稱為天然濃縮乳[3]，含有大量的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、脂肪及乳糖[4]。牦牛乳中干物質(zhì)含量高達17.86%～18.36%；乳脂含量達到6.50%～7.50%(最高可達10%)，平均比荷斯坦牛乳高出1倍以上[5]，是高原地區(qū)牧民主要營養(yǎng)來源。已有研究證實，牦牛乳中的風(fēng)味幾乎全部來源于乳脂肪[6]。而脂蛋白脂肪酶(lipoprtein lipase,LPL)與乳中乳脂肪球(milk fat globules，MFG)結(jié)合，造成牦牛乳乳脂肪球膜(milk fat globule membrane，MFGM)的大量破裂，在LPL的作用下，乳脂肪的甘油三酯(triglyceride，TG)被水解，產(chǎn)生大量的中、短鏈游離脂肪酸等揮發(fā)性成分轉(zhuǎn)化的甲基酮、酯、醇和醛等風(fēng)味物質(zhì)可以直接影響牦牛乳的風(fēng)味[7]。這種特殊風(fēng)味是牦牛乳的重要標(biāo)志[8]。牦牛乳中的飽和脂肪酸含量較高，多不飽和脂肪酸含量較低，與普通牛乳有明顯差異[9]，這些差異導(dǎo)致牦牛乳的乳香風(fēng)味與普通牛乳有較大的區(qū)別。LUO等[10]發(fā)現(xiàn)，與普通牛乳相比，MFGM中存在脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域，且MFGM數(shù)量更多，粒徑分布范圍更寬。牦牛乳脂肪顆粒大，且表面富含乳脂肪球[11]。因牦牛乳具有較大的脂肪顆粒，使其MFGM在剪切力的作用下表現(xiàn)得更加脆弱和敏感[12-14]，加之牧區(qū)放牧地點分散，產(chǎn)區(qū)交通不便，生鮮牦牛乳收集困難，收購、冷藏、運輸都存在諸多問題，導(dǎo)致新鮮牦牛乳在到達加工場所之前很容易發(fā)生風(fēng)味劣變。

因為牦牛乳具有極高的營養(yǎng)價值，已成為高端乳品的重要原料，產(chǎn)量逐年上升，人們對牦牛乳的關(guān)注也明顯增加，但目前對牦牛乳的研究還處于初步階段。牦牛乳與普通牛乳的風(fēng)味有很大的差異，為了對牦牛乳的進一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，研究牦牛乳其特殊的風(fēng)味就顯得尤為重要。而牦牛乳的風(fēng)味幾乎全部來源于乳脂肪，為更好地保存和調(diào)控牦牛乳的特殊風(fēng)味，本文對作用于牦牛乳脂肪而產(chǎn)生脂肪酸進而影響風(fēng)味的內(nèi)源性LPL自身的性質(zhì)、分離提純方法以及影響牦牛乳風(fēng)味的機制進行了綜述。

1 內(nèi)源性LPL的發(fā)現(xiàn)

LPL的發(fā)現(xiàn)至今已30多年，最初被稱為澄清因子[15]。脂蛋白脂肪酶全稱為三脂酰甘油蛋白脂?；饷?，但習(xí)慣上將它稱為脂蛋白脂肪酶[16]。LPL是脂蛋白代謝的中心酶，介導(dǎo)循環(huán)乳糜微粒(chylomicron，CM)和極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)LPL中的TG結(jié)合降解為甘油和脂肪酸[17]。除脂蛋白脂類外，LPL還能催化水溶性短鏈脂酰酯底物的水解，如對硝基苯乙酸酯和對硝基苯丁酸酯[18-19]。為了最大程度水解長鏈脂肪酸酯，該酶需要載脂蛋白C-Ⅱ[20-21]，這是富含甘油三酯脂蛋白和高密度脂蛋白的一種蛋白質(zhì)成分[22]；載脂蛋白C-Ⅱ不能增強水溶性底物或短鏈甘油三酯(如三丁基甘油三酯)的水解。在哺乳動物中，這種酶在脂肪組織、心臟、肌肉和泌乳乳腺中產(chǎn)生，在許多其他組織中也有少量產(chǎn)生。

LPL基因位于染色體8p22上，跨度30 kb，分為10個外顯子。在20世紀80年代，已成功從人、雞、牛和小鼠中克隆到了LPL基因, 并進行了序列分析。通過比較人與其他哺乳動物和畜禽類動物L(fēng)PL基因的一級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)具有高度的同源性，且人類 LPL、肝脂酶以及胰脂酶的氨基酸序列也具有高度同源性, 推測三者可能起源于同一個基因家族, 具有共同的作用機制。

2 LPL的分離純化

最早分離脂蛋白脂肪酶是從20世紀70年代開始，用物理方法處理，將脫脂乳離心得到懸浮液，將懸浮液進行冷凍干燥，得到干燥的粉狀物，但該方法得到的粉狀物酶活力較低[23]。OLIVECRONA等[24]通過利用丙酮-乙醚沉淀脫脂乳中的LPL，雖然得到的酶活力較低，但提供了新的方法。后來，OLIVECRONA等[25]對試驗進行改進，首次成功采用親和層析的方法從乳中大量地分離出LPL，利用肝素與瓊脂糖依靠共價鍵結(jié)合合成肝素-瓊脂糖凝膠，做為基質(zhì)，利用NaCl溶液進行梯度線性洗脫，收集LPL后進行酶比活力、回收率以及純化倍數(shù)分析。結(jié)果表明，LPL比活力為165，回收率達到50%，LPL被純化2 000倍。EGELRUD等[26]將2種方法結(jié)合起來，利用凝乳酶將脫脂乳中的蛋白沉淀下來，將得到的上清液采用(NH4)2SO4鹽析的方法將蛋白繼續(xù)沉淀，離心后得到懸浮液，將該懸浮液上樣后，用肝素-瓊脂糖凝膠進行分離，用NaCl溶液作為流動相對LPL進行線性梯度洗脫，分析其回收率、純化倍數(shù)和LPL的分子質(zhì)量，結(jié)果表明大約有67%的LPL被洗脫出來，共收集洗脫液100～170 mL，LPL純化倍數(shù)達到5 000～7 000倍，分子質(zhì)量為62 k～66 kDa。LPL的酶活力能被1.0 mol/L的NaCl溶液抑制，但能被牛血清激活。

不同物質(zhì)對酶活力的影響不同，不同樣本中的LPL對乳的自發(fā)脂解作用也不一樣[27]。為了定量不同樣本中的LPL， GOERS等[28]建立了直接夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法，使用親和純化的抗牛LPL雞免疫球蛋白。該夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗包含一個與微滴度井結(jié)合的捕獲抗體和一個生物素化的第二抗體用于檢測捕獲的LPL。GERSHENWALD等[29]描述了一種非競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，該方法用禽類脂肪LPL蛋白預(yù)涂板。BABIRAK等[30]利用單克隆抗體(mAb) 5D2作為一抗和二抗，建立了一種夾心免疫分析法，用于定量人血漿中免疫反應(yīng)性LPL二聚體。酶聯(lián)免疫吸附試驗，首次用于定量不同生物標(biāo)本中的LPL[31]，由于類似的敏感性和特異性，酶聯(lián)免疫吸附試驗逐漸被取代，LPL的定量目前采用不同的酶免疫分析放射免疫檢定法。靈敏的非放射性同位素方法也可以用于檢測肝素后LPL，使用酶法測定釋放的游離脂肪酸[32]。

3 LPL的結(jié)構(gòu)與功能

LPL是一種含有2個N-聯(lián)寡糖的糖蛋白，它作為同型二聚體存在，分子質(zhì)量為60 kDa[33]。早在1987年，WION等[34]就克隆得到了人類LPL的全長cDNA序列, 其開放讀碼框(open reading frame,ORF)包含1 428 bp，編碼475個氨基酸的蛋白質(zhì), 包括1個由27個氨基酸殘基組成的疏水信號肽。1989年DEEB等[35]最先從基因文庫中分離出LPL基因，并測定了它的全部核苷酸序列。

LPL的一級結(jié)構(gòu)為在一個多肽鏈中有450個氨基酸殘基，在多肽鏈中可以識別多個功能區(qū)域。比較不同樣本的LPL一級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)人和其他哺乳類動物的LPL的二硫鍵高度相似以及序列同源性，特別是形成PL催化結(jié)構(gòu)域的鏈，表明這些脂肪酶的整體結(jié)構(gòu)，特別是催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)非常相似。

目前LPL的二級結(jié)構(gòu)尚不明確，根據(jù)人胰脂酶結(jié)構(gòu)推測出LPL分子三維結(jié)構(gòu)，存在C端和N端2個結(jié)構(gòu)域[36]。Asn43是N端區(qū)一重要的糖基化位點，該位點維持著LPL的正常三維結(jié)構(gòu)，在酶活性表達中是必需的[37]。C端區(qū)呈一個折疊的柱狀連接在球形的N端區(qū)，C端區(qū)的功能尚有爭議，多數(shù)認為與介導(dǎo)酶與底物接觸，形成活性的LPL同源二聚體以及間接參與酶解過程。LPL催化活性中心的3個氨基酸分別為Ser132、His241和Asp156，調(diào)節(jié)底物與LPL的結(jié)合[38]。在LPL的氨基端域的中心同源區(qū)域內(nèi)，有更多的極性殘基疏水。因此，他們破壞密碼子位于外顯子4、5和6的LPL基因代碼的高度保守的殘留物形成LPL的催化域的一部分，在這個LPL的關(guān)鍵地區(qū)會直接影響酶的活性部位、中斷構(gòu)象和折疊。研究表明，該區(qū)域少部分氨基酸的取代(75、176、188、195和244)可能會影響活性LPL同型二聚體的形成和穩(wěn)定性[39]。與氨基端不同，LPL羧基端結(jié)構(gòu)域的功能突變很少，這表明該區(qū)域的氨基酸替換具有更好的耐受性。在LPL 382和LPL 447中，單點突變導(dǎo)致一個提前終止密碼子的引入和一個截斷酶的合成[40]。LPL 447[41]對三油酸和三丁酸底物都保持了顯著的活性，而LPL 382是無功能的。這些結(jié)果證明了LPL的氨基端結(jié)構(gòu)域在LPL催化功能中的重要作用，以及LPL的氨基端和羧基端在活性LPL同二聚體的形成和維持中的重要作用。

LPL包含19個酪氨酸和8個色氨酸殘基[42]。除二肽、Glu- Lys (位置423 - 424)和2 Lys (位置416和488)外，大部分胰蛋白酶肽被分離和分析。用氣相色譜儀對LPL的NH2末端進行序列測定，確定其NH2末端為Asp，而COOH末端為Gly，經(jīng)羧肽酶Y斷裂。該酶含有10個半胱氨酸殘基，均存在于二硫鍵中。它們形成于Cys29與Cys42、Cys218與Cys241、Cys266與Cys285、Cys277與Cys280、Cys420與Cys440之間。LPL和其他脂肪酶的區(qū)別在于活性位點Ser134旁的基本殘基，上游5殘基，下游6殘基。

像人類脂肪酶一樣，LPL包含一個由217～238個殘基組成的蓋子，它覆蓋了催化位點，需要重新定位以允許底物進入催化域。對蓋子的二級結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)了2個由7個和11個氨基酸殘基組成的高度兩親性螺旋，這是乳化底物水解所必需的[43]。在其不活躍狀態(tài)下，LPL蓋子是關(guān)閉的，防止LPL經(jīng)二聚物底物進入催化位點[44]。初始LPL的脂蛋白基質(zhì)相互作用,可能由羧基末端域，結(jié)果在一個構(gòu)象變化導(dǎo)致LPL的蓋子和接觸的疏水性或非極性蓋子殘留物,這一過程稱為界面激活[45]。脂肪酶的X射線結(jié)晶學(xué)也證明了類似的機理。正如其所證明的那樣，LPL蓋子的重新定位可能導(dǎo)致大面積的疏水區(qū)域暴露，并形成一個由作為脂肪酶主鏈一部分的氨基酸疏水側(cè)鏈或蓋子的兩親螺旋排列的裂縫。脂肪酸鏈與疏水峽谷結(jié)合，允許甘油三酯底物進入催化位點，最終導(dǎo)致甘油三酯水解。

4 影響內(nèi)源性LPL活性的因素

當(dāng)前研究者對內(nèi)源性LPL活性的影響因素及調(diào)控方式進行了研究，其內(nèi)在影響因素主要包括乳脂肪大小、酪蛋白、物理性質(zhì)(pH值和離子強度等)；外在影響因素主要包括貯藏溫度、耐熱性、底物特異性、脂肪球膜完整性、抑制劑、激活劑、機械處理(均質(zhì)、攪拌等)，這些因素均會影響內(nèi)源性LPL的活性，進而影響牦牛乳的脂解作用和劣變風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。

4.1 內(nèi)在因素

4.1.1 酪蛋白

研究表明，牦牛乳大部分的LPL活性與酪蛋白組分有關(guān)[46]，LPL在乳血清中的穩(wěn)定性不如與酪蛋白膠束結(jié)合的穩(wěn)定性，盡管在超過25 ℃的溫度下，穩(wěn)定性差異不明顯。ANDERSON[47]發(fā)現(xiàn)，乳中的脂肪酶活性(以三丁酸酶活性測定)在2 ℃下更不穩(wěn)定，三丁酸酶是通過加入NaCl從酪蛋白膠束中分離出來的，這表明與膠束的結(jié)合使酶具有一定的穩(wěn)定性。LPL與膠束的解離降低了酶的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致血清LPL穩(wěn)定性較低。血清和酪蛋白LPL之間的穩(wěn)定性差異在較高的溫度下降低了，因為在較高的溫度下，酪蛋白以膠束形式存在的比例會更大[48]。研究表明，乳血清中可能含有影響LPL穩(wěn)定性的因素。解離的LPL在這個因素的存在下可能不太穩(wěn)定。

4.1.2 物理性質(zhì)

溫度和pH能夠有效影響LPL的活性，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度和pH的不斷升高，LPL的活性先升高，達到某一最大點后逐漸下降[49]。其活性在pH 7.0～8.5時最活躍，在強酸強堿條件下易失活。LPL在pH 5.0～7.0酶活性較穩(wěn)定。

4.2 外在因素

4.2.1 貯藏溫度

LPL對溫度敏感，85 ℃殺菌10 s，便會完全失活；在50 ℃時，其活性保持穩(wěn)定，但在pH 6.5處理15 min時，LPL失去活性；在25 ℃放置24 h，一方面會使得LPL失活，另一方面，有研究報道認為純化的LPL在31 ℃會出現(xiàn)氧化的現(xiàn)象[50]。在高溫，短時間巴氏殺菌(72 ℃,15 s)滅活了大部分牛乳中的酶[51]，因此，LPL在巴氏殺菌乳和巴氏殺菌乳衍生產(chǎn)品中引起的脂解作用很小。

4.2.2 底物特異性

底物的特異性對LPL活性有一定的影響。加入人血清可提高脂肪酶活性。牛血清白蛋白也能提高脂肪酶活性[52]，但其最大活性低于人血清。另一方面，雞蛋白蛋白的添加抑制了脂肪酶的活性。高濃度NaCl對LPL活性有強烈的抑制作用[53]，而對脂肪酶活性有增強作用。而在日本黃鼠中，該酶能水解甘油三酯，不需要添加血清。而且有研究表明，該酶對血清輔助因子沒有絕對的需求，而血清輔助因子只是為了達到最大的反應(yīng)速率。LPL活性測定的主要是反應(yīng)混合物中是否存在血清。這說明NaCl作用于酶、血清輔因子和底物之間的相互作用，而不是作用于酶的活性部位。此外，鞘磷脂(sphingomyelin，SM)強烈抑制脂蛋白脂肪酶介導(dǎo)的脂肪分解在單層膜[54]和乳狀顆粒[55]中。研究表明，SM抑制LPL活性是通過增加頭基的堆積和增大乳劑表面單分子層的疏水脂脂相互作用，而不是通過SM和LPL之間的特定相互作用[56]。NO-1886(通用名Ibrolipim)是日本大冢制藥廠開發(fā)的一種新型LPL激活劑。GELDENHUYS等[57]研究了一種具有LPL激活特性的新型小型有機化合物的鑒定該先導(dǎo)化合物名為C10 d，通過體外高通量篩選鑒定，與NO-1886相比，其LPL激活能力是NO-1886的2倍。

4.2.3 脂肪球膜完整性

MFGM是目前最受關(guān)注的功能性乳制品之一。它是由乳腺上皮細胞分泌的一種復(fù)雜的生物膜，能吞噬乳脂，從而使乳脂形成脂肪滴并懸浮在乳基質(zhì)中[58]。MFGM由蛋白質(zhì)、磷脂、脂肪酸和酶組成，它們具有抗感染、抗癌、抗腫瘤等重要的生物學(xué)功能[59]。其作為一種乳化劑，起著保護脂肪球的作用，阻止 LPL 直接進入脂肪球內(nèi)部與甘油三酯結(jié)合而發(fā)生脂解作用，如果乳中 MFGM 完整無損，LPL 的脂解作用會被阻止，只有分布在脂肪中的 LPL 才有機會與脂肪球中的甘油三酯結(jié)合而發(fā)生脂解作用。然而，機械和熱處理會破壞乳脂肪球的固有結(jié)構(gòu)[60]。使MFGM 失去了對脂肪球的保護作用，在這種情況下，脂肪外的LPL 會直接穿過乳脂肪球膜與內(nèi)部的乳脂肪球中的甘油三酯反應(yīng)而使得脂解作用容易發(fā)生。因此MFGM是否完整會影響LPL對牦牛乳的脂解作用。

5 內(nèi)源性LPL對牦牛乳風(fēng)味影響的機制

內(nèi)源性脂蛋白脂肪酶是一種糖蛋白酶，主要水解CM及VLDL中的TG[61]。LPL參與了乳腺中乳脂甘油三酯的合成，它在牛奶中的存在是由于這種乳腺的溢出。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性LPL才是TG水解的關(guān)鍵酶[62]。哺乳動物乳中內(nèi)源性LPL的含量和分布決定了乳中脂肪的脂解作用和程度，且不同乳中內(nèi)源性LPL分布不同。LPL具有位置特異性而非脂肪酸特異性[63]，它催化從甘油三酯分子的sn-1和sn-3位置的脂肪酸水解[64]。脂肪酸在重排后才從2-單甘油酯釋放為1(3)-單甘油酯[65]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)源性LPL的作用下，可將乳脂肪降解產(chǎn)生4～10 C的游離脂肪酸，如丁酸等；同時，光化學(xué)降解硫胺素生成的產(chǎn)物與H2S反應(yīng)生成的芳香族化合物能夠使乳及其制品產(chǎn)生橡膠氣味[66-68]。而且乳脂肪中的TG被LPL水解，產(chǎn)生的中、短鏈游離脂肪酸等揮發(fā)性成分可以轉(zhuǎn)化為其他的風(fēng)味化合物，如酮、酯、醇和醛，這些物質(zhì)能夠直接影響牦牛乳的風(fēng)味。乳脂肪的水解程度和速率取決于LPL的活性[69]。不同乳畜的LPL基因會因發(fā)生突變，而表達成不同的LPL。因此不同乳畜品種會因其內(nèi)源性LPL的一級序列及空間構(gòu)象的較大變化，導(dǎo)致乳中LPL的活性不同[70]；牦牛乳脂肪球粒徑較荷斯坦牛乳大，乳脂肪球膜會更易受到破壞，更易于被內(nèi)源性LPL脂解產(chǎn)生游離脂肪酸[71]；同時外界環(huán)境也會對內(nèi)源性LPL的活性產(chǎn)生重要影響。

通常鮮牦牛乳需經(jīng)過冷藏和長時間運輸，才能用于大規(guī)模乳制品的生產(chǎn)，但是冷鏈運輸以及冷藏會為一些嗜冷菌提供生存環(huán)境，如假單胞菌、芽孢桿菌、微桿菌、乳球菌、不動桿菌、哈夫尼菌等[72]。當(dāng)這些嗜冷菌作用于牦牛乳會使其風(fēng)味更易受到微生物脂肪酶的影響[73]。而且在低溫運輸過程中，乳清中游離的LPL會轉(zhuǎn)移到脂肪上，使脂肪的脂解作用更強。研究發(fā)現(xiàn)，低溫儲存24 h后，未脫脂鮮乳中的LPL活性明顯增加；此外，在冷卻條件下，乳中的LPL吸附到MFGM，并與TG結(jié)合從而降解脂肪產(chǎn)生游離脂肪酸，這些游離脂肪酸進一步氧化生成戊醛、己醛、壬醛、二甲基二硫化物、丙酮、戊酮、甲基酮、2-丙醇等物質(zhì)，進而使牦牛乳產(chǎn)生酸臭和異味等問題。因此，內(nèi)源性LPL是導(dǎo)致牦牛乳產(chǎn)奶后風(fēng)味劣變的重要因素。

6 展望

牦牛乳營養(yǎng)豐富，乳中蛋白質(zhì)、脂肪含量均高于其他牛種。因其特殊的生存環(huán)境導(dǎo)致牦牛乳風(fēng)味與普通牛乳及其他乳存在較大差異，且牦牛乳的特殊風(fēng)味基本全部來源于乳脂肪，而內(nèi)源性LPL可以作用于乳脂肪中的甘油三酯發(fā)生脂解作用產(chǎn)生游離脂肪酸，從而影響牦牛乳的風(fēng)味。但由于牦牛乳內(nèi)源性LPL的含量本身較低，分離純化困難，其酶活性及其對牦牛乳風(fēng)味標(biāo)志物影響的作用機制不明確，國內(nèi)對研究牦牛乳內(nèi)源性 LPL研究不多。所以本文進一步對牦牛乳中LPL的分離純化方法、結(jié)構(gòu)功能、酶活性的影響因素及牦牛乳體系中劣變風(fēng)味物質(zhì)的影響機制進行了綜述，以期為實現(xiàn)牦牛乳風(fēng)味的穩(wěn)態(tài)化調(diào)控提供依據(jù)。